血府逐瘀湯不同劑型數(shù)字化指紋圖譜的構(gòu)建*

楊　龍，楊　帆，楊欣瑩，張　蕾，于卉娟，王躍飛

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，天津300193；2.天津國際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院中藥新藥研發(fā)中心，天津300457；3.天津宏仁堂藥業(yè)有限公司，天津300385）

·中藥研究·

血府逐瘀湯不同劑型數(shù)字化指紋圖譜的構(gòu)建*

楊龍1，2，楊帆1，2，楊欣瑩3，張蕾1，2，于卉娟1，2，王躍飛1，2

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，天津300193；2.天津國際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院中藥新藥研發(fā)中心，天津300457；3.天津宏仁堂藥業(yè)有限公司，天津300385）

［目的］建立一種有效的超高效液相色譜（UPLC）數(shù)字化色譜指紋圖譜，評價(jià)血府逐瘀湯不同劑型的質(zhì)量，為血府逐瘀湯制劑（膠囊、口服液、片劑、軟膠囊、湯劑）質(zhì)量控制提供參考。［方法］采用超高效液相色譜儀，以色譜柱ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），柱溫50℃，體積流量0.3 mL/min，進(jìn)樣量2 μL，檢測波長為280 nm，0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）為流動相進(jìn)行梯度洗脫（0～8 min，3%～8%B；8～24 min，8%～19%B；24～35 min，19%～45%B）。［結(jié)果］構(gòu)建了血府逐瘀湯多種劑型的指紋圖譜。以野漆樹苷為參照峰，共標(biāo)定了30個(gè)共有峰，通過標(biāo)準(zhǔn)品比對確定了血府逐瘀湯不同制劑指紋圖譜中的16個(gè)共有峰。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》（2004A版）評價(jià)了血府逐瘀湯不同制劑指紋圖譜相似度均大于0.81。以血府逐瘀湯不同劑型共有峰的相對峰面積為特征值進(jìn)行主成分分析（PCA），不同劑型樣品聚類在3個(gè)不同的區(qū)域，說明血府逐瘀湯不同劑型的質(zhì)量存在明顯差異。［結(jié)論］該方法構(gòu)建的指紋圖譜簡便易行，為血府逐瘀湯不同劑型的質(zhì)量控制研究提供依據(jù)。

血府逐瘀湯；數(shù)字化指紋圖譜；主成分分析

血府逐瘀湯源自清代醫(yī)學(xué)家王清任的《醫(yī)林改錯》，由當(dāng)歸、生地、桃仁、枳殼、牛膝、赤芍、柴胡、甘草、川芎、桔梗、紅花11味藥組成［1］，是桃紅四物湯、四逆散（熟地黃換成生地，白芍換成赤芍）加桔梗、牛膝的變通方［2］，具有活血化瘀，行氣止痛功效［3］，廣泛用于治療內(nèi)外婦兒各科疑難病證屬血瘀氣滯證者，多用于心血管疾病包括冠心病［4］、心絞痛［5］等的治療。血府逐瘀湯作為經(jīng)典名方，臨床療效確切，基于血府逐瘀湯研究開發(fā)了多個(gè)現(xiàn)代制劑，包括血府逐瘀片、口服液、膠囊、軟膠囊等多種劑型。血府逐瘀湯［6-8］中含有機(jī)酸（沒食子酸等）、黃酮（羥基紅花黃色素A、柚皮苷等）、皂苷（甘草酸等）、環(huán)烯醚萜類（芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷等）和其他成分，化學(xué)物質(zhì)群復(fù)雜，給血府逐瘀湯不同制劑的質(zhì)量控制帶來挑戰(zhàn)。

目前研究建立的質(zhì)量控制方法多以單一成分作為檢測指標(biāo)，不能全面真實(shí)的反映血府逐瘀湯的內(nèi)在質(zhì)量。指紋圖譜是一種國內(nèi)外公認(rèn)的綜合的、可量化的鑒別手段［9-11］，能夠有效地體現(xiàn)中藥成分的整體性，更好地評價(jià)中藥的質(zhì)量［12-13］。血府逐瘀湯已被開發(fā)成多個(gè)劑型，目前血府逐瘀湯的指紋圖譜研究多限于單個(gè)制劑，未闡明指紋峰的化學(xué)結(jié)構(gòu)。本課題組對血府逐瘀湯多種劑型開展了深入研究，采用超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜（UPLC-ESI-MS/MS）對血府逐瘀湯及其多種劑型的化學(xué)成分進(jìn)行了定量分析，采用超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-DAD/ESIQ-TOF MS）對血府逐瘀湯的化學(xué)成分進(jìn)行定性分析，檢測并鑒定了103個(gè)化學(xué)成分［14-15］。在此基礎(chǔ)上，本研究開展了血府逐瘀湯不同劑型的指紋圖譜研究。

