自體富血小板血漿凝膠雙相接種法構建組織工程骨*

扈延齡　王向陽　王　開　陳　峰　張升波　金　丹

（1青島大學附屬醫(yī)院創(chuàng)傷外科，山東青島266000；2南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院創(chuàng)傷骨科，廣州510515）

自體富血小板血漿凝膠雙相接種法構建組織工程骨*

扈延齡1王向陽1王開1陳峰1張升波1金丹2**

（1青島大學附屬醫(yī)院創(chuàng)傷外科，山東青島266000；2南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院創(chuàng)傷骨科，廣州510515）

背景：使用富血小板血漿（PRP）等凝膠樣物質作為接種介質的雙相接種法可優(yōu)化組織工程骨構建，但PRP的促成骨作用仍存在較大爭議。目的：進一步探討自體PRP凝膠用于雙相接種法構建組織工程骨的可行性，及其促成骨性能。方法：實驗組利用自體PRP凝膠接種骨髓間充質干細胞（MSCs）于β-磷酸三鈣（β-TCP）支架構建組織工程骨，對照組采用常規(guī)的DMEM靜態(tài)接種法構建。體外實驗：通過MTT實驗、堿性磷酸酶（ALP）活性檢測、骨鈣素（OC）放免測定，比較兩種方法對細胞增殖和成骨分化影響。體內實驗：將構建材料植入兔橈骨大段骨缺損，通過組織學觀察、X線檢查、單光子發(fā)射計算機斷層檢查比較兩種方法構建材料的成骨性能。結果：體外實驗表明PRP組MSCs顯示良好的增殖和成骨分化能力，明顯優(yōu)于對照組。體內實驗表明PRP組修復大段骨缺損的能力顯著優(yōu)于對照組。結論：自體PRP具有良好的促成骨性能，可有效構建組織工程骨。

富血小板血漿；骨髓間充質干細胞；組織工程；細胞接種；雙相接種

【Abstract】Background：The platelet-rich plasma（PRP）gels used in the biphasic seeding can optimize the construction of tissue-engineered bone.However，osteogenic capacity of PRP is still in dispute.Objective：To explore the feasibility of constructing tissue-engineered bone by biphasic seeding with autologous PRP gels so as to give more insight to the contradictory osteogenic capacity of PRP.Methods：Autologous PRP gel was applied to inoculate mesenchymal stromal cells（MSCs）into β-tricalcium phosphate（β-TCP）scaffolds to construct tissue engineered bone in PRP group.In control group，tissue engineered bone was established by conventional static seeding using Dulbecco's modified Eagle's medium（DMEM）as cell seeding vehicle.In vitro，proliferation and osteogenic differentiation of MSCs on fabricated constructs were investigated by MTT assay，alkaline phosphatase（ALP）activity and osteocalcin（OC）content.The in vivo bone-forming capacity of the fabricated constructs in rabbit radius was determined by radiography，single photon emission computed tomography and histological analysis.Results：The MSCs in PRP group demonstrated great cell proliferation and osteogenic differentiation in vitro and superior bone formation in vivo as compared with control group.Conclusions：Autologous PRP has a good osteogenic capacity.The biphasic seeding with the use of autologous PRP gel can effectively reconstruct tissue-engineered bones.

【Key words】Platelet-rich plasma； Mesenchymal stromal cells； Tissue engineering； Cell seeding； Biphasic seeding

在組織工程骨構建技術中，使用膠原、纖維蛋白和富血小板血漿（PRP）作為細胞接種介質的雙相接種法可實現(xiàn)細胞與支架即刻復合，還可獲得高接種效率，并為細胞增殖分化提供良好的三維環(huán)境［1-4］。PRP是通過密度梯度離心從新鮮全血中分離出的含有高濃度血小板的血漿成分，其激活后形成含有大量生長因子的纖維蛋白凝膠［5］，由于這些成分已被證實可促進組織再生和修復，故PRP成為骨再生和修復研究領域的熱點。目前研究多支持PRP促成骨作用，且多項臨床研究應用其促進修復骨缺損［6-9］，但PRP的促成骨作用仍存在較大爭議［10，11］。本實驗應用兔自體PRP凝膠作為細胞接種媒介進行雙相接種法構建組織工程骨，體內實驗檢測其對種子細胞的增殖分化影響，體內實驗檢測其構建物修復大段骨缺損的能力，以期進一步檢測自體PRP凝膠用于雙相接種法構建組織工程骨的可行性，并為PRP促成骨性能爭議進一步提供實驗依據。

