G-CSF在結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)直腸癌中的表達(dá)△

石新英　袁偉　唐萬燕　左雯　徐玥　鐘儒剛　馬潔

1北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，北京100022

2中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院分子腫瘤學(xué)國家重點實驗室，北京100021

G-CSF在結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)直腸癌中的表達(dá)△

石新英1袁偉2#唐萬燕2左雯2徐玥2鐘儒剛1馬潔2

1北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，北京100022

2中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院分子腫瘤學(xué)國家重點實驗室，北京100021

目的探索粒細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte-colony stimulating factor，G-CSF）在結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)直腸癌小鼠模型中的表達(dá)情況，并研究小鼠結(jié)直腸部位G-CSF的細(xì)胞來源。方法利用致癌劑氧化偶氮甲烷（azoxymethane，AOM）和致炎劑葡聚糖硫酸鈉（dextran sodium sulfate，DSS）誘導(dǎo)小鼠的結(jié)直腸癌，通過免疫組化方法檢測G-CSF在炎癥向腫瘤發(fā)展各階段小鼠結(jié)直腸組織中的表達(dá)情況，利用免疫熒光方法檢測小鼠結(jié)直腸部位與GCSF共定位的細(xì)胞。結(jié)果AOM/DSS小鼠模型能良好地模擬結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)直腸癌病程特點：本研究將其分為3個階段，即AD1、AD2、AD3階段。其中AD1階段小鼠結(jié)直腸部位存在大量淋巴細(xì)胞的浸潤，AD2階段小鼠有不典型增生和腺瘤，AD3階段小鼠結(jié)直腸出現(xiàn)原位癌病變。與正常小鼠相比，AD1、AD2、AD3階段小鼠結(jié)直腸部位G-CSF表達(dá)升高，且AD2階段表達(dá)水平最高；G-CSF與小鼠結(jié)直腸部位的上皮細(xì)胞共定位最廣泛，只有少量的肌成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞能跟G-CSF共定位。結(jié)論本研究中AOM/DSS小鼠模型經(jīng)歷了正常黏膜→不典型增生→腺瘤→腺癌的發(fā)展過程，能夠較好地模擬人由炎癥性腸病逐步發(fā)展成結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)直腸癌的病程；AD小鼠與正常小鼠相比表達(dá)較高水平的G-CSF，且AD2階段G-CSF表達(dá)最高；AOM/DSS小鼠模型中，G-CSF主要由小鼠結(jié)直腸部位的上皮細(xì)胞分泌，部分巨噬細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞也可以產(chǎn)生G-CSF。

結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)直腸癌；炎癥性腸?。涣＜?xì)胞集落刺激因子

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是一種常見的惡性消化道腫瘤，它的發(fā)生與多種因素有關(guān)，其中慢性炎癥是致結(jié)直腸癌發(fā)生的一個高危因素［1］。結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)直腸癌（colitis-associated cancer，CAC）是結(jié)直腸癌的一種亞型，與炎癥性腸病（inflammatory bowel diseases，IBD）密切相關(guān)，其中超過20%的炎癥性腸病患者在未來30年內(nèi)將會發(fā)展成結(jié)直腸癌，且患者的治療難度大和病死率較高［2］。盡管炎癥性腸病與CAC發(fā)生密切相關(guān)，但是確切的機制仍然沒有得到系統(tǒng)的研究。