本研究建立的指紋圖譜分析方法時(shí)間僅為35 min，以野漆樹苷為參照峰，建立了5個(gè)不同劑型的UPLC指紋圖譜，共標(biāo)定了30個(gè)共有峰。采用標(biāo)準(zhǔn)品比對的方法鑒定了綠原酸、羥基紅花黃色素A、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、甘草苷、柚皮苷、野漆樹苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素等16個(gè)共有峰。該方法具有全面、快速、可靠的優(yōu)點(diǎn)，通過該方法可獲得全面的指紋圖譜信息，為血府逐瘀湯不同劑型質(zhì)量控制研究提供依據(jù)。

1　材料

1.1儀器ACQUITY超高效液相色譜儀（美國Waters公司，包括Waters ACQUITY二元泵，DAD檢測器，自動進(jìn)樣器，在線脫氣機(jī)，柱溫箱，Empower色譜工作站）；超純水儀（Milli-Q，美國Millipore公司）；Vortex-5渦旋振蕩器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；J25低溫高速離心機(jī)（美國ThermoForma公司）；十萬分之一天平（METTLER TOLEDO XS205，瑞士METTLER公司）；萬分之一天平（METTLER TOLEDO AL204，瑞士METTLER公司）；SCIENTZ SB 25-12DTN超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；JSP-200粉粹機(jī)（浙江永康金穗機(jī)械制造廠）。

1.2藥品與試劑樣品：血府逐瘀膠囊：TJHRT，批號：E03051、E03052、E03053、E03054、E03055、E03056、E03057、E03058、E03059、E03060、E03061、E03062、E03063。

血府逐瘀片：SXHT，批號：140903、150301；WFZS，批號：141111、150102；CQXEA，批號為 140414、140416、141204、150101、150102、150103、150104、150105、150106、150201。

血府逐瘀口服液：JLADYB，批號：1407001、1407024、1408010、1408011、1408017、1412028、1412030、1501013、1501014；SDHJT，批號：1312001、1403007。

血府逐瘀軟膠囊：JLHNSH，批號：20140302、20140701、20140903、20141102、20150102、20150206、20150301、20150304、20150401、20150402。

血府逐瘀湯：實(shí)驗(yàn)室自制。

標(biāo)準(zhǔn)品：芍藥苷（RS0453）、野漆樹苷（THB-TS40S）、芍藥內(nèi)酯苷（RS0042）、柚皮素（THB-2S340）、竹節(jié)參皂苷IVa（THB-1S375）購自于天津拓海生物科技有限公司；柚皮苷（110722-200610）、沒食子酸（110831-200803）、甘草苷（111610-201106）、甘草酸（110731-201317）購自中國食品藥品檢定研究院；綠原酸（WOZ-4-2）、蛻皮甾醇、甘草素、橙皮苷、新橙皮苷、山奈酚（純度均≥98%）購自天津中新藥業(yè)研究中心；羥基紅花黃色素A（Q-008-14073）購自成都瑞芬思生物科技有限公司。

