哈薩克族食管癌組織中microRNA-21的表達(dá)及其意義△

孫清超　宗亮　張海平　張力為　張鑄　鄧彥超

新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科，烏魯木齊　830054

哈薩克族食管癌組織中microRNA-21的表達(dá)及其意義△

孫清超宗亮張海平張力為#張鑄鄧彥超

新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科，烏魯木齊830054

目的探討哈薩克族食管癌組織中microRNA-21（miRNA-21）的表達(dá)及其意義。方法收集72例哈薩克族食管癌患者臨床樣本，采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)食管癌組織、周圍正常食管組織miRNA-21表達(dá)水平；以患者性別、年齡、臨床分期、腫瘤部位、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病情是否惡化等作為觀察指標(biāo)，分析miRNA-21與臨床資料的關(guān)系。再以腫瘤中位生存期作為觀察指標(biāo)，篩選出影響哈薩克族食管癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素。結(jié)果食管癌組織miRNA-21相對(duì)表達(dá)量為（7.57±0.14），周圍正常食管組織相對(duì)表達(dá)量為（1.37±0.08），食管癌組織相對(duì)表達(dá)量高于正常組織（P＜0.05）。72例食管癌患者分為miRNA-21高表達(dá)組42例和低表達(dá)組30例，miRNA-21表達(dá)與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤進(jìn)展有關(guān)，即淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤進(jìn)展及腫瘤臨床分期越晚，腫瘤miRNA-21表達(dá)也越高（P＜0.05）；miRNA-21高表達(dá)組5年生存率為20.7%，低表達(dá)組5年生存率為38.6%，兩組5年生存率比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.715，P=0.005）；多因素分析顯示，臨床分期、腫瘤進(jìn)展、miRNA-21表達(dá)水平是影響哈薩克族食管癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。結(jié)論miRNA-21在食管癌組織表達(dá)水平高于正常組織，且miRNA-21表達(dá)越高，患者預(yù)后越差，miRNA-21可以作為哈薩克族食管癌診斷及預(yù)后評(píng)價(jià)的指標(biāo)之一。

微小RNA；食管癌；哈薩克族；預(yù)后；生存率；影響因素

Oncol Prog，2016，14（7）

新疆是我國(guó)多民族居住區(qū)，各民族生活、居住、風(fēng)俗情況不一。調(diào)查顯示［1-2］，新疆地區(qū)食管癌病死率為13.05/10萬(wàn)，而哈薩克族發(fā)病率最高（68.88/10萬(wàn)），其中新疆塔城地區(qū)托里縣哈薩克族發(fā)病率為155.9/10萬(wàn)，比其他少數(shù)民族地區(qū)高2～3倍，比全國(guó)平均病死率高2.3倍，病死率在全國(guó)少數(shù)民族中占第一位。由于食管癌病情隱匿，大多患者確診時(shí)已處于中晚期，即使給予放療、化療或手術(shù)治療，其5年生存率僅為14.6%～26.3%，其中75%以上的食管癌患者于確診后1年內(nèi)死亡［3］。因此早期診斷食管癌對(duì)降低其病死率具有重要意義。微小RNA（microRNA，miRNA）是生物體內(nèi)一種內(nèi)源性非編碼小分子RNA家族，長(zhǎng)約18～23 nt，具有高度的生物保守性。國(guó)外研究［4］證實(shí)miRNA能夠與靶基因mRNA的3′-非翻譯區(qū)（3′-UTR）特異性結(jié)合，并誘導(dǎo)mRNA降解或抑制翻譯，從而參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、侵襲等生物學(xué)行為。本研究對(duì)食管癌組織及周圍組織miRNA-21進(jìn)行定量分析，并進(jìn)一步探討miRNA-21表達(dá)與哈薩克族食管癌病理生物學(xué)參數(shù)之間關(guān)系，旨在為哈薩克族食管癌的診斷、治療和預(yù)后評(píng)估提供依據(jù)。

