熄風(fēng)靜寧顆粒對(duì)Tourette綜合征模型大鼠行為活動(dòng)及腦紋狀體多巴胺遞質(zhì)的影響*

李　燕王新征康珈寧孫　婷王俊宏△

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京100700；2.北京市朝陽(yáng)區(qū)常營(yíng)社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，北京100024；3.河南省南陽(yáng)市中醫(yī)院，河南　南陽(yáng)473000）

熄風(fēng)靜寧顆粒對(duì)Tourette綜合征模型大鼠行為活動(dòng)及腦紋狀體多巴胺遞質(zhì)的影響*

李燕1王新征2康珈寧3孫婷1王俊宏1△

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京100700；2.北京市朝陽(yáng)區(qū)常營(yíng)社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，北京100024；3.河南省南陽(yáng)市中醫(yī)院，河南南陽(yáng)473000）

目的觀察熄風(fēng)靜寧顆粒對(duì)Tourette綜合征（TS）模型大鼠行為活動(dòng)，及腦紋狀體多巴胺（DA）、血清高香草酸（HVA）含量的影響。方法Wistar雄性大鼠42只隨機(jī)分為正常組、模型組、氟哌啶醇組、熄風(fēng)靜寧顆粒低劑量組［1.2 g/（kg·d）］、熄風(fēng)靜寧顆粒中劑量組［2.4 g/（kg·d）］、熄風(fēng)靜寧顆粒高劑量組［4.8 g/（kg·d）］，每組7只，采用亞氨基二丙腈（IDPN）腹腔注射建立TS大鼠模型，造模后，正常組和模型組給予蒸餾水灌胃，其余4組分別予相應(yīng)藥物灌胃，連續(xù)給藥6周后，觀察比較各組大鼠的行為活動(dòng)，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)小鼠紋狀體內(nèi)DA、血清HVA含量。結(jié)果熄風(fēng)靜寧顆粒中、高劑量組及氟哌啶醇組可以減輕TS模型大鼠抽動(dòng)行為，與模型組比較均存在明顯差異。模型組大鼠腦紋狀DA含量明顯低于正常組（P＜0.05）。熄風(fēng)靜寧顆粒中、高劑量組能增加大鼠腦紋狀體DA含量，與模型組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；熄風(fēng)靜寧顆粒高劑量組大鼠血清HVA含量較低劑量組偏高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論熄風(fēng)靜寧顆?？梢越档椭袠猩窠?jīng)興奮性，其治療作用可能是通過調(diào)節(jié)突觸后多巴胺受體敏感性或其他的藥物作用靶位實(shí)現(xiàn)。

熄風(fēng)靜寧顆粒Tourette綜合征多巴胺高香草酸

【A bstract】Objective：To observe effects of Xifeng Jingning Decoction on the behavior，content of striatum dopamine（DA），and homovanillic acid（HVA）in ratsmodel of Tourette syndrome.M ethods：Male Wistar rats（n =42）were random ly divided into the blank group，themodel group，the haloperidol group，low-dose［1.2 g/（kg· d）］of Xifeng Jingning Decoction group，middle-dose［（2.4 g/（kg·d）］of Xifeng Jingning Decoction group，and high-dose［（4.8 g/（kg·d）］of Xifeng Jingning Decoction group（each n=7）.The Tourette syndromemodel was established in rats by intraperitoneal injection of iminodipropionitrile（IDPN）.Aftermodeling，the blank group and themodel group were given normal saline solution intragastrically and other groups were given relevantmedicines for 6 weeks.The behaviorwas compared in all groups，and the content of striatum DA and HVA were detected by using enzymelinked immunosorbent assay（ELISA）.Results：Middle-dose group and high-dose group of Xifeng Jingning Decoction，and haloperidol group lessened the stereotyped behavior in ratsmodel of Tourette syndrome with a significance difference，compared with themodel group.The content of DA decreased inmodel group compared with that in blank group（P＜0.05）.Compared with themodel group，there were differences in the contentof striatum DA inmiddle-dose and high-dose of Xifeng Jingning Decoction groups（P＜0.05）.The content of HVA increased in high-dose of Xifeng Jingning Decoction group，compared with that in low-dose of Xifeng Jingning Decoction，with a significance difference（P＜0.05）.Conclution：Xifeng Jingning Decoction can reduce the excitability of central nerve.The therapeutic effect of Xifeng Jingning Decoction may be implemented regulating the sensitivity of postsynaptic dopamine receptors or other drug targets.