1　材料與方法

1.1實驗動物和支架材料

30只清潔級新西蘭兔，6月齡，雌雄不限，體重2.0～2.5 kg，由青島市動物實驗中心提供［合格證號：SCXK（魯）20090007］。6只用于體外實驗，24只用于體內試驗。β-磷酸三鈣（β-TCP）支架由貝奧路生物材料有限公司提供，體外實驗為立方體（5 mm×5 mm× 5 mm），體內實驗為圓柱體（直徑4 mm，長度12 mm），支架的孔隙率達75%±10%，且完全相通，平均孔隙直徑為（530±50）μm。

1.2試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)基（Hyclone，公司，美國）；胎牛血清（Hyclone，公司，美國）；二甲亞砜（Amresco公司，美國）；四唑鹽（MTT，Probe生物制品公司，中國）；蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒（碧云天生物技術研究所，中國）；堿性磷酸酶（ALP）檢測試劑盒（南京建成，中國）；骨鈣素（OC）放免試劑盒（北京東亞，中國）；酶標儀（Meter Tech公司；日本）；高速恒溫離心機（Hitachi公司，日本）；石蠟切片機（Leica，德國）；Image-Pro Plus（IPP）圖像處理分析軟件（Media Cybernetics公司，美國）。

1.3實驗方法

1.3.1體外實驗

1.3.1.1兔骨髓間充質干細胞（MSCs）的分離擴增與誘導分化：取6只兔，分別從髂骨上各抽取5 ml骨髓，置于含15000 U肝素和10ml DMEM離心管中，離心過濾后接種入培養(yǎng)瓶內，加含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，置37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，每3天換液，待原代細胞長至80%融合后，用0.25%胰酶分離細胞進行傳代培養(yǎng)，取第3代細胞用于實驗。不同兔來源的MSCs分別獨立培養(yǎng)。

1.3.1.2自體PRP的制備：用裝有1 ml 10%枸櫞酸鈉抗凝劑的注射器抽取同一只兔（取骨髓者）耳背中央動脈血10 ml，采用二次離心法制備PRP。20℃下800 r/m離心15 min，吸取上部血漿轉移至另一離心管中，20℃下2000 r/m離心15 min，吸取上部含有極少量未沉降血小板的血漿層，剩余血漿及血細胞成份即為PRP。血小板計數檢查示外周血血小板（201± 23）×103/μl，PRP血小板計數是（1056±106）×103/μl。

1.3.1.3細胞接種及體外培養(yǎng)：自體PRP凝膠雙相接種法組（PRP組）：將PRP、第3代MSCs細胞懸液（1× 107/ml），激活劑（含1000 U/ml凝血酶的10%氯化鈣溶液）按體積比7：2：1混勻，制成細胞密度約為2×106/ml混合懸液，迅速以微量移液器在立方體β-TCP支架中滴入100 μl懸液，繼續(xù)用成骨誘導培養(yǎng)液在37℃、5% CO2飽和濕度條件培養(yǎng)。常規(guī)靜態(tài)接種法組（DMEM組）作為對照，于每塊支架滴入100 μl相同細胞濃度的DMEM細胞懸液，培養(yǎng)條件同上。體外培養(yǎng)2周，每3天換液。

1.3.1.4.MTT試驗：分別于培養(yǎng)后第1、7、14天棄原培養(yǎng)基，加入無血清DMEM 1 ml和5 mg/ml MTT100μl，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h，小心吸去培養(yǎng)孔內的上清液，加入二甲基亞砜0.5 ml，振蕩15 min。以酶標儀測570nm處吸光度值（OD值），參考波長630 nm。