乙腈（Sigma-Aldrich公司，色譜純），甲酸（天津市大茂化學(xué)試劑廠，分析純），水為超純水，其余試劑均為分析純。

2　方法

2.1溶液的配制

2.1.1對照品溶液的制備取芍藥苷、野漆樹苷、芍藥內(nèi)酯苷、柚皮素、甘草素、竹節(jié)參皂苷IVa、柚皮苷、沒食子酸、甘草苷、甘草酸、綠原酸、蛻皮甾醇、橙皮苷、新橙皮苷、山奈酚、羥基紅花黃色素A對照品適量，精密稱定，分別加入50%甲醇水溶液，即得到濃度分別為：芍藥苷（0.93 g/L）、野漆樹苷（1.52 g/L）、芍藥內(nèi)酯苷（1.53 g/L）、柚皮素（1.09 g/L）、甘草素（1.12 g/L）、竹節(jié)參皂苷IVa（1.27 g/L）、柚皮苷（0.92 g/L）、沒食子酸（1.17 g/L）、甘草苷（1.02 g/L）、甘草酸（0.98 g/L）、綠原酸（1.37 g/L）、蛻皮甾醇（1.18 g/L）、橙皮苷（0.87 g/L）、新橙皮苷（0.61 g/L）、山奈酚（0.69 g/L）、羥基紅花黃色素A（1.27 g/L）的對照品儲備液。取各對照品儲備液100 μL，置于2 mL棕色量瓶中，加入50%甲醇水溶液定容至刻度，搖勻，制成濃度分別為：芍藥苷（0.047 g/L）、野漆樹苷（0.076 g/L）、芍藥內(nèi)酯苷（0.077 g/L）、柚皮素（0.055 g/L）、甘草素（0.056 g/L）、竹節(jié)參皂苷IVa （0.064 g/L）、柚皮苷（0.046 g/L）、沒食子酸（0.059 g/L）、甘草苷（0.051 g/L）、甘草酸（0.049 g/L）、綠原酸（0.069 g/L）、蛻皮甾醇（0.059 g/L）、橙皮苷（0.044 g/L）、新橙皮苷（0.031 g/L）、山奈酚（0.035 g/L）、羥基紅花黃色素A（0.064 g/L）的混合對照品溶液。

2.1.2供試品溶液的制備血府逐瘀膠囊和軟膠囊的內(nèi)容物、片劑、湯劑粉末適量，研細(xì)，分別取上述樣品0.5 g，精密稱定，置于25 mL棕色量瓶中，加入50%甲醇水溶液適量，超聲20 min，取出，放涼，加入50%甲醇水溶液定容至刻度，搖勻，置1.5 mL EP管中14 000 r/min離心10 min，取上清液，即可。

精密量取血府逐瘀口服液1 mL，置于25 mL棕色量瓶中，加入50%甲醇水溶液定容至刻度，搖勻，置1.5 mL EP管中14 000 r/min離心10 min，取上清液，即可。

2.2UPLC色譜條件色譜柱ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；以0.1%甲酸水溶液為流動相A，乙腈為流動相B，進(jìn)行梯度洗脫：0～8min，3%～8%B；8～24 min，8%～19%B；24～35 min，19%～45% B。檢測波長：280 nm，柱溫：50℃，流速：0.3 mL/min，進(jìn)樣2 μL，記錄35 min色譜圖。

3　方法學(xué)考察

3.1精密度實(shí)驗(yàn)取血府逐瘀湯粉末，按照“2.1.2項(xiàng)”下方法制備供試品溶液，按照“2.2項(xiàng)”下色譜條件進(jìn)樣，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，以21號峰野漆樹苷為參照峰，計(jì)算各個(gè)峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積。結(jié)果表明，峰面積占總峰面積大于3%的色譜峰的相對峰面積和各共有峰的相對保留時(shí)間基本一致（RSD＜1.68%），表明儀器精密度良好。

3.2重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)取血府逐瘀湯粉末，按照“2.1.2項(xiàng)”下方法制備供試品溶液6份，按照“2.2項(xiàng)”下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，以21號峰野漆樹苷為參照峰，計(jì)算各個(gè)峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積。結(jié)果表明，峰面積占總峰面積大于3%的色譜峰的相對峰面積和各共有峰的相對保留時(shí)間基本一致（RSD＜1.49%），表明該方法重現(xiàn)性良好。

3.3穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取血府逐瘀湯粉末，按照“2.1.2項(xiàng)”下方法制備供試品溶液，按照“2.2項(xiàng)”下色譜條件進(jìn)樣，在4℃條件下分別于0、2、4、6、8、10 h進(jìn)行測定，記錄色譜圖，以21號峰野漆樹苷為參照峰，計(jì)算各個(gè)峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積。結(jié)果表明，峰面積占總峰面積大于3%的色譜峰的相對峰面積和各共有峰的相對保留時(shí)間基本一致（RSD＜2.88%），表明血府逐瘀湯在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.4延遲測試取血府逐瘀湯粉末，按照“2.1.2項(xiàng)”下方法制備供試品溶液，按照“2.2項(xiàng)”下色譜條件進(jìn)樣，測定，延長測試時(shí)間至1 h，觀察有無滯后峰出現(xiàn)。結(jié)果表明：無滯后峰出現(xiàn)，結(jié)果見圖1。