G-CSF作為一種造血生長因子，能夠促進(jìn)中性粒細(xì)胞的分化和成熟，并且影響其功能，通常被用于治療癌癥化療后的嗜中性粒細(xì)胞減少癥。近年來的研究表明，G-CSF在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮很重要的作用。Rutella等［3］發(fā)現(xiàn)，G-CSF在子宮頸癌、卵巢癌、胰腺癌等腫瘤組織中的表達(dá)高于癌旁組織，且患者外周血中G-CSF含量較高。Gutschalkd等［4］研究表明G-CSF能夠促進(jìn)頭頸鱗癌細(xì)胞系的增殖和遷移。此外，也有研究報道，膀胱癌和胃癌腫瘤組織產(chǎn)生高水平G-CSF與患者不良預(yù)后相關(guān)，提示G-CSF可能促進(jìn)癌癥的發(fā)生和發(fā)展［5-7］。多種類型細(xì)胞在適當(dāng)?shù)拇碳は履軌虍a(chǎn)生G-CSF，單核/巨噬細(xì)胞系是G-CSF的主要來源，間皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞等也能夠產(chǎn)生G-CSF［8］。然而，結(jié)腸炎向結(jié)直腸癌發(fā)展過程中，關(guān)于G-CSF的表達(dá)和來源的研究很少。本文主要研究能有效模擬人結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)直腸癌的AOM/DSS小鼠模型中，結(jié)直腸部位G-CSF的表達(dá)情況，以及小鼠結(jié)直腸部位G-CSF的來源，為探索慢性炎癥促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展提供新的思路，為拓展CAC的臨床治療提供可靠的理論支撐。

1　材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1試驗用藥氧化偶氮甲烷，購自美國Sigma公司；葡聚糖硫酸鈉，購自美國Sigma公司。以上兩種物品均具有致癌性，所以特殊保存。

1.1.2實驗動物本研究使用的SPF級C57BL/6雌性小鼠（許可證號：SCXK（京）2014-0004），7周齡左右，體質(zhì)量18～20 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司。恒溫25～27℃，恒濕45%～50%條件，置于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所動物房層流超凈架內(nèi)飼養(yǎng)。

1.1.3試驗試劑G-CSF Goat polyclonal IgG，購自Santa Cruz Biotechnology；Rat mAb to F4/80，Mouse mAb to E cadherin以及Rabbit mAb to alpha Smooth Muscle Actin購自Abcam；Alexa Fluor?594 donkey anti-goat IgG（H+L），Alexa Fluor?488 donkey anti-rat IgG（H+L），Alexa Fluor?488 donkey anti-mouse IgG（H+L）以及Alexa Fluor?488 donkey anti-rabbit IgG（H+L）購自Life TechnologiesTM；磷酸鹽緩沖液，檸檬酸鹽緩沖液，過氧化物封閉液，Normal Donkey Serum，抗體稀釋液，山羊超敏二步法檢測試劑盒，Harris蘇木素染液，1%氨水，中性快干膠，Mounting Medium With DAPI，100×載玻片盒，均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；CRYOMATRIX，購自Thermo Scientific；環(huán)保脫蠟透明劑，CITOGLAS黏附載玻片，均購自北京益利精細(xì)化學(xué)有限公司。

1.2儀器設(shè)備

激光共聚焦顯微鏡、LEICA倒置顯微鏡、凍冰切片機、石蠟切片機。

1.3實驗方法

1.3.1AOM/DSS小鼠結(jié)直腸癌模型3周齡C57BL/ 6小鼠飼養(yǎng)4周后，體質(zhì)量達(dá)到18～20 g，第1天腹腔注射AOM（劑量為12.5 mg/kg）；10 d后第1次給小鼠飼喂含2.5%DSS的飲用水，時間為5 d，然后恢復(fù)飲用正常水休息14 d；重復(fù)兩次DSS喂水過程，完成誘導(dǎo)，總誘導(dǎo)時間為53 d。實驗分為4組，即未處理組（正常組）、1次DSS循環(huán)給水（AD1組）、兩次DSS循環(huán)給水（AD2組）、3次DSS循環(huán)給水（AD3組），每組10只小鼠，每輪DSS循環(huán)給水后處死的小鼠分別命名為AD1小鼠、AD2小鼠和AD3小鼠。（圖1）