【Key words】Xifeng Jingning Decoction；Tourette syndrome；Dopamine；Homovanillic acid

Tourette綜合征（TS）又稱多發(fā)性抽動(dòng)癥，或抽動(dòng)-穢語(yǔ)綜合征，是一種復(fù)雜的神經(jīng)精神障礙性疾病，以多種不自主運(yùn)動(dòng)性抽動(dòng)為主要表現(xiàn)，可伴有發(fā)聲抽動(dòng)［1］。發(fā)作期急性癥狀嚴(yán)重者可影響患兒的學(xué)習(xí)及生活。TS病因及發(fā)病機(jī)制目前尚不十分清楚，而多巴胺系統(tǒng)功能異常被廣泛認(rèn)為本病發(fā)病的主要病理學(xué)基礎(chǔ)［2］。熄風(fēng)靜寧顆粒是我國(guó)著名中醫(yī)兒科專家劉弼臣教授的經(jīng)驗(yàn)方，臨床證實(shí)療效顯著，而且無明顯副作用［3-4］。但其作用靶點(diǎn)尚不明確，為進(jìn)一步探求熄風(fēng)靜寧顆粒治療該病的作用機(jī)制，筆者進(jìn)行了如下研究。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Wistar大鼠42只，清潔級(jí)，雄性，4周齡，體質(zhì)量80～100 g。購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2007-0001。分籠喂養(yǎng)，自由攝食飲水，溫度（22±2）℃，濕度50%～70%，通風(fēng)。

1.2試藥和儀器氟哌定喘片（2 mg/片，寧波大紅鷹藥業(yè)股份有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H33020585，生產(chǎn)批號(hào)131003）；熄風(fēng)靜寧顆粒（組成：辛夷花10 g，蒼耳子3 g，元參10 g，板藍(lán)根10 g，木瓜10 g，清半夏10 g，伸筋草20 g，鉤藤15 g，菊花15 g，白芍15 g，全蝎3 g，珍珠母30 g，酸棗仁30 g，炙甘草10 g，由北京康仁堂藥業(yè)有限公司制備）。亞氨基二丙腈（IDPN）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；ELISA試劑盒，多巴胺（DA，批號(hào)20150309），高香草酸（HVA，批號(hào)20150309），均購(gòu)自上海藍(lán)基生物科技有限公司。全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀（MULTISKAN MK3，Thermo，USA）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（DH4000A，天津泰斯特）；MINI shaker，MH-1（kylin-Bell Lab Instruments QILINBEIER）。

1.3分組與造模適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，42只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字法分為正常組、模型組、氟哌啶醇組、熄風(fēng)靜寧顆粒低、中、高劑量組，每組7只。除正常組外，其余5組小鼠腹腔注射IDPN 150 mg/（kg·d），正常組腹腔注射等體積0.9%氯化鈉溶液，每日1次，連續(xù)7 d。造模7 d后，觀察模型鼠的行為活動(dòng)。包括：嗅、咬、舔（不包含理毛）、迅速移位、挖洞、急速跳躍等。由熟練掌握大鼠刻板行為并能準(zhǔn)確評(píng)分但不熟悉組別的實(shí)驗(yàn)人員每天觀察動(dòng)物行為并評(píng)分。評(píng)分≥1分可判定造模成功。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參考Napier等報(bào)道［5］。

1.4干預(yù)措施造模7 d后，正常組與模型組灌胃蒸餾水10mL/（kg·d）。熄風(fēng)靜寧顆粒低、中、高劑量組灌胃熄風(fēng)靜寧顆粒1.2、2.4、4.8 g/（kg·d）（熄風(fēng)靜寧顆粒配成混懸液，低、中、高劑量各組質(zhì)量濃度分別為1 mL含0.12 g、0.24 g、0.48 g中藥顆粒），氟哌啶醇組灌胃氟哌啶醇0.5 mg/（kg·d）（氟哌定喘片配成混懸液，質(zhì)量濃度為1mL含0.05mg藥物），每日1次，各組均連續(xù)灌胃6周。

