白藜蘆醇對肺癌A549細胞增殖及NF-κB表達的影響

嚴靜霞，郭　勇，張　瑞，郭　唯，華國祥，蘇軍華*

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院檢驗科，河北 石家莊 050000；2. 河北省石家莊市第一醫(yī)院醫(yī)務(wù)處，河北 石家莊 050011；3.河北省深州市醫(yī)院檢驗科，河北 深州 053899；4.邯鄲(陶瓷)集團總公司醫(yī)院內(nèi)科，河北 邯鄲 056011)

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·論著·

白藜蘆醇對肺癌A549細胞增殖及NF-κB表達的影響

嚴靜霞1，郭勇2，張瑞1，郭唯3，華國祥4，蘇軍華1*

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院檢驗科，河北 石家莊 050000；2. 河北省石家莊市第一醫(yī)院醫(yī)務(wù)處，河北 石家莊 050011；3.河北省深州市醫(yī)院檢驗科，河北 深州 053899；4.邯鄲(陶瓷)集團總公司醫(yī)院內(nèi)科，河北 邯鄲 056011)

目的 觀察白黎蘆醇對人肺癌細胞A549增殖及核轉(zhuǎn)錄因子κB (nuclear factor-kappa B,NF-κB)表達的影響。方法選用噻唑藍(methylthiazolyldiphenyl-tetrazoliumbromide，MTT)法檢測白藜蘆醇對A549細胞增殖的影響；采用逆轉(zhuǎn)錄PCR (reverse transcription-PCR,RT-PCR)檢測白藜蘆醇對A549細胞NF-κB信使核糖核酸(messenger RNA,mRNA) 表達的作用；采用免疫印跡法檢測白藜蘆醇對肺癌A549細胞NF-κB蛋白水平的影響。結(jié)果隨白藜蘆醇濃度的增加，B、C、D組細胞生長抑制率均高于A組，C、D組高于B組，D組高于C組(P<0.05)。B、C、D組24、48 h細胞生長抑制率高于12 h，48 h細胞生長抑制率高于24 h(P<0.05)。經(jīng)100 μmol/L白藜蘆醇作用48 h后，A549細胞可以明顯下調(diào)NF-κB mRNA和蛋白水平的表達。結(jié)論白藜蘆醇可以明顯抑制肺癌A549細胞的增殖及NF-κB的表達。

肺腫瘤；白藜蘆醇；細胞凋亡；NF-κB

10.3969/j.issn.1007-3205.2016.09.018

肺癌是常見惡性腫瘤之一，其發(fā)病率及病死率均居首位[1]。近幾年，由于受環(huán)境影響，我國肺癌發(fā)病率呈上升趨勢且發(fā)病人群越來越年輕。雖然治療肺癌的方法多種多樣，但效果并不明顯，近年來統(tǒng)計資料顯示我國肺癌患者5年生存率不到16%[2]。故探討肺癌的發(fā)病機制，并對癌前病變進行干預(yù)，是一項緊迫而有意義的工作[3]。中藥及其提取物治療癌癥有著悠久的歷史且安全低毒。白藜蘆醇是天然多酚類化合物，具有廣泛抗腫瘤的作用并且不良反應(yīng)小，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到干擾作用，能夠防止腫瘤細胞的擴散。為此，本研究觀察白藜蘆醇對核轉(zhuǎn)錄因子κB (nuclear factor-kappa B,NF-κB)的影響，旨在為開發(fā)新的抗肺癌藥物提供理論基礎(chǔ)。現(xiàn)報告如下。

1　資料與方法

1.1試劑與儀器白藜蘆醇購自美國Sigma公司，人肺癌細胞株A549由河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院實驗室保存，RPMI1640培養(yǎng)基購于Gibcobrl公司，噻唑藍(methylthiazolyldiphenyl-tetrazoliumbromide，MTT)以及二甲基亞砜(dmethyl sulfoxide, DMSO)均購自Sigma公司，兔抗人NF-κB購于上海Santa公司，山羊抗兔二抗購于上?？党晒??？俁NA提取試劑盒及PCR擴增試劑盒均購自Takara 公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京全式金生物有限公司，BCA(bicinchoninic acid)蛋白定量試劑盒購自美國Sigma公司，總蛋白提取試劑盒購自上海生物工程有限公司，Biorad凝膠成像分析系統(tǒng)購自江蘇捷達公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及白藜蘆醇藥液稀釋將人肺癌細胞株A549細胞培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基中(含有10%新生牛血清和100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素)。在37 ℃、5%CO2飽和適度溫箱中培養(yǎng)。待細胞生長至70%～80%融合，胰蛋白酶常規(guī)消化2 d傳1代。將白藜蘆醇溶于100%DMSO后慮菌，離心，取上清液制成濃度為100 μmol/L的原液，分裝，置于4 ℃冰箱避光保存。以含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基稀釋后使用。