圖1　AOM/DSS法誘導(dǎo)C57BL/6小鼠CAC成瘤模型流程圖

1.3.2免疫組化和免疫熒光鏡檢小鼠結(jié)直腸組織標(biāo)本用10%中性甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，行4 μm連續(xù)切片，制備成石蠟切片。選取部分行HE染色。另外的進(jìn)行免疫組化實驗，步驟如下：切片脫蠟至水，PBS沖洗；檸檬酸鹽緩沖液進(jìn)行抗原熱修復(fù)，PBS沖洗；3%H2O2室溫孵育，去除內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBS沖洗；3%BSA室溫封閉1 h；滴加一抗，4℃冰箱過夜；第2天室溫復(fù)溫，PBS沖洗；滴加二抗檢測試劑，PBS沖洗；DAB顯色，顯微鏡下掌握染色程度；蘇木素復(fù)染細(xì)胞核；梯度脫水透明化、中性快干膠封片；鏡檢。

小鼠結(jié)直腸組織標(biāo)本用CRYOMATRIX包埋，行6 μm連續(xù)切片，制備成冰凍切片。免疫熒光實驗步驟如下：切片從-80℃冰箱中取出先后在-20℃、4℃冰箱各放置10 min；用預(yù)冷的丙酮對切片在室溫中進(jìn)行固定，PBS沖洗；10%驢血清封閉1 h；滴加一抗，4℃冰箱過夜；第2天室溫復(fù)溫，PBS沖洗；滴加稀釋適當(dāng)倍數(shù)的熒光二抗室溫孵育1 h，PBS沖洗；用DAPI染細(xì)胞核同時封片；鏡檢。

每組選取5只小鼠制作標(biāo)本，每張切片隨機挑選3個視野進(jìn)行觀察。

2　結(jié)果

2.1AOM/DSS小鼠模型能夠有效復(fù)制結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)直腸癌病程

AOM/DSS小鼠模型誘導(dǎo)過程中，發(fā)現(xiàn)小鼠飲用DSS水后表現(xiàn)出腹瀉、血便和體質(zhì)量減輕的癥狀。分別將3次DSS循環(huán)給水后的小鼠處死，將各階段小鼠結(jié)直腸組織固定包埋后行HE染色。結(jié)果顯示，AD1小鼠結(jié)直腸存在炎癥和大量淋巴細(xì)胞的浸潤；AD2小鼠結(jié)直腸有不典型增生和腺瘤；AD3小鼠結(jié)直腸部位出現(xiàn)原位癌病變（圖2）。該模型中小鼠結(jié)直腸病理與人類CAC相似，能較好地模擬人類CAC的發(fā)展過程。

圖2　正常和各階段AD小鼠結(jié)直腸組織形態(tài)（HE染色，20× 10）

2.2G-CSF在結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中表達(dá)升高

在本實驗室前期工作階段，利用蛋白芯片檢測了不同階段AD小鼠結(jié)直腸組織中細(xì)胞因子的表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AD小鼠組織中G-CSF的表達(dá)水平高于正常小鼠。因此，利用免疫組化方法，我們檢測各階段AD小鼠結(jié)直腸組織中G-CSF的表達(dá)情況，根據(jù)G-CSF染色程度判斷，與正常小鼠相比，AD小鼠均可見較高的G-CSF表達(dá)，其中AD2小鼠結(jié)直腸部位G-CSF的表達(dá)最高。（圖3）

2.3AOM/DSS小鼠模型中G-CSF主要由上皮細(xì)胞分泌

為了明確AOM/DSS小鼠模型結(jié)直腸組織中G-CSF的來源，我們利用免疫熒光檢測G-CSF與其可能來源的幾種細(xì)胞的共定位情況，即上皮細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞及巨噬細(xì)胞。本實驗利用3種細(xì)胞的標(biāo)志蛋白E-Cadherin、α-SMA和F4/80分別標(biāo)記上皮細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AD小鼠3個階段結(jié)直腸組織中G-CSF與上皮細(xì)胞、部分肌成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞均有共定位現(xiàn)象（圖4），上皮細(xì)胞所占比例較大，提示小鼠的CAC形成過程中上皮細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞都可以分泌G-CSF，而G-CSF主要由上皮細(xì)胞分泌。