1.3.1.5ALP活性檢測：于培養(yǎng)后第1、7、14天棄原培養(yǎng)基，每孔加入200μl 1%Triton X-100，并反復凍融3次。取10μl的細胞裂解液至96孔板，雙蒸水空白調零，按ALP試劑盒操作說明加入等量緩沖液和基質液，37℃水浴15 min，加顯色劑，酶標儀測波長490 nm處吸光度值。根據公式算出ALP比活性：ALP（金氏單位/100ml）=測定管吸光度/標準管吸光度×標準管含酚的量（0.5μg）×100 ml/0.05 ml。

1.3.1.6 OC含量檢測：于培養(yǎng)后第1、7、14天，按照OC放免試劑盒說明將細胞裂解液、125I標記OC抗體各100μl混合，4℃下放置24 h，加分離劑混勻后室溫下放置20 min，4℃離心棄上清，檢測沉淀物放射劑量。

1.3.2體內實驗

1.3.2.1組織工程骨體外構建：取24只兔隨機分為PRP組和DMEM組，每組根據取材時間再分為兩個亞組：6周組和12周組。按照體外實驗所述方法分離擴增兔MSCs及制備自體PRP。為進行成骨誘導分化，將第3代MSCs用DMEM條件培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1×10-8mol/L地塞米松、10 mmol/Lβ-甘油磷酸鈉、50 mg/L抗壞血酸）誘導培養(yǎng)2周。PRP組使用自體PRP凝膠雙相接種法接種成骨誘導分化MSCs于圓柱體β-TCP支架，DMEM組使用常規(guī)靜態(tài)接種法作為對照。

1.3.2.2建立動物模型并植入構建組織工程骨：3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）耳緣靜脈注射麻醉，仰臥位固定，左前臂脫毛，2.5%碘酒消毒。于前臂橈側中段縱行切口，逐層顯露橈骨中段，線鋸切除包括骨膜的長約12 mm骨質，將構建組織工程骨植入骨缺損處。為便于組織學取材，在構建復合體長軸中點處用7號線做標記。于術后第6和12周進行檢測。

1.3.2.3 X線檢查：行前上肢X線檢查。透視條件：45 KV，125 mA，32 ms，距離100 cm。將獲得X線片分析和評分。

1.3.2.4單光子發(fā)射計算機斷層檢查（SPECT）：將劑量為20 MBq/kg的99mTc-MDP經兔耳緣靜脈注入。4小時后，行SPECT檢查，觀察移植骨處和同側肱骨中段成像，定量分析兩個區(qū)域的99mTc-MDP攝取率。

1.3.2.5組織學觀察：處死動物獲得標本，行大體觀察后常規(guī)固定脫鈣、石蠟包埋。分別沿移植物長軸的1/4，1/2和3/4部位制備5 μm厚切片，行HE染色，經IPP圖像處理分析系統(tǒng)計算新生骨面積百分比，將每塊標本的3張切片所得的百分比取平均值。

1.4統(tǒng)計學分析

實驗數據以均數±標準差表示，采用SPSS 13.0軟件行獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1MTT 試驗

兩組吸光度隨時間延長均增加，同一時間點PRP組吸光度顯著性高于DMEM組（表1）。

表1　體外實驗檢測結果（，n=6）

注：與DMEM組比較，★P＜0.05

時間OD值PRP組0.927±0.239★1.912±0.398★4.609±0.756★DMEM組0.663±0.107 1.012±0.195 2.043±0.1781 d 7 d 14 d ALP活性（u/ml）PRP組2.588±0.364★6.822±1.057★9.765±1.969★DMEM組1.334±0.157 2.592±0.553 3.571±1.041 OC含量（ng/ml）PRP組-5.781±1.261★11.063±1.898★DMEM組-2.206±0.607 5.278±1.461

