具ACE抑制活性的油茶餅粕酶解物的制備及分離表征

高剛峰，陳勇強，陳養(yǎng)，陳莉，沈雙玲

（1.三明市生物醫(yī)藥及生物產(chǎn)業(yè)工作辦公室， 福建 三明 365000；2.福建省農(nóng)產(chǎn)品加工推廣總站，福建 福州 350001；3.尤溪縣林業(yè)局，福建 尤溪 365100）

具ACE抑制活性的油茶餅粕酶解物的制備及分離表征

高剛峰1，陳勇強2，陳養(yǎng)3，陳莉1，沈雙玲1

（1.三明市生物醫(yī)藥及生物產(chǎn)業(yè)工作辦公室， 福建 三明 365000；2.福建省農(nóng)產(chǎn)品加工推廣總站，福建 福州 350001；3.尤溪縣林業(yè)局，福建 尤溪 365100）

以油茶餅粕為原料，研究通過5種蛋白酶水解制備的茶粕酶解物ACE抑制率隨酶解時間的變化規(guī)律，結果表明除蛋白酶C外，其余4種蛋白酶水解的茶粕酶解物ACE抑制率隨酶解時間呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢。比較不同蛋白酶水解的茶粕酶解物ACE抑制活性得出經(jīng)蛋白酶A水解后的茶粕酶解物具有較高的ACE抑制率（94.4%）；為獲得高純度并具有高ACE抑制活性的酶解組分，文章采用CM-SephadexC-25陽離子交換色譜和RP-HPLC純化經(jīng)蛋白酶A酶解的茶粕酶解物。由CM-SephadexC-25陽離子交換色譜分離得到一個組分A，通過RP-HPLC進一步分離組分A得到6個組分。對ACE抑制率最高的組分A-2 進行RP-HPLC二次純化，得出該分離組分達到色譜純，其半數(shù)抑制濃度（IC50）為98μg.mL-1。

油茶餅粕；ACE抑制率；RP-HPLC

ACE抑制活性物質通過抑制ACE活性達到降血壓的作用。它們對ACE活性區(qū)域的親和力大于血管緊張素I(Angiotensin I)和緩激肽(BradykininI)對ACE的親和力，并且一旦和ACE活性區(qū)域結合就難于釋放，從而阻礙ACE催化水解血管緊張素I(AngiotensinI)成為血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ)以及催化水解緩激肽(Bradykinin)成為失活片段的兩種生化反應過程，起到降血壓的作用[1,2]。目前，微生物發(fā)酵或蛋白酶水解是生產(chǎn)ACE抑制活性物質的最常用的方法，其次還有從自溶產(chǎn)物中提取、DNA重組技術及化學合成等方法[3-6]。酶法水解是目前獲得ACE抑制活性物質的主要途徑，該方法的優(yōu)點是生產(chǎn)成本低，而且產(chǎn)品的安全性高，無副作用。

茶籽餅又名油茶餅粕，別名茶麩、茶枯，呈紫褐色顆粒，是野山茶油果實榨油后剩下的渣，其數(shù)量相當于茶油的3倍。我國年產(chǎn)茶油約15萬t，茶籽餅約50萬t[6]。用有機溶劑將茶籽餅進行進一步提油后的殘渣即為茶粕。全國每年有榨油后剩下的約50萬t。根據(jù)分析測定，油茶餅粕中富含蛋白質、脂肪、淀粉、茶皂素、粗纖維，茶粕蛋白質中含有18種氨基酸，包括畜禽生長所需的10種必需氨基酸，其中蘇氨酸、谷氨酸、組氨酸和精氨酸等含量較為豐富[1，8]。但由于茶粕味苦有毒，目前基本上被廢棄，造成了很大的資源浪費。因此，文章擬對茶粕進行深度開發(fā)和利用，通過酶解技術制備具ACE抑制活性的茶粕酶解物，再經(jīng)過色譜等分離方法對酶解產(chǎn)物的ACE活性活性物質進行分離和表征。

表1 酶解處理表

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 材料和藥品

油茶餅粕，沈郎食用油公司提供，粉碎過篩待用；蛋白酶A、蛋白酶B、蛋白酶C、蛋白酶D和蛋白酶E，丹麥NOVE公司；馬尿酰組氨酰亮氨酸（HHL）、血管緊張素轉化酶（ACE），Sigma公司。

1.1.2 儀器和設備

HH-8型數(shù)顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；V-1200型可見光分光光度計：上海美譜達儀器有限公司； SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；ML-902型磁力攪拌器：上海浦江分析儀器廠；TDL-5-A型臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；868型pH計：Orion Research公司；KQ-250E型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；TE601-L型，BS110S型電子天平：北京賽多科斯天平有限公司；EasySepTM-1010型高效液相色譜儀：上海通微分析技術有限公司；CM-SephadexC-25陽離子交換柱：上海賀寶化工有限公司；BS-100A型自動部分收集器：上海滬西分析儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 茶粕酶解物的制備