圖3　正常和AD小鼠結(jié)直腸G-CSF表達(dá)情況（免疫組化染色，20×10）

3　討論

G-CSF作為一種促炎性因子能夠促進(jìn)中性粒細(xì)胞的成熟和分化，并且能動員中性粒細(xì)胞從骨髓釋放到外周血中。正常人血清中G-CSF的含量比較低，通常未達(dá)到檢測水平，當(dāng)機體發(fā)生感染或炎癥時，血清中G-CSF水平顯著升高。研究表明，G-CSF在子宮頸癌、卵巢癌、胰腺癌等腫瘤組織中的表達(dá)水平高于癌旁組織，且患者外周血中G-CSF含量較高。Morris等［9］研究指出，胃腸癌患者腫瘤組織高表達(dá)G-CSF和G-CSF受體，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示G-CSF可能與胃腸癌患者不良預(yù)后相關(guān)。

有研究結(jié)果顯示，T3期結(jié)直腸癌患者腫瘤組織中G-CSF的表達(dá)水平顯著高于T2和T4期［9］。在本研究中，利用免疫組化方法分析G-CSF在正常和AD小鼠結(jié)直腸組織中的表達(dá)。筆者發(fā)現(xiàn)，與正常小鼠相比，AD小鼠結(jié)直腸部位的G-CSF表達(dá)升高，且AD2時期G-CSF含量最高，這與前面相關(guān)研究結(jié)果一致。本實驗前期研究結(jié)果顯示，AD小鼠結(jié)直腸浸潤的MDSC逐漸增多，有研究表明G-CSF能夠促進(jìn)G-MDSC向腫瘤組織募集［10］，本實驗也證實了這一結(jié)論。提示在炎癥發(fā)展成結(jié)直腸癌的過程中，隨著炎癥加劇，G-CSF表達(dá)增多，進(jìn)一步募集了骨髓中MDSC，并促使其分泌IL6、IL-1β等促炎性因子，從而促進(jìn)癌癥的發(fā)展。也表明在AOM/ DSS小鼠模型不同階段的結(jié)直腸組織中，G-CSF的表達(dá)差異與疾病進(jìn)展相關(guān)。此外，免疫組化結(jié)果顯示，G-CSF主要表達(dá)在上皮細(xì)胞，為了進(jìn)一步明確結(jié)直腸組織中G-CSF的來源，筆者通過免疫熒光技術(shù)發(fā)現(xiàn)上皮細(xì)胞和G-CSF確實有共定位現(xiàn)象，說明在AOM/DSS小鼠模型中上皮細(xì)胞能夠產(chǎn)生G-CSF，且與小鼠CAC的發(fā)展具有相關(guān)性。

研究發(fā)現(xiàn)，α-SMA陽性的基質(zhì)成纖維細(xì)胞，通常被稱為肌成纖維細(xì)胞或者活化的成纖維細(xì)胞，在消化道腫瘤的發(fā)展中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，能夠為腫瘤的發(fā)生發(fā)展和侵襲提供一個有利的微環(huán)境［11］。有研究表明，人的成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞能夠產(chǎn)生G-CSF［8，12］。因此，筆者利用免疫熒光方法研究了AD小鼠中結(jié)直腸部位的肌成纖維細(xì)胞是否表達(dá)G-CSF。結(jié)果顯示G-CSF和肌成纖維細(xì)胞只存在較少共定位現(xiàn)象，推測可能與切片中腫瘤來源的肌成纖維細(xì)胞較少有關(guān)。