2.2ALP 活性檢測

培養(yǎng)第1天，兩組ALP活性均無明顯升高，第7，14天，ALP活性均逐漸升高，且同一時間點PRP組顯著性高于DMEM組（表1）。

2.3OC 含量

培養(yǎng)第1天，兩組均未測得骨鈣素，在第7，14天，OC含量均逐漸升高，且同一時間點PRP組顯著性高于DMEM組（表1）。

2.4X線檢查

術后6周，兩組骨缺損處均可見植入物高密度影，PRP組植入物與與截骨部間隙變模糊，DMEM組連接部位明顯透光影，術后12周，PRP組見植入物與截骨兩端骨性連接，而DMEM組愈合較差，連接部位模糊，但仍可分辨（圖1）。兩組影像學評分隨時間增加而升高，且同一時間PRP組顯著性高于DMEM組（表2）。

2.5SPECT 檢查

在各時間點，PRP組植入物部位對99mTc-MDP攝取均顯著性高于DMEM組（圖2、表2）。

2.6組織學表現(xiàn)

大體觀查：術后6周，見兩組植入物表面有骨痂組織生成，但β-TCP材料仍外露，PRP組植入物兩端新生骨組織多于DMEM組，術后12周可見PRP組植入物表面完全被骨痂包繞，兩端與截骨部位骨性融合，界限不明顯，DMEM組仍可見少量β-TCP材料外露，植入物兩端新生骨組織明顯較PRP組少。光鏡觀察：在術后6和12周，兩組植入物均表現(xiàn)為同樣的組織學過程，β-TCP漸降解，新生骨組織漸生成，但PRP組的新生骨生成速度和量明顯高于DMEM組（圖3，表2）。

3　討論

種子細胞、支架材料和組織構建技術構成了組織工程三要素。其中組織構建技術是指如何將種子細胞接種于支架材料上并將其培育的技術。如何提高接種效率、提高組織塊中細胞密度并改善細胞在支架中分布狀況仍是組織工程骨制備中尚未很好解決的技術難題。盡管對接種方法進行了大量探索［12，13］，但目前組織工程研究中最常用的接種方法為靜態(tài)接種法，其優(yōu)勢在于適用于任何類別種子細胞和支架材料，且操作方法簡單。但該方法也有不足之處，如接種效率不高造成種子細胞浪費。有研究報道使用膠原、纖維蛋白和PRP等物質進行雙相接種，即將細胞-凝膠復合物接種到固態(tài)三維支架上，其滲透入支架內部后再用催化劑使其固化，獲得細胞-凝膠-支架復合物。該方法可獲得高接種效率和接種數量而改善靜態(tài)接種法，并為細胞的增殖分化提供良好的三維環(huán)境。

富血小板血漿經激活后可形成具有立體網狀結構的纖維蛋白凝膠，同時釋放大量生長因子，包括血小板源性生長因子（PDGF）、轉移生長因子（TGF）、血管內皮生長因子（VEGF）、表皮生長因子（EGF）等［6］。這些生長因子在PRP中濃度很高，約為體內正常濃度的幾倍甚至幾百倍，其中含量最多及最重要的是PDGF和TGF-β。研究證實纖維蛋白凝膠易于降解，生物相容性好，可以作為細胞或生長因子的理想載體。PDGF、TGF-β在骨折愈合中有重要作用，而VEGF有明顯促進新生血管形成作用，均有利于骨組織的修復。目前體外實驗已證實PRP可促進MSCs增殖，但PRP對MSCs的誘導分化作用仍有有爭議。并且PRP對體內促進骨再生的作用亦未達成共識，盡管有學者認為PRP對骨缺損的修復作用并不顯著［10，11］，但大多數學者支持PRP促進骨再生作用，并且已有臨床報道將PRP應用于促進骨再生［6-9］。