將底物濃度為2.5%的茶粕置于250mL三角瓶中，采用表1的處理方法進行酶解，水解在恒溫水浴振蕩器中進行。反應結束后，將反應體系在85℃下加熱使酶失活。

1.2.2 茶粕酶解物的分離純化

1.2.2.1 離心和微濾

酶解液經(jīng)過離心機4000r.min-1離心10min，收集上清液；將上清液經(jīng)過膜孔徑為0.2um的無機膜微濾，收集濾液供后續(xù)分離操作。

1.2.2.2 離子交換層析初步分離

陽離子交換樹脂預處理參照趙永芳[9]方法，采用濕法填柱。

將濾液（經(jīng)過透析除鹽）20mL上樣至CMSephadexC-25陽離子層析柱，分離條件為：凝膠柱φ1.6×15cm，洗脫液0.02mol.L-1pH3.8醋酸-醋酸鈉緩沖溶液和1mol.L-1氯化鈉溶液，氯化鈉線性洗脫梯度0～ mol.L-1，流速為0.5mL.min-1，每管收集時間為10mL，檢測波長為220nm。

1.2.2.3 RP-HPLC分離純化

[10]并略作改動。將經(jīng)離子交換層析分離的組分凍干，適當稀釋后采用RP-HPLC進一步分離。色譜條件：色譜柱EasySepTMC18 分析型色譜柱（5um4.6?250mm），檢測波長220nm，柱溫25℃；流速1mL.min-1；洗脫條件：0～5min，100%A；5～20min，100%A～60%A；20～30min，60%A～100%B；30～50min，100%B（A：0.05%TFA+5%乙腈，B：80%乙睛+0.05%TFA）。收集各組分峰，重復進樣，收集多次，冷凍干燥，并測定每個組分峰的ACE抑制活性。經(jīng) RP-HPLC一次制備的具有最高ACE抑制活性的組分再次進行二次純化。

1.2.3 茶粕酶解物水解度的測定

參考文獻甲醛滴定法[8]

1.2.4 ACE抑制活性的測定

ACE抑制率根據(jù)參考文獻[11]和[12]的方法測定，ACE半數(shù)抑制濃度(IC50)的測定參考文獻[13]。

2 結果與分析

2.1 酶解時間與ACE抑制率的關系

5種蛋白酶酶解的茶粕酶解物ACE抑制率和水解度隨酶解時間的變化趨勢見圖1。

從圖1可以看出，水解度隨著時間的延長而增大，符合酶解的一般規(guī)律；但是，茶粕酶解物的ACE抑制率并不隨時間增加而增大，除蛋白酶C外，其余四種蛋白酶酶解的茶粕酶解物ACE抑制率隨酶解時間的延長呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢。原因可能是：隨著酶解時間的延長，原來酶解出的具有ACE抑制活性的物質被進一步酶解，酶解物的端基和肽鏈長度等發(fā)生了變化，使得之前酶解出的物質失去了原有的ACE抑制活性，所以，ACE抑制活性不會隨著氨基氮含量呈先增加后穩(wěn)定的趨勢變化。從圖中還可以看出，不同酶解時間所獲得的茶粕酶解物都體現(xiàn)出一定的ACE抑制活性，即存在著多種ACE活性抑制物質。這一現(xiàn)象與吳建平等人的報道基本一致[14]，即ACE是一類專一性相對較弱的酶，在蛋白質經(jīng)酶解后的酶解物中，存在著多種ACE抑制活性物質，這些ACE抑制活性物質并非是簡單的或有或無。

2.2 不同蛋白酶酶解的茶粕酶解物ACE抑制率的對比分析

由圖2可知，沒有經(jīng)過酶解的茶粕提取液就存在74.5%的ACE抑制率，說明茶粕提取液本身就含有一定的ACE抑制活性物質。茶粕經(jīng)蛋白酶酶解后，抑制率均有所提高，最高提高了27%，說明酶解液中有ACE抑制活性物質的存在。五種酶水解后的ACE抑制活性大小依次為：蛋白酶A＞蛋白酶D＞蛋白酶E＞蛋白酶C＞蛋白酶B；從氨基氮含量來看，蛋白酶C水解后氨基氮含量最高。相比之下，其他酶解液的氨基氮含量偏低，尤其蛋白酶D，其氨基氮含量只有0.037mg.mL-1，但抑制率就高達92.8%。