1.2.2實驗分組實驗分為對照組A，實驗組B、C、D，共4組。B組為加入濃度50 μmol/L的白藜蘆醇后的A549細胞；C組為加入濃度100 μmol/L的白藜蘆醇后的A549細胞；D組為加入濃度150 μmol/L的白藜蘆醇后的A549細胞。

1.2.3細胞的增殖測定采用MTT法檢測細胞增殖抑制率，取對數(shù)期A549細胞，胰酶消化后接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔4×104個，A、B、C、D組各接種10孔，4組置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)預(yù)培養(yǎng)24 h；4組分別加入濃度為0、50、100、150 μmol/L的白藜蘆醇，經(jīng)12、24、48 h處理，每孔加入MTT 20 μL，培養(yǎng)箱孵育4 h，加入DMSO 150 μL，振蕩15 min。每組6個復(fù)孔，同時設(shè)調(diào)零組。應(yīng)用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測590 nm吸光度值。計算增殖抑制率。

1.2.4逆轉(zhuǎn)錄PCR法檢測NF-κB在A549細胞中的表達取對數(shù)期的A549細胞，經(jīng)100 μmol/L白藜蘆醇處理48 h后收集細胞。按照試劑盒說明書提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增。NF-κB及GAPDH引物由上海生工設(shè)計。NF-κB上游引物序列為:5′-GGACACGACCTCTGACACAT-3′，下游引物序列為5′-TAGGGTGAGGGTAGTCGATCA-3′，擴增產(chǎn)物長度為216bp；GAPDH上游引物序列：5′-GGAAGGAGCCCTGTGGCAT-3′，下游引物序列：5′-CTACTAGGATATGGGGACG-3′，擴增產(chǎn)物長度為305 bp。反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，Biorad凝膠圖像采集與分析系統(tǒng)進行掃描分析。以NF-κB/GAPDH的平均光密度比值來表示NF-κB的mRNA水平，進行半定量分析。

1.2.5免疫印跡法檢測取對數(shù)期生長的A549細胞，經(jīng)100 μmol/L白藜蘆醇處理48 h后收集細胞。按照試劑盒說明書提取總蛋白。BCA蛋白定量后調(diào)節(jié)蛋白體積濃度。配置4%濃縮膠和12%的分離膠，取各組A549細胞蛋白50 μg，與上樣緩沖液混合后沸水煮5 min，冷卻后加樣進行電泳。轉(zhuǎn)膜后5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。按1∶1 000稀釋一抗，4 ℃封閉過夜。TBST洗滌3次，每次10 min。1∶1 000稀釋二抗，37 ℃孵育1.5 h，洗膜3次，每次15 min。PVDF膜顯色：Pierce化學(xué)發(fā)光底物A液與B液1∶1混合，室溫反應(yīng)5 min后，吸干反應(yīng)液，應(yīng)用化學(xué)發(fā)光及熒光影像分析儀進行圖像分析。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料比較分別采用單因素方差分析和SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)　　果

2.1白藜蘆醇對肺癌細胞A549的增殖抑制作用通過MTT法觀察A549的增殖情況，結(jié)果顯示，隨白藜蘆醇濃度的增加，B、C、D組細胞生長抑制率均高于A組，C、D組高于B組，D組高于C組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；A組12、24、48 h細胞生長抑制率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，B、C、D組24、48 h細胞生長抑制率高于12 h，48 h細胞生長抑制率高于24 h，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1白藜蘆醇對A549細胞增殖的影響

組別細胞生長抑制率12h24h48hFPA組000B組13.90±2.8042.88±2.75△63.13±3.98△119.0910.000C組29.79±2.89*55.35±0.61*△76.42±2.55*△☆245.4740.000D組38.80±2.46*#63.85±4.08*#△82.57±2.98*#△☆145.2550.000F60.39146.09640.247P0.0000.0000.000

*P<0.05與B組比較#P<0.05與C組比較△P<0.05與24 h比較☆P<0.05與48 h比較(q檢驗)

2.2逆轉(zhuǎn)錄PCR觀察白藜蘆醇對NF-κB mRNA水平的影響逆轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)果(圖1)顯示，經(jīng)100 μmol/L白藜蘆醇作用后A549細胞48 h的NF-κB mRNA光密度值為0.37±0.12，明顯低于12 h的0.75±0.08和24 h的0.55±0.11，且24 h的光密度值低于12 h，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=32.948，P=0.000)。