1.5標(biāo)本采集與檢測(cè)1）動(dòng)物行為評(píng)分：各組給藥后3周、6周均由實(shí)驗(yàn)人員對(duì)動(dòng)物行為進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參考Napier等報(bào)道［5］。2）血清HVA、紋狀體DA的含量測(cè)定：血液標(biāo)本采集在末次給藥24 h后，腹主動(dòng)脈取血5mL，2000 r/min離心10min，分離血清，-20℃保存待檢測(cè)。紋狀體標(biāo)本采集在末次給藥24 h后，斷頭取腦，冰上迅速剝離紋狀體，電子天平稱質(zhì)量，于冰水中充分勻漿，低溫離心機(jī)4℃，3000 r/min離心10min，吸取上清液，-20℃保存待檢測(cè)。使用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA法）分別測(cè)定血清HVA、紋狀體DA的含量。嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS18.0軟件包，計(jì)量資料以（表示。組間比較采用單因素方差分析，方差齊以LSD檢驗(yàn)；方差不齊以Games-Howell檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)意義。

2　結(jié)　果

2.1各組TS模型大鼠行為活動(dòng)評(píng)分比較見表1。給藥3周后氟哌啶醇組大鼠刻板行為活動(dòng)評(píng)分，與模型組比較存在明顯差異（P＜0.05）；給藥6周后大鼠行為活動(dòng)評(píng)分，氟哌啶醇組、熄風(fēng)靜寧顆粒中劑量組與模型組比較存在差異（P＜0.05），熄風(fēng)靜寧顆粒高劑量組與模型組比較存在顯著差異（P＜0.01）。

表1　各組TS模型大鼠行為活動(dòng)評(píng)分比較（分，

表1　各組TS模型大鼠行為活動(dòng)評(píng)分比較（分，

與氟哌啶醇組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別n給藥6周后模型組7 3.00±0.58氟哌啶醇組7 2.29±0.76△熄風(fēng)靜寧顆粒低劑量組7 2.43±0.54造模后　給藥3周后3.29±0.76 3.14±0.69 3.57±0.54 2.86±0.89 3.43±0.54 3.29±0.49熄風(fēng)靜寧顆粒中劑量組7 2.29±0.49△3.86±0.38 3.43±0.54熄風(fēng)靜寧顆粒高劑量組7 3.71±0.49 3.57±0.54*2.14±0.38△△

2.2各組TS模型大鼠腦紋狀體DA含量比較見表2。與正常組比較，模型組大鼠腦紋狀DA含量低于正常組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；熄風(fēng)靜寧顆粒中、高劑量組大鼠腦紋狀體DA含量與模型組比較，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），氟哌啶醇組和熄風(fēng)靜寧顆粒各組比較無明顯差異（P＞0.05）。

表2　各組TS模型大鼠腦紋狀體DA、血清HVA含量比較（ng/mL，

表2　各組TS模型大鼠腦紋狀體DA、血清HVA含量比較（ng/mL，

與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與熄風(fēng)靜寧顆粒低劑量組比較，▲P＜0.05。

組別n 紋狀體DA血清HVA正常組7 19.93±7.04 28.01±8.20模型組7 12.01±3.01*26.49±8.64氟哌啶醇組7熄風(fēng)靜寧顆粒低劑量組7 18.07±7.88 27.67±7.80 13.96±4.63 25.40±11.13熄風(fēng)靜寧顆粒中劑量組7 19.95±7.35△30.15±12.94熄風(fēng)靜寧顆粒高劑量組7 18.66±4.45△36.35±8.64▲