ACE抑制肽大約包含2～12個氨基酸殘基，有研究表明分子質量小利于肽在體內的吸收利用，但也有極個別的由27個氨基酸組成的降血壓肽被發(fā)現(xiàn)。降血壓肽的抑制活性與其氨基酸結構和組成密切相關。經(jīng)研究認為ACE抑制肽的抑制活性主要取決于C端氨基酸， C端氨基酸為芳香族氨基酸（包括色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和脯氨酸）時，其抑制活性較高。而且，C端殘基上帶正電荷的氨基酸的存在可以顯著增強降壓肽的抑制活性，如精氨酸（胍基）。此外，ACE抑制肽的疏水性也是影響其活性的重要因素，高親水性使其無法接近ACE活性部位而導致弱或無活性。這些對ACE抑制肽的結構分析還局限于對已知氨基酸序列的肽進行定性的分析，許多肽并不符合這些研究結果，確切的構效關系模型至今仍未建立，有待進一步的研究[1,15]。

蛋白酶B、C氨基氮含量高，但ACE抑制率偏低，這可能與這兩種酶是具有內切蛋白酶和外切蛋白酶兩種活性酶有關。內切酶和外切酶同時存在于一個酶解反應體系時，對增加酶解物中氨基酸的量和改善酶蛋白多肽的風味有好處，但可能不利于制備功能活性物質[16]。

蛋白酶A、蛋白酶D和蛋白酶E酶解液的ACE抑制率均很高是由于這些酶的酶切位點均含有芳香族的氨基酸，這些氨基酸都具有ACE抑制活性。例如：蛋白酶D酶切位點所形成的氨基酸殘基中苯丙氨酸、色氨酸均是ACE抑制肽的端基組成，并且酶切后形成的丙氨酸殘基是疏水性氨基酸，酪氨酸殘基是帶正電荷的氨基酸殘基，這都有利于增強ACE抑制的活性，所以蛋白酶D酶解后的茶粕酶解物ACE抑制性很高。

2.3 茶粕酶解物的分離純化

2.3.1 離子交換層析分離茶粕酶解物

茶粕經(jīng)蛋白酶酶解的產(chǎn)物經(jīng)CM-SephadexC-25陽離子交換層析分離的色譜見圖3。從圖3中可以看出分離結果只有一個峰A，其220nm的吸光值為0.409。

2.3.2 RP-HPLC分離純化組分A

將CM-SephadexC-25陽離子交換層析分離得到的A組分進行RP-HPLC進一步分離，分離結果見圖4。組分A經(jīng)RP-HPLC分離得到6個分離組分，分別標記為：A-1、A-2、A-3、A-4、A-5和A-6。測定各分離組分ACE抑制率見表2。

表2 RP-HPLC各分離組分的ACE抑制率

根據(jù)表2結果，組分A-2的ACE抑制率最高。將組分A-2進行RP-HPLC二次純化，結果見圖5。由圖5可知，組分A-2基本達到色譜純。

3 結論

5種蛋白酶（蛋白酶A、蛋白酶B、蛋白酶C、蛋白酶D和蛋白酶E）酶解后的茶粕酶解物ACE抑制率和氨基氮含量隨酶解時間的變化規(guī)律為：氨基氮含量隨酶解時間呈現(xiàn)先增加后穩(wěn)定的變化趨勢，而酶解產(chǎn)物的ACE抑制率并沒有隨氨基氮含量的增加而增加；除了蛋白酶C外，其他4種蛋白酶的酶解液ACE抑制率都是隨著時間的延長呈現(xiàn)先增加后減小的變化趨勢，蛋白酶C的酶解產(chǎn)物則是隨時間呈現(xiàn)波動變化。5種蛋白酶水解產(chǎn)物的ACE抑制活性大小依次為：蛋白酶A＞蛋白酶D＞蛋白酶E＞蛋白酶C＞蛋白酶B。其中，經(jīng)蛋白酶A水解后的酶解產(chǎn)物ACE抑制率最高，達到94.4%，對應的氨基氮含量為0.048mg.mL-1。

采用CM-SephadexC-25陽離子交換色譜和RPHPLC純化經(jīng)蛋白酶A酶解的茶粕酶解物。由CMSephadexC-25陽離子交換色譜分離得到一個組分A，通過RP-HPLC進一步分離組分A得到6個組分。對ACE抑制率最高的組分A-2 進行RP-HPLC二次純化，分離圖譜為單峰，說明該分離組分達到色譜純，其半數(shù)抑制濃度(IC50) 為98μg.mL-1。

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Q555

A

1007-550X（2016）01-0043-05

10.3969/j.issn.1007-550X.2016.01.001

2015-11-24

高剛峰（1964-），男，高級工程師。