圖1NF-κB mRNA的表達

Figure 1mRNA expression of NF-κB

2.3免疫印跡法結(jié)果將質(zhì)量濃度為100 μmol/L白藜蘆醇作用A549細胞，結(jié)果顯示能明顯抑制A549細胞中NF-κB蛋白的表達，并且在處理48 h時最明顯(圖2)。

圖2NF-κB蛋白的表達

Figure 2Protein expression of NF-κB

3　討　　論

肺癌的亞型中，非小細胞肺癌占有很大比例，約為85%，是導(dǎo)致肺癌患者死亡的主要因素之一[4]。晚期非小細胞肺癌可采取化學(xué)治療、生物免疫治療等多種方法，但療效仍不滿意，并且容易出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，結(jié)合非小細胞肺癌早期容易出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移，使應(yīng)用化療藥物受到了很大限制。目前公認的肺癌根治方法是手術(shù)治療,但大多數(shù)已確診的肺癌患者都已經(jīng)失去了最佳的手術(shù)時機；現(xiàn)在放療技術(shù)被臨床廣泛應(yīng)用于對肺癌患者的治療，其提高了肺癌患者的生存質(zhì)量并對延長患者的生存期具有積極的意義，但放療技術(shù)對于已經(jīng)發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的肺癌患者是否有效還有待觀察，故無論對于已經(jīng)進行手術(shù)治療的肺癌患者還是無法進行手術(shù)的患者，采用輔助化療仍然是最有效和廣泛的治療方式[5]。尋找治療非小細胞肺癌的新藥物對延長肺癌患者的生存期具有重要而深遠的影響。

白藜蘆醇是天然多酚類化合物，具有廣泛的生理活性如抗感染、抗動脈粥樣硬化、抗氧化并且清除自由基等多種作用。研究表明，白藜蘆醇有預(yù)防腫瘤的作用，效果令人滿意，并且不良反應(yīng)少[6]。大量研究表明，白藜蘆醇對多種腫瘤細胞均有抑制作用，如肝癌細胞、乳腺癌細胞、卵巢癌細胞、胃癌細胞等；針對胃腸道等消化系統(tǒng)惡性腫瘤，白藜蘆醇還能促腫瘤分化，抑制腫瘤增殖，可綜合多靶位的調(diào)節(jié)腫瘤細胞的各個層次的分子,起到調(diào)節(jié)平衡的作用；白藜蘆醇具有引發(fā)腫瘤細胞凋亡和抑制腫瘤增殖的作用[7-10]。研究表明，白藜蘆醇具有抑制結(jié)腸癌細胞增殖并能促進其凋亡的作用，其機制可能與下調(diào)β-catenin mRNA的表達進而抑制Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)[11]。李覃等[12]采用5 mg/kg劑量的白藜蘆醇處理肝癌荷瘤小鼠，結(jié)果顯示白藜蘆醇處理組CD4、CD25T細胞數(shù)量明顯降低，且Foxp3表達下調(diào)，其作用機制可能與調(diào)控STAT3磷酸化活性有關(guān)。另外，Banaganapalli等[13]發(fā)現(xiàn)一種新的白藜蘆醇衍生物通過降低NF-κB活性誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。采取加強環(huán)境保護、適宜飲食、適宜體育等措施，一些癌癥是可以預(yù)防的。而白藜蘆醇是一種純天然的抗癌小分子化合物，具有廣泛的生物學(xué)作用，其來源廣泛，虎杖、葡萄中白藜蘆醇的含量較高，且來源于植物提取的白藜蘆醇綠色安全無污染，符合人們對綠色食物的追求。近幾年越來越對的研究顯示白藜蘆醇具有抗多種腫瘤細胞的作用，其中就包括肺癌。對于白藜蘆醇的抗癌作用機制，主要有通過誘導(dǎo)癌細胞周期阻滯在G1/S期進而抑制細胞增殖[14]；另外，白藜蘆醇還可通過調(diào)控腫瘤相關(guān)基因的表達來影響腫瘤細胞的生長[15]。白藜蘆醇的抗癌作用已得到越來越多的認可，其中白藜蘆醇在肺癌的起始、形成、進展3個階段均顯示出抗癌作用。華叢書等[16]研究表明白藜蘆醇抑制肺癌細胞A549的增殖并通過激活p-38MAPK信號通路誘導(dǎo)A549細胞的凋亡。本研究結(jié)果與其一致。白藜蘆醇作為純天然的具有抗癌效應(yīng)的物質(zhì)，其抗癌譜廣且不良反應(yīng)較少，因此在抗腫瘤或化療增敏中具有良好的前景。