1　資料與方法

1.1一般資料

收集2008年7月至2010年12月在新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科行手術(shù)治療的72例哈薩克族食管癌患者臨床資料，其中男43例，女29例，年齡27～74歲，平均（52.6±6.1）歲；發(fā)病部位：胸上段食管癌15例，中段食管癌31例，下段食管癌26例；其中低分化腫瘤16例，中分化腫瘤26例，高分化腫瘤30例；按照美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)［5］American joint committee on cancer，AJCC）食管癌臨床分期標(biāo)準(zhǔn)分為Ⅰ期9例，Ⅱ期27例，Ⅲ期25例，Ⅳ期11例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者均經(jīng)病理學(xué)證實(shí)為食管癌；②所有患者民族均為哈薩克族；③入組前未進(jìn)行抗癌治療；④預(yù)計(jì)生存期≥6個(gè)月；⑤術(shù)中取出病理標(biāo)本，并冷凍切片保存；⑥患者及家屬獲知研究方案，并簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①新疆地區(qū)非哈薩克族患者；②患者病歷資料不完整；③遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移或合并其他惡性腫瘤者；④預(yù)計(jì)無(wú)法正常隨訪。

1.2方法

1.2.1miRNA-21檢測(cè)術(shù)中將瘤體組織切除，同時(shí)切取距腫瘤邊緣5 cm以上的切緣組織（術(shù)后病理學(xué)證實(shí)為正常食管組織）；將組織切片充分研碎，在嚴(yán)格無(wú)菌操作下用RNA提取試劑盒將總RNA提?。≧NA試劑盒購(gòu)自美國(guó)invitrogen公司），檢測(cè)提取后的總RNA吸光度值（optical delnsity，OD），OD260/280值1.8～2.0。再將總RNA用逆轉(zhuǎn)率試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，實(shí)時(shí)定量miRNA-21作為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：引物濃度0.3 μmol/L，96℃變性20 s，60℃退火45 s，總計(jì)35個(gè)循環(huán)。70～94℃繪制熔解曲線，分析PCR熔解曲線，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)平行孔，以miRNA U6的Ct值作為內(nèi)參照，計(jì)算miRNA-21的相對(duì)表達(dá)量（2-△△Ct）。引物序列如下：

miRNA-21引物內(nèi)參U6上游：5′-AACGUCAUCCGCUGUGAGAUUC-3′下游：5′-CCGCAUGAAGAUUAGUUGCGUA-3′上游：5′-ACGGGCTGTCAGCTAAAGCC-3′下游：5′-GACGGCACACGAGTCG-3′

1.2.2隨訪對(duì)72例患者進(jìn)行為期5年的隨訪，隨訪至2016年2月，隨訪以門(mén)診復(fù)查、電話回訪等方式，起始日期以術(shù)后第2天開(kāi)始計(jì)算，截止日期為患者死亡或失訪的時(shí)間。

1.2.3觀察指標(biāo)記錄患者5年生存率、中位生存期。以患者性別、年齡、臨床分期、腫瘤部位、分化程度、病情是否惡化等作為觀察指標(biāo)，分析miRNA-21與臨床資料的關(guān)系。再以腫瘤中位生存期作為觀察指標(biāo)，篩選出影響哈薩克族食管癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)-學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以百分比（%）的形式表示，比較采用χ2檢驗(yàn)；患者生存曲線采用Kaplan-Meier法，組間生存情況比較采用Log-rank test，多因素采用Cox回歸模型，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1食管癌組織及正常組織miRNA-21表達(dá)水平

以U6作為內(nèi)參，食管癌組織miRNA-21相對(duì)表達(dá)量為（7.57±0.14），周圍正常食管組織相對(duì)表達(dá)量為（1.37±0.08），食管癌組織miRNA-21相對(duì)表達(dá)量高于正常組織（P＜0.05）。

2.2miRNA-21表達(dá)與臨床資料的關(guān)系

以食管癌組織miRNA-21相對(duì)表達(dá)量（7.57± 0.14）作為臨界值，大于或等于（7.57±0.14）為高表達(dá)組，小于為低表達(dá)組。將72例食管癌患者分為miRNA-21高表達(dá)組42例和低表達(dá)組30例，高表達(dá)組和低表達(dá)組性別、年齡、腫瘤發(fā)生部位、分化程度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；臨床分期、腫瘤進(jìn)展（腫瘤進(jìn)展的定義：瘤體最大徑之和至少增加≥20%，或出現(xiàn)新病灶）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），高表達(dá)組Ⅲ～Ⅳ期、腫瘤進(jìn)展、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生率高于低表達(dá)組（P＜0.05）。（表1）