圖1　280 nm下血府逐瘀湯指紋圖譜延遲測試色譜圖Fig.1　The chromatogram of time-delay analysis of fingerprint of Xuefu Zhuyu decoction at 280 nm

4　血府逐瘀UPLC指紋圖譜的建立

4.1血府逐瘀湯不同劑型共有峰相對保留時(shí)間及相對峰面積的分析將血府逐瘀膠囊和軟膠囊內(nèi)容物、片劑、湯劑、口服液按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣2 μL，注入超高效液相色譜儀，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測定血府逐瘀湯不同劑型的指紋圖譜，如圖2～3所示，記錄各個(gè)共有峰的保留時(shí)間及峰面積，以野漆樹苷為參照峰，計(jì)算各個(gè)共有峰的相對保留時(shí)間及相對峰面積，共標(biāo)定共有峰30個(gè)，通過標(biāo)準(zhǔn)品比對，鑒定了16個(gè)共有峰，結(jié)果見表1。

圖2　280 nm下血府逐瘀湯標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜（A）和混合對照品溶液的色譜圖（B）Fig.2　Representative fingerprint chromatogram of Xuefu Zhuyu decoction（A）and mixed standards solution（B）at 280 nm

圖3　280 nm下血府逐瘀膠囊（A）、口服液（B）、片劑（C）、軟膠囊（D）、湯劑（E）指紋圖譜Fig.3　Fingerprint of multiple dosage forms of Xuefu Zhuyu decoction at 280 nm，A：capsule；B：oral liquid；C：tablet；D：soft capsule；E：decoction

表1　280 nm下血府逐瘀湯不同劑型指紋圖譜共有峰的相對保留時(shí)間及相對峰面積（峰面積占總峰面積＞3%）結(jié)果Tab.1　Relative retention time and relative peak area（peak area accounting for more than 3%in total peak area）of multiple dosage forms of Xuefu Zhuyu decoction at 280 nm

4.2相似度評價(jià)與分析將不同批次血府逐瘀制劑的色譜圖導(dǎo)入國家藥典委員會開發(fā)的中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2004 A版），對不同批次血府逐逐瘀制劑的UPLC指紋圖譜進(jìn)行相似度評價(jià)與分析，進(jìn)而評價(jià)血府逐瘀不同劑型的質(zhì)量。

按劑型分類，通過對不同批次血府逐瘀制劑色譜圖進(jìn)行譜峰差異性和整體相似性評價(jià)的結(jié)果可以看出，血府逐瘀膠囊相似度均大于0.81，血府逐瘀片相似度均大于0.90，血府逐瘀口服液相似度均大于0.89，血府逐瘀軟膠囊相似度均大于0.89，說明血府逐瘀制劑工藝和質(zhì)量相對穩(wěn)定。

4.3血府逐瘀湯不同制劑指紋圖譜的PCA分析將血府逐瘀湯不同制劑的指紋圖譜數(shù)據(jù)分別導(dǎo)入EZinfo軟件，以相對峰面積為特征值進(jìn)行PCA分析。如圖4所示，5種血府逐瘀湯制劑聚類在3個(gè)不同的區(qū)域，膠囊、片劑、湯劑在一個(gè)區(qū)域，口服液和軟膠囊各在一個(gè)區(qū)域，表明血府逐瘀湯不同制劑存在明顯差異。從樣本分布的疏密程度分析：膠囊、片劑、湯劑在空間分布相對集中，而口服液、軟膠囊在空間分布相對分散，表明膠囊、片劑的質(zhì)量均一性較好。

圖4　血府逐瘀湯不同劑型指紋圖譜的PCA結(jié)果Fig.4　Principal components analysis for fingerprint of multiple dosage forms of Xuefu Zhuyu decoction