NF-κB是一種存在于真核細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，具有高度保守、多項調(diào)節(jié)的特點。NF-κB在各種刺激下均能作出快速反應(yīng)，調(diào)控多種基因的表達，從而參與機體的免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、細胞增殖、分化與凋亡等生理功能，而且NF-κB的過度活化與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系。研究表明在癌細胞的發(fā)生過程中，NF-κB的活性顯著增加[17]。NF-κB是一條與調(diào)控腫瘤相關(guān)的信號通路，有可能是一種很有發(fā)展前景的抗腫瘤的靶點。本研究檢測不同濃度白藜蘆醇對A549細胞增殖的影響，結(jié)果顯示，在濃度為100 μmol/L、150 μmol/L的白藜蘆醇處理A549細胞48 h后，白藜蘆醇能夠明顯地抑制肺癌細胞的增殖，且這種抑制作用具有時間及濃度的依賴性；采用逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測白藜蘆醇對A549細胞NF-κB mRNA 表達的作用和免疫印跡法檢測白藜蘆醇對NF-κB蛋白的影響，結(jié)果顯示，經(jīng)100 μmol/L白藜蘆醇作用后A549細胞48 h可以明顯下調(diào)NF-κB的表達，NF-κB mRNA下降至總mRNA的30%，并且隨著作用時間的延長，這種抑制作用更顯著。提示白藜蘆醇對肺癌A549細胞增殖抑制作用可能與其調(diào)節(jié)NF-κB活性有關(guān)。

綜上所述，白藜蘆醇對肺癌細胞A549具有明顯抑制細胞增殖效應(yīng)，提示白藜蘆醇在肺癌治療中通過明顯下調(diào)NF-κB的表達來達到抑制肺癌細胞A549的增殖的作用，NF-κB作為白藜蘆醇抗癌過程中的一個潛在作用靶點發(fā)揮重要的作用。這個結(jié)果同時表明，白藜蘆醇可以成為有效抑制肺癌的化學(xué)預(yù)防治療藥物。

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(本文編輯：趙麗潔)

Effect of resveratrol on proliferation of lung cancer A549 cells and the expression of NF-κB

YAN Jing-xia1, GUO Yong2, ZHANG Rui1, GUO Wei3, HUA Guo-xiang4, SU Jun-hua1*

(1. Department of Laboratory Medicine, the Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000,China; 2.Department of Medical, the First Hospital of Shijiazhuang City, Hebei Province,Shijiazhuang 050011,China; 3.Department of Laboratory Medicine, the Hospital of Shenzhou City, Hebei Province, Shenzhou 053899, China; 4.Department of Internal Medicine,General Hospital of Handan(Tao Ci) Group, Handan 056011, China)

ObjectiveTo study the effect of resveratrol on proliferation of human lung cancer cell line A549 and the expression of nuclear factor kappa B(NF-κB). MethodsThe effect of resveratrol on the proliferation of A549 cells was detected by methylthiazolyldiphenyl-tetrazoliumbromide(MTT) method. The effect of resveratrol on the expression of mRNA NF-κB in A549 cells was detected by reverse transcription-PCR (RT-PCR). Effect of resveratrol on NF-κB protein levels in lung cancer A549 cells was detected by western blotting. ResultsWith the increase of the concentration of resveratrol，the cell growth inhibition rates in group B, C and D were higher than in that in group A. The cell growth inhibition rates in group C and D were higher than that in group B. The cell growth inhibition rates in group D was higher than that in group C(P<0.05). Cell growth inhibition rate at 24 h and 48 in group B, C and D are higher than that at 12 h. Cell growth inhibition rate at 48 h was higher than that at 24 h(P<0.05). A549 cells with 100 mol/L resveratrol for 48 h can significantly down regulate the expression of NF-kappa mRNA. ConclusionResveratrol can significantly inhibit the proliferation of lung cancer

lung neoplasms; resveratrol; apoptosis; NF-kappa B

2016-03-31；

2016-05-05

河北省科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展指導(dǎo)計劃(152777123)

嚴靜霞(1976-)，女，河北石家莊人，河北醫(yī)科大學(xué)

R734.2

A

1007-3205(2016)09-1064-05

第二醫(yī)院主管檢驗師，醫(yī)學(xué)學(xué)士，從事臨床檢驗學(xué)研究。

A549 cells and the expression of NF-κB.