2.3miRNA-21表達(dá)與食管癌患者生存率的關(guān)系

72例患者均獲得隨訪，隨訪時(shí)間5～60個(gè)月，平均（37.4±4.2）個(gè)月；miRNA-21高表達(dá)組5年生存率為20.7%，低表達(dá)組5年生存率為38.6%，兩組5年生存情況比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.715，P=0.005）。（圖1）

2.4哈薩克族食管癌患者預(yù)后單因素分析

Log-rank分析結(jié)果顯示，臨床分期越晚、腫瘤進(jìn)展、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、miRNA-21高表達(dá)的患者中位生存期均顯著縮短（P＜0.05）。（表2）

2.5哈薩克族食管癌患者預(yù)后多因素分析

Cox回歸模型分析顯示，臨床分期、腫瘤進(jìn)展、miRNA-21表達(dá)水平是影響哈薩克族食管癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。（表3）

表1　不同miRNA-21表達(dá)與臨床資料的關(guān)系［n（%）］

圖1　miRNA-21表達(dá)水平與5年生存率的關(guān)系

3　討論

食管癌的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜過(guò)程，包括許多外在因素如某些化學(xué)物質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)缺乏、物理因素、生物因素等［6-7］。內(nèi)在的遺傳因素也是食管癌發(fā)生的影響因素，抑癌基因失活或原癌基因激活是重要原因之一［8］。miRNA在腫瘤發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用，國(guó)外研究［9］證實(shí)一部分miRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有癌基因功能，在腫瘤組織中常常過(guò)表達(dá)，影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展；另一部分miRNA則具有抑癌基因功能，在腫瘤中表達(dá)缺失或下調(diào)。miRNA-21是一種位于17q23.2染色體FRAl7B區(qū)域上，且具有自主轉(zhuǎn)錄單位的miRNA，近年來(lái)研究［10］發(fā)現(xiàn)miRNA-21在多種實(shí)體瘤中表達(dá)上調(diào)，并證實(shí)其通過(guò)復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制參與了腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。劉啟飛［11］研究證實(shí)miRNA-21在肺癌、乳腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、胃癌、胰腺癌、胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌瘤、肝癌、膽管癌、結(jié)腸癌、前列腺癌中呈現(xiàn)高表達(dá)。王麗麗等［12］也證實(shí)miRNA-21高表達(dá)顯著增加了腫瘤細(xì)胞的增殖及侵襲，而將miRNA-21敲除后，腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力明顯下降。

目前有關(guān)新疆地區(qū)哈薩克族食管癌病因及發(fā)病機(jī)制方面的研究仍不是很成熟，哈薩克族人群生活和居住情況有其特殊性，如該民族極少與其他民族通婚、生活居所不定、喜食酸奶疙瘩、煙熏肉、燙食、咀嚼納斯、蔬菜水果攝入少及營(yíng)養(yǎng)不平衡等，因此食管癌發(fā)病具有明顯的家族聚集性特點(diǎn)。Androsavich等［13］對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌、正常食管上皮組織及食管鱗狀細(xì)胞癌的細(xì)胞株miRNA-21進(jìn)行定量PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示食管癌組織miRNA-21表達(dá)水平顯著高于正常食管上皮組織，當(dāng)存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時(shí)，miRNA-21表達(dá)亦顯著升高。因此檢測(cè)哈薩克族食管癌患者miRNA-21的表達(dá)水平，對(duì)揭示其在哈薩克族食管癌中的發(fā)生機(jī)制方面占重要地位。本研究顯示，哈薩克族食管癌組織miRNA-21相對(duì)表達(dá)量高于正常食管上皮組織，提示miRNA-21可能參與了食管癌的發(fā)生發(fā)展。潘雪和李向楠［14］對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌組織采用原位雜交技術(shù)檢測(cè)，結(jié)果也證實(shí)miRNA-21表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性。進(jìn)一步分析miRNA-21表達(dá)與患者臨床病理資料的關(guān)系，結(jié)果顯示miRNA-21表達(dá)與臨床分期、腫瘤進(jìn)展、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，即腫瘤臨床分期越晚，腫瘤進(jìn)展及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者miRNA-21表達(dá)越高，這亦提示miRNA-21與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移及病情發(fā)展有關(guān)。高楚蒙等［15］研究顯示，miRNA-21能夠直接作用于RECK基因，進(jìn)而誘導(dǎo)骨肉瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。趙遵蘭等［16］亦證實(shí)，乳腺癌細(xì)胞中miRNA-21與TIMP3表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，miRNA-21可能通過(guò)抑制TIMP3表達(dá)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