表2　體內實驗檢測結果（，n=6）

表2　體內實驗檢測結果（，n=6）

注：與DMEM組比較，★P＜0.05

X線評分PRP組5.037±0.616★9.863±1.017★DMEM組3.087±0.252 7.312±0.7366周12周99mTc-MDP攝取量PRP組8.168±0.968★12.517±1.692★DMEM組6.011±0.531 9.722±0.963新生骨面積（%）PRP組20.712±1.265★42.106±3.719★DMEM組10.011±1.356 29.675±2.565

圖1　PRP組（A、C）和DMEM組（B、D）在術后6周（A、B）和12周（C、D）修復骨缺損的X線檢查

圖2　PRP組（A、C）和DMEM組（B、D）在術后6周（A、B）和12周（C、D）的SPECT檢查

圖3　PRP組（A、C）和DMEM組（B、D）在術后6周（A、B）和12周（C、D）的組織學觀察（HE染色，×100，TB為新生骨組織，TCP為磷酸三鈣材料）

本實驗探討采用自體PRP凝膠作為種子細胞接種媒介進行雙相接種法構建組織工程骨。體外MTT檢測顯示細胞在PRP凝膠環(huán)境中增殖良好。ALP活性檢測顯示在PRP組細胞在本實驗各檢測時間點均明顯優(yōu)于DMEM組。對于OC測定，在培養(yǎng)1天時兩組均未檢測到，這與骨鈣素為晚期成骨因子有關，在培養(yǎng)7和14天時PRP組骨鈣素含量均明顯優(yōu)于DMEM組，這說明PRP凝膠可提供促進細胞成骨分化的微環(huán)境。對于體內成骨性能，本實驗采用了大段骨缺損模型，X線、SPECT和組織學觀察表明PRP組構建材料能加速骨折愈合和骨重建。

目前報道的PRP促成骨作用的實驗研究結果不一致，其原因與PRP制備方法、實驗動物模型、合用移植材料等因素有關。目前認為PRP中血小板濃度PRP與其生物活性關系密切，PRP制備方法決定PRP中血小板濃度。Weibrich等［14］指出，當PRP的血小板濃度大約1×106/μl時，其生物學效應最強。濃度較低，效果不佳，而高濃度的血小板則抑制MSCs的增殖與分化。理想的血小板濃度應為為基礎濃度的3～5倍。在本研究中，PRP中血小板計數為（1056±106）× 103，濃縮倍數為（525±36）%，這也是本試驗成功的重要因素。

生長因子在組織工程骨構建中的作用已得到眾多研究證實［15，16］。但目前如何將保持活性的生長因子有效的復合在生物材料上仍是尚需解決的難點，并且現(xiàn)多用單一生長因子進行研究，無法發(fā)揮多種生長因子的協(xié)同作用。PRP凝膠具有可協(xié)同發(fā)揮作用的生長因子和纖維蛋白三維立體網架結構，可為種子細胞增殖、分化和功能表達的提供良好環(huán)境。使用自體PRP凝膠接種MSCs于多孔支架材料，構建組織工程骨具有骨傳導性、骨誘導性和種子細胞，這些正是理想骨移植材料所要求的元素。此外本研究采用自體PRP，可排除免疫因素干擾，且制備簡便，價格低廉。

綜上所述，本實驗結果表明自體PRP具有良好的促進成骨的性能，其凝膠可作為接種媒介用于雙相接種法構建組織工程骨。

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Autologous platelet-rich plasma gel used in constructing tissue-engineered bone by biphasic seeding method*

HU Yanling1，WANG Xiangyang1，WANG Kai1，CHEN Feng1，ZHANG Shengbo1，JIN Dan2**
（1.Department of Trauma Surgery，Affiliated Hospital of Qingdao University，Qingdao 266000，Shandong；2.Department of Orthopedics and Traumatology，Nanfang Hospital，Southern Medical University，Guangzhou 510515，China）

2095-9958（2016）04-0165-05

10.3969/j.issn.2095-9958.2016.02-16】Platelet-rich plasma；Mesenchymal stromal cells；Tissue engineering；Cell seeding；Biphasic seeding

山東省高等學?？萍加媱濏椖浚∟o.J11LF22）

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金丹，E-mail：nfjindan@126.com