5　討論

5.1血府逐瘀湯不同劑型數(shù)字化指紋圖譜的構(gòu)建針對于目前對血府逐瘀湯多劑型質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一的情況，本研究建立了基于UPLC-DAD技術(shù)一種快速、準(zhǔn)確的血府逐瘀湯的UPLC指紋圖譜分析方法，并應(yīng)用于血府逐瘀湯及其制劑（膠囊、口服液、片劑、軟膠囊）的質(zhì)量評價(jià)。鑒定了血府逐瘀湯指紋圖譜中的16個(gè)共有指紋峰，分別是沒食子酸、綠原酸、羥基紅花黃色素A、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、甘草苷、蛻皮甾醇、柚皮苷、野漆樹苷、橙皮苷、甘草素、新橙皮苷、柚皮素、山奈酚、竹節(jié)參皂苷IVa、甘草酸。血府逐瘀湯及其制劑指紋圖譜的建立，進(jìn)一步闡明了血府逐瘀湯的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)，為血府逐瘀湯的質(zhì)量控制奠定了基礎(chǔ)。

5.2血府逐瘀湯不同制劑指紋圖譜差異分析血府逐瘀湯不同制劑指紋圖譜存在明顯差異，產(chǎn)生差異的原因可能與不同劑型的生產(chǎn)工藝有關(guān)：血府逐瘀片及膠囊［16］均是取炒桃仁半量、當(dāng)歸、赤芍、麩炒枳殼、川芎、柴胡粉碎成細(xì)粉，其余紅花等五味及剩余炒桃仁的水煎液濃縮為稠膏，細(xì)粉與稠膏混合制成；血府逐瘀湯是采用全部藥材提取后入藥方式制成；血府逐瘀口服液［17］是柴胡、當(dāng)歸、麩炒枳殼、川芎先蒸餾提取芳香水，藥渣和其余七味藥經(jīng)水提醇沉處理后經(jīng)一系列制藥工藝制成；軟膠囊采用復(fù)方中全部藥材經(jīng)提取后提取物制成。

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（本文編輯：高杉，張震之）

The establishment of UPLC-Digitized fingerprinting of multiple dosage forms of Xuefu Zhuyu decoction

YANG Long1，2，YANG Fan1，2，YANG Xin-ying3，ZHANG Lei1，2，YU Hui-juan1，2，WANG Yue-fei1，2
（1.Tianjin Modern Chinese Medicine Key Laboratory-Province and Ministry Co-established State Key Laboratory Cultivation Base，Institute of Traditional Chinese Medicine，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；2.Research and Development Center of Traditional Chinese Medicine，Tianjin International Joint Academy of Biotechnology and Medicine，Tianjin 300457，China；3.Tianjin Hongrentang Pharmaceutical Co.，Ltd.，Tianjin 300385，China）

［Objective］To establish a sensitive and specific UPLC-digitized fingerprinting of multiple dosage forms of Xuefu Zhuyu decoction（capsule，oral liquid，tablet，soft capsule and Decoction）with UPLC-DAD technology.［Methods］The UPLC method was established by employing an ACQUITY UPLC?BEH C18（2.1×100 mm，1.7 μm）with 0.1%formic acid aqueous solution（A）-acetonitrile （B）as mobile phase in a gradient elution（0～8 min，3%～8%B；8～24 min，8%～19%B；24～35 min，19%～45%B）.The detection wavelength was 280 nm.The flow rate was 0.3 mL/min and the column temperature was 50°C.［Results］The established method was employed to develop UPLC-digitized fingerprinting（UPLC-DFP）of multiple dosage forms of Xuefu Zhuyu decoction.By choosing rhoifolin as reference，30 common peaks were obtained.16 of 30 common peaks of Xuefu Zhuyu decoction were identified by comparing with standards.The similarity of the multiple dosage forms of Xuefu Zhuyu decoction is over 0.81，which was evaluated by Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of TCM（Version 2004A）.The relative peak area of common peaks as characteristic value was implemented to perform principal component analysis（PCA）.The multiple dosage forms of Xuefu Zhuyu decoction were classified as three clusters based on different quality.［Conclusion］This method was simple，and provided the basis for the quality control of multiple dosage forms of Xuefu Zhuyu decoction.

Xuefu Zhuyu decoction；UPLC-digitized fingerprinting；principal component analysis

R284.1

A

1672-1519（2016）09-0559-06

10.11656/j.issn.1672-1519.2016.09.13

2016-03-30）

國家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（81202877）。作者簡介：楊龍（1988-），男，碩士研究生，主要研究方向?yàn)樗幬锘瘜W(xué)。

王躍飛，E-mail:wangyuefei_2006@hotmail.com。