巨噬細(xì)胞在炎癥和癌癥中發(fā)揮不可或缺的作用。文獻(xiàn)報道，在潰瘍性結(jié)腸炎和結(jié)直腸癌患者病灶部位有大量巨噬細(xì)胞浸潤［13-15］。早期研究揭示，在IL-1、LPS和TNF-α炎性因子刺激下，巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和相關(guān)的間充質(zhì)細(xì)胞能夠產(chǎn)生GCSF。此外，一項利用雄性Crj的研究：CD-1（ICR）小鼠誘導(dǎo)結(jié)直腸癌發(fā)現(xiàn)［16］：腹腔M1型巨噬細(xì)胞僅在CAC過程的轉(zhuǎn)移階段產(chǎn)生較高水平的G-CSF，腹腔M2型巨噬細(xì)胞在整個CAC過程中高表達(dá)GCSF，尤其在腺瘤階段和腫瘤形成階段。本研究免疫熒光結(jié)果表明，在C57BL/6-AD小鼠中巨噬細(xì)胞確實能夠表達(dá)G-CSF，這與前人研究結(jié)果相似。

臨床病例報道結(jié)果顯示，高表達(dá)G-CSF的結(jié)直腸癌患者，腫瘤體積較大并且有遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，盡管手術(shù)切除后使G-CSF的水平下降，但是這些患者的整體術(shù)后生存較差，提示G-CSF具有促進(jìn)癌癥進(jìn)展的功能［17-18］。本研究結(jié)果表明，在小鼠CAC發(fā)生發(fā)展過程中G-CSF表達(dá)升高，并且利用免疫熒光方法證明了AD小鼠結(jié)直腸部位的上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞能夠分泌G-CSF，提示可以抑制上述細(xì)胞分泌G-CSF，從而減緩CAC的進(jìn)程，為CAC的臨床治療提供了新的靶點和理論依據(jù)。

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The expression of G-CSF in colitis-associated cancer△

SHI Xin-ying1YUAN wei2#TANG Wan-yan2ZOU Wen2XU Yue2ZHONG Ru-gang1MAJie21Beijing University of Technology，Beijing 100022，China
2State Key Laboratory of Molecular Oncology，Cancer Hospital，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100021，China

ObjectiveTo investigate the expression of granulocyte-colony stimulating factor（G-CSF）in a mouse model of colitis-associated cancer（CAC），and to study the cellular source of G-CSF in colorectum area.MethodCAC in mouse model was induced by carcinogen azoxymethane（AOM）and pro-inflammatory agents dextran sodium sulfate（DSS）.The expression of G-CSF in the colorectum of normal and AD mice was examined by immunohistochemistry.The cellular source of G-CSF was investigated by immunofluorescence.ResultAOM/DSS mouse model well simulated the characteristic pathological process of CAC，and was staged as AD1，AD2 and AD3 in our study.The colonrectum in AD1 mice suffered heavy infiltration of lymphocytes.AD2 mice had dysplasia and adenoma.AD3 mice appeared cancer in situ.AD mice had a higher expression level of G-CSF than normal mice，and the expression of G-CSF in AD2 mice was the highest.G-CSF was mainly co-localized with the intestinal epithelial cells of colorectum area，and only a few myofibroblasts and macrophages exhibited significant co-localization with G-CSF.ConclusionIn this study，AOM/DSS mice underwent a typical development process of normal mucosa→hyperplasia→adenoma→adenocarcinoma，which is similar with the development of human CAC.The level of G-CSF in AD mice was higher than that of normal mice，and the expression level of G-CSF in AD2 mice was the highest.In AOM/DSS mouse model，the major cellular source of G-CSF were intestinal epithelial cells，and a few myofibroblasts and macrophages can also produce G-CSF.

colitis-associated cancer；inflammatory bowel diseases；granulocyte colony-stimulating factor Oncol prog，2016，14（2）

R735.3

A

10.11877/j.issn.1672-1535.2016.14.02.20

2015-10-10）

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（2014CB542103）；北京市自然科學(xué)基金（7144237）；科技北京百名領(lǐng)軍人才培養(yǎng)工程（Z13110700513001）；北京市科技新星計劃（Z131107000413066）

（corresponding author），郵箱：yuanwei7568@163.com