表2　哈薩克族食管癌患者預(yù)后單因素分析

表3　哈薩克族食管癌患者預(yù)后多因素分析

在對(duì)哈薩克族食管癌患者預(yù)后的影響因素進(jìn)行分析，結(jié)果顯示臨床分期、腫瘤進(jìn)展、miRNA-21表達(dá)水平是影響患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，miRNA-21表達(dá)越高，患者預(yù)后越差。Okayama等［17］證實(shí)miRNA-21可以作為判斷肺癌分期、治療及診斷的指標(biāo)之一，miRNA-21高表達(dá)亦是肺癌患者預(yù)后的負(fù)性因素。miRNA-21調(diào)節(jié)的信號(hào)通路目前仍不清楚，有報(bào)道［18-19］稱miRNA-21能夠活化AKT/ PI3K信號(hào)通路，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)抗腫瘤治療產(chǎn)生耐受。Markou等［20］則稱miRNA-21具有抑制腫瘤細(xì)胞周期的作用，當(dāng)細(xì)胞被阻滯于G2/M周期，導(dǎo)致對(duì)射線和化療不敏感，這亦是食管癌放化療失敗的誘因之一。當(dāng)然，食管癌的形成是個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，多種基因均參與了其中的調(diào)節(jié)，miRNA-21也并非是唯一一個(gè)改變的基因型，而這些改變的基因是否存在相互作用依然需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，miRNA-21在食管癌組織表達(dá)水平高于正常組織，且miRNA-21表達(dá)越高，患者預(yù)后越差，miRNA-21可以作為哈薩克族食管癌診斷及預(yù)后評(píng)價(jià)的指標(biāo)之一。

［1］李卉，姜孝芳，王洪江，等.PTEN、p21基因在新疆哈薩克族食管癌中的表達(dá)［J］.天津醫(yī)藥，2013，4（9）:852-854.

［2］李秀梅，陳艷，李卉，等.新疆哈薩克族食管癌中Survivin的表達(dá)及其與Caspase-9和Caspase-3基因的相關(guān)性［J］.解剖學(xué)報(bào)，2013，44（2）:235-237.

［3］Shirai K，Tamaki Y，Kitamoto Y，et al.Prognosis was not deteriorated by multiple primary cancers in esophageal cancer patients treated by radiotherapy［J］.J Radiat Res，2013，54（4）:706-711.

［4］Tomimaru Y，Eguchi H，Nagano H，et al.Circulating microRNA-21 as a novel biomarker for hepatocellular carcinoma［J］.J Hepatol，2012，56（1）:167-175.

［5］Hari DM，Leung AM，Lee JH，et al.AJCC cancer staging manual 7th edition criteria for colon cancer:Do the complex modifications improve prognostic assessment？［J］.J Am Coll Surg，2013，217（2）:181-190.

［6］Atsumi K，Shioyama Y，Arimura H，et al.Esophageal stenosis associated with tumor regression in radiotherapy for esophageal cancer:frequency and prediction［J］.Int J Radiat Oncol Biol Phys，2012，82（5）:1973-1980.

［7］Nomura M，Shitara K，Kodaira T，et al.Prognostic impact of the 6th and 7th American Joint Committee on Cancer TNM staging systems on esophageal cancer patients treated with chemoradiotherapy［J］.Int J Radiat Oncol Biol Phys，2012，82（2）:946-952.

［8］Swisher SG，Winter KA，Komaki RU，et al.A phase II study of a paclitaxel-based chemoradiation regimen with selective surgical salvage for resectable locoregionally advanced esophageal cancer:Initial reporting of RTOG 0246［J］.Int J Radiat Oncol Biol Phys，2012，82（5）:1967-1972.

［9］Caponi S，F(xiàn)unel N，F(xiàn)rampton AE，et al.The good，the bad and the ugly:A tale of miR-101，miR-21 and miR-155 in pancreatic intraductal papillary mucinous neoplasms［J］. Ann Oncol，2013，24（3）:734-741.

［10］潘雪，李向楠.微小RNA-21反義寡核苷酸對(duì)食管癌順鉑耐藥細(xì)胞的影響［J］.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2015，32（5）: 1072-1074.