2.3各組TS模型大鼠血清HVA含量比較見表2。熄風(fēng)靜寧顆粒高劑量組大鼠血清HVA與低劑量組比較存在明顯差異（P＜0.05）。

3　討　論

TS發(fā)現(xiàn)至今已有200多年的歷史，其病因及發(fā)病機(jī)制目前尚不十分清楚，但普遍認(rèn)為其發(fā)病與遺傳因素、中樞神經(jīng)遞質(zhì)失衡、神經(jīng)生化異常和精神因素等諸多方面有關(guān)［6］。但TS患者紋狀體內(nèi)多巴胺神經(jīng)過度支配或突觸后受體超敏感是目前公認(rèn)的TS發(fā)病的神經(jīng)生物化學(xué)因素［7］。HVA是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中DA的主要代謝產(chǎn)物，通常被作為判斷腦內(nèi)DA含量的主要指標(biāo)［8-9］。IDPN是一種中樞神經(jīng)毒素，抽動(dòng)的造模機(jī)制主要是通過破壞了錐體外系的DA系統(tǒng)，產(chǎn)生持久的降低DA濃度的效應(yīng)，使動(dòng)物在生長(zhǎng)發(fā)育過程中出現(xiàn)DA受體超敏現(xiàn)象，導(dǎo)致刻板行為出現(xiàn)［10］。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用IDPN成功地誘導(dǎo)出大鼠鼻嗅、仰頭、擺頭等類似TS癥狀行為。在對(duì)TS模型大鼠腦紋狀體DA含量的影響測(cè)定中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示模型組大鼠腦紋狀體DA的含量較正常組下降，這與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道基本一致［10-12］，推測(cè)原因可能是模型組小鼠腦組織存在多巴胺受體超敏感，通過負(fù)反饋機(jī)制抑制突觸前多巴胺釋放，提示了IDPN誘導(dǎo)的大鼠抽動(dòng)行為可能與突觸間隙DA含量增加無關(guān)，而是由于多巴胺受體敏感性增強(qiáng)，導(dǎo)致多巴胺系統(tǒng)功能亢進(jìn)造成。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示中藥顆?？梢燥@著減輕TS模型的抽動(dòng)癥狀，同時(shí)在對(duì)TS模型大鼠腦紋狀體DA含量和血清HVA含量影響的實(shí)驗(yàn)中，結(jié)果顯示熄風(fēng)靜寧顆粒中、高劑量能增加TS模型大鼠腦紋狀體DA含量，及TS模型大鼠中藥高劑量組較低劑量組血清HVA的含量有增多的趨勢(shì)。這些結(jié)果結(jié)合IDPN致使多巴胺受體敏感性增強(qiáng)引起抽動(dòng)的造模機(jī)制，提示熄風(fēng)靜寧顆粒藥物干預(yù)作用可能是通過調(diào)節(jié)突觸后多巴胺受體敏感性或其他的藥物作用靶位實(shí)現(xiàn)的。導(dǎo)致中藥顆粒能增加IDPN誘導(dǎo)的TS模型大鼠腦紋狀體DA含量，和組間比較血清HVA的含量有增多趨勢(shì)這一結(jié)果的原因，推測(cè)可能是由于突觸后超敏的DA受體被阻斷或藥物的作用靶位被調(diào)節(jié)，啟動(dòng)反饋機(jī)制，使得觸前神經(jīng)元釋放更多的DA，從而也增加相應(yīng)的代謝產(chǎn)物。

TS根據(jù)其眨眼、擠眉、皺鼻、搖頭等臨床表現(xiàn)特點(diǎn)，現(xiàn)代醫(yī)家常將本病歸于“瘛癜”“慢驚風(fēng)”“抽搐”肝風(fēng)證“等范疇，治療多從肝、風(fēng)入手［13-15］。然而我國(guó)著名中醫(yī)兒科專家劉弼臣教授獨(dú)辟蹊徑，從肺論治本病，成為TS中醫(yī)藥治療的一面旗幟。從肺論治TS，在改善TS主要的病理因素風(fēng)、痰、氣方面具有重要的意義。熄風(fēng)靜寧顆粒即是從肺調(diào)肝治療TS的代表方，臨床中在改善抽動(dòng)癥狀、控制病情發(fā)展、副作用少等方面有著顯著的優(yōu)勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在給藥3周后，氟哌啶醇組TS模型大鼠行為活動(dòng)的改善優(yōu)于熄風(fēng)靜寧顆粒高劑量組，提示氟哌啶醇在改善TS癥狀時(shí)間上較熄風(fēng)靜寧顆粒起效時(shí)間早。但最終西藥氟哌啶醇及熄風(fēng)靜寧顆粒均可改善IDPN所致TS模型大鼠的刻板運(yùn)動(dòng)及興奮性活動(dòng)，提示了熄風(fēng)靜寧顆粒具有氟哌啶醇類似的作用，能夠降低模型大鼠中樞興奮性，改善異?；钴S的抽動(dòng)行為，這一結(jié)果也佐證了熄風(fēng)靜寧顆粒臨床療效的顯著性。氟哌啶醇常作為治療TS的第一選擇，但是長(zhǎng)期應(yīng)用后的副作用，甚至還出現(xiàn)抑郁癥狀，讓治療難以持久，而中藥熄風(fēng)靜寧顆粒臨床副作用少，療效確切的優(yōu)勢(shì)，更體現(xiàn)了它的臨床價(jià)值。

熄風(fēng)靜寧顆粒方中辛夷花、蒼耳子宣肺通竅；玄參、板藍(lán)根清熱解毒利咽喉，祛邪護(hù)肺，防止外風(fēng)引動(dòng)內(nèi)風(fēng)；天麻、鉤藤、白芍、全蝎平肝熄風(fēng)；伸筋草，歸肝脾腎諸經(jīng)，有祛風(fēng)、舒筋活血之功；木瓜，入肺、脾、肝諸經(jīng)，理脾舒筋；甘草調(diào)和諸藥。綜觀全方，調(diào)肺巧配平肝，相得益彰［16］，療效顯著。