［11］劉啟飛.循環(huán)miRNA-21在腫瘤中的研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2014，20（19）:3521-3523.

［12］王麗麗，陳林，畢桂彬，等.多發(fā)性骨髓瘤患者骨髓液中miRNA-21、miRNA-15a和miRNA-16的表達(dá)及其臨床意義分析［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2015，13（9）:1461-1464.

［13］Androsavich JR，Chau BN，Bhat B，et al.Disease-linked microRNA-21 exhibits drastically reduced mRNA binding and silencing activity in healthy mouse liver［J］.RNA，2012，18（8）:1510-1526.

［14］潘雪，李向楠.反義微小RNA-21寡核苷酸對(duì)食管癌EC9706細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用［J］.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2015，32（1）:81-83.

［15］高楚蒙，張曉鳳，牛暢，等.miRNA-21抑制劑對(duì)骨肉瘤MG63細(xì)胞增殖、凋亡和遷移的影響［J］.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2014，10（9）:2035-2038.

［16］趙遵蘭，蔡穎，王洋洋，等.微小RNA-21對(duì)人乳腺癌細(xì)胞株紫杉醇耐藥性的影響及其機(jī)制［J］.浙江大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2015，7（4）:400-409.

［17］Okayama H，Saito M，Oue N，et al.NOS2 enhances KRAS-induced lung carcinogenesis，inflammation and microRNA-21expression［J］.IntJCancer，2013，132（1）:9-18.

［18］Liu ZL，Wang H，Liu J，et al.MicroRNA-21（miR-21）expression promotes growth，metastasis，and chemo-or radioresistance in non-small cell lung cancer cells by targeting PTEN［J］.Mol Cell Biochem，2013，372（1-2）:35-45.

［19］邱實(shí)，孟凡旭，劉念，等.miRNA-21在結(jié)直腸癌中的表達(dá)研究［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2014，18（1）:91-93.

［20］Markou A，Sourvinou I，Vorkas PA，et al.Clinical evaluation of microRNA expression profiling in non small cell lung cancer［J］.Lung Cancer，2013，81（3）:388-396.

Clinical significance of microRNA-21 expression level in esophageal cancer tissue in Kazakh△

SUN Qing-chao ZONG Liang ZHANG Hai-ping ZHANG Li-wei#ZHANG Zhu DENG Yan-chao
Department of Thoracic Surgery，the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Urumqi 830054，Xinjiang，China

ObjectiveTo explore the clinical significance of miRNA-21 expression level in esophageal cancer in Kazakh.Method72 samples of esophageal cancer tissues were collected from Kazakh patients，and the expression of miRNA-21 in esophageal cancer tissues and adjacent normal tissues was detected by real-time quantitative PCR；Age，clinical stage，tumor location，differentiation，lymph node metastasis，and disease progression were summarized to analyze the correlation between miRNA-21 and those clinical measures.Median survival was utilized in evaluating the prognostic factors of esophageal cancer in Kazakh.ResultThe relative expression of miRNA-21 in esophageal cancer tissue was（7.57±0.14），and was（1.37±0.08）in normal esophageal tissues，with significant difference observed（P＜0.05）.72 cases of esophageal cancer patients were stratified as miRNA-21 high expression group（n=42）and low expression group（n=30），then it was found that miRNA-21 expression was related with clinical stage，lymph node metastasis，and tumor progression，i.e.，lymph node metastasis，higher miRNA-21 expression and more advanced clinical stage were associated with higher incidence of tumor progression（P＜0.05）.The 5-year survival rate was 20.7%in miRNA-21 high expression group，while was 38.6%in the low expression group，with statistically significant difference observed（χ2=4.715，P= 0.005）.Multivariate analysis revealed that clinical stage，tumor progression，miRNA-21 expression level were independent risk factors for Kazakh esophageal cancer patients（P＜0.05）.ConclusionEsophageal cancer tissues have higher miRNA-21 expression than normal tissues，and the expression level of miRNA-21 was negatively correlated with prognosis，so miRNA-21 is a potential measure for the diagnosis and prognosis of Kazakh esophageal cancer patients.

micro RNA；esophageal cancer；Kazak；prognosis；survival rate；influencing factors

R735.1

A

10.11877/j.issn.1672-1535.2016.14.07.08

2016-04-08）

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金（2014211C029）

（corresponding author），郵箱：zhangliwei@medmail.com