綜上所述，本研究顯示熄風(fēng)靜寧顆?？梢愿纳浦袠猩窠?jīng)興奮性，抑制TS模型大鼠的異常行為活動(dòng)，其作用機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)突觸后多巴胺受體敏感性或其他的藥物作用靶位實(shí)現(xiàn)的，但這一結(jié)論在本實(shí)驗(yàn)中沒有獲得直接實(shí)驗(yàn)依據(jù)的支持，需要以后更進(jìn)一步的研究證實(shí)。

［1］Swedo SE，Leonard HL，Garvey MA，et al.Pediatric autoimmune neuro psychiatric disorders associated with streptococcal infections；clinicaldescription of the first50 cases［J］.Am JPsychiatry，1998，155（2）：264-271.

［2］Wong DF，Bras JR，Singer HS.Mechanisms of dopaminergic and serotonergic neurotransmission in tourette syndrome：Clues from an In ViVo neurochem istry study with PET［J］．Neuropsychopharmacology，2008，33：1239-1251．

［3］馮剛，馬丙祥，李華偉.熄風(fēng)靜寧湯加減治療小兒多發(fā)性抽動(dòng)癥63例臨床總結(jié)［J］.四川中醫(yī)，2005，23（5）：64-65.

［4］王俊宏，肖和印，尹丹.熄風(fēng)靜寧沖劑治療抽動(dòng)-穢語(yǔ)綜合征的臨床研究［J］.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，25（5）：67-68.

［5］Napier TC，Istre ED.Methamphetamine-Induced sensitization includes a functional upregulation of ventral pallidal 5-HT2A/2C receptors［J］.Synapse，2008，62：14-21.

［6］劉智勝.小兒多發(fā)性抽動(dòng)癥［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：32-74.

［7］Matt JN，Elaine CJ，Robert TW．Identification and characterization of ANKK1：a novelkinase gene closely linked to DRD2 on chromosome band 11q23.1［J］．Hum Mutat，2004，23：540-545．

［8］Cohen DJ，Shaywitz BA，Young JG，et al．Central biogenic amine netabolism in children with the syndrome of chronic motiple tics of Gilles de la Tourrette′s syndrome：norepinephkine，serotonin and dopamine［J］．J Am acad child psychiatry，1979，19：320．

［9］Butler IJ，Koslow SH，Seifers WEJ，et al．Biogenic amine metabolism in Tourrette′s syndrome［J］.Ann neurol，1979，6：37-39．

［10］Diamond BI，Reyes MG，Borision R．A new animalmodel for Tourctte syndrome［J］．Adv Neural，1982，35：221-225．

［11］王道涵，王素梅，衛(wèi)利芳.健脾止動(dòng)湯對(duì)多發(fā)性抽動(dòng)癥模型小鼠紋狀體多巴胺及受體含量的影響［J］.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，35（7）：452-455.

［12］車立純.抽動(dòng)障礙動(dòng)物模型的比較研究［D］.青島：青島大學(xué)，2014.

［13］陳祺.宣桂琪名老中醫(yī)治療小兒抽動(dòng)-穢語(yǔ)綜合征［J］.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2009，37（3）：43-45.

［14］賴東蘭，李宜瑞．李宜瑞教授治療兒童抽動(dòng)-穢語(yǔ)綜合征經(jīng)驗(yàn)述要［J］．中醫(yī)藥學(xué)刊，2004，22（7）：1176．

［15］陳要金.鄭健治療小兒抽動(dòng)-穢語(yǔ)綜合征經(jīng)驗(yàn)［J］.中醫(yī)藥臨床雜志，2009，21（5）：390-391.

［16］于作洋，王基鑫.熄風(fēng)靜寧湯治療小兒多發(fā)性抽動(dòng)癥臨床觀察［J］.中日友好醫(yī)院學(xué)報(bào)，2006，20（2）：124.

Ef fects of Xifeng Jingning Decoction on Behavior and Dopam ine Nuerotransm ltter of Stratium in Rat M odel of Tourette Syndrome

LIYan，WANG Xinzheng，KANG Jianing，et al.Dongzhimen Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100700，China.

R285.5

A

1004-745X（2016）09-1660-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.09.005

2016-05-11）

·研究報(bào)告·

高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金項(xiàng)目（20120013120011）

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