蛋白質印跡模板的制備及在尿液蛋白測定中的應用

邢建華，薄 惠，張 強

(黃河科技學院醫(yī)學院，河南鄭州 450063)

分子印跡(Msolecular Imprinted,MI)技術是從高分子聚合物領域發(fā)展而來的一項分子特異性識別技術，利用模板分子在印跡聚合物上形成空穴，對印跡分子產(chǎn)生特異性識別，當印跡分子再次遇到模板分子時就能夠對模板分子產(chǎn)生特異性吸附。目前，MI技術已經(jīng)成功應用到藥物分離分析[1]、牛奶中三聚氰胺的檢測[2]、薰衣草精油中樟腦的提取[3]、瓜果蔬菜中殘留農藥的檢測[4]等方面，但在DNA、蛋白質等生物大分子的測定方面研究較少。

經(jīng)典的蛋白質測定方法主要有Lowry法[5]、Bradford法[6]及溴酚藍法[7]等，這些方法存在靈敏度低或線性范圍窄等缺點。近年來，建立了一些測定蛋白質的新方法，如分光光度法[8 - 10]、熒光光度法[11,12]、化學發(fā)光法[13,14]、分子探針熒光光譜法[15]及共振光散射法[16]等。人尿中的蛋白質含量測定是慢性腎炎、紫癜性腎炎、狼瘡性腎炎、糖尿病腎病等典型的診斷標準之一。因此制備牛血清白蛋白分子印跡模板，進行吸附-解吸，去除人尿中的共存干擾物質，建立人尿中蛋白質的測定方法，具有十分重要的意義。本文以牛血清蛋白(BSA)為分子模板，甲基丙烯酸(MAA)為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDGMA)為交聯(lián)劑，偶氮二異丁腈(AIBN)為引發(fā)劑制備的BSA分子印跡模板，具有較強的選擇性，適用于復雜樣品中蛋白質的分離分析。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

TU-1810型紫外可見分光光度計(北京普析通用)；HH-2恒溫水浴鍋(上海博訊)；AHS-1064烘箱(吳江華東標準烘箱公司)；pHS-3C型酸度計(上海儀田精密儀器有限公司)。

牛血清蛋白(BSA,美國Amresco公司,含量：98%)；甲基丙烯酸(MAA)、偶氮二異丁腈(AIBN)、二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDGMA)，均購于阿拉丁試劑有限公司，其余試劑均為分析純。實驗用水為蒸餾水。

1.2 實驗方法

1.2.1BSA分子印跡模板的制備取0.5 g BSA于錐形瓶中，加入15 mL的乙酸∶甲醇(1∶1，V/V)混合溶液，超聲5 min溶解后，加入0.338 mL MAA，超聲10 min使其作用完全。最后加入6.93 mL EDGMA和20 mg AIBN混勻，通氮氣15 min除氧，密封反應容器，恒溫水浴鍋內60 ℃反應24 h后取出，將生成的聚合物研磨后過篩。取100目和200目之間的聚合物，用0.1 mol/L的NaOH溶液連續(xù)洗脫約12 h，至洗脫液用紫外法檢測不到BSA為止。洗脫后的聚合物用水和無水乙醇各洗三遍，晾干，備用。

1.2.2BSA印跡聚合物的吸附試驗方法在100 mL 2 g/L的BSA水溶液中，加入1.00 g BSA印跡模板，吸附平衡后，于280 nm波長處測定吸光度，利用公式：Q=(c0-c1)V/m計算吸附容量。其中c0表示初始BSA的濃度(mg/mL),c1表示加入印跡分子之后的濃度(mg/mL)，V是BSA溶液的體積(mL)，m是加入印跡分子的質量(g)。

1.2.3人尿中蛋白質的測定方法取新鮮人尿20 mL,置干燥離心管中，以3 000 r/min離心20 min,精密吸取上清液5 mL，加入pH=5.2的緩沖溶液5 mL制成尿樣待測液，加入BSA分子印跡模板300 mg,吸附完全后，用pH=5.6的磷酸鹽緩沖溶液洗滌三次，每次10 mL，合并洗滌液于100 mL容量瓶中，定容。用紫外-可見分光光度計在280 nm波長處測定吸光度，代入工作曲線，計算蛋白質含量。

2 結果與討論

2.1 功能單體的選擇

分子印跡技術中常用的功能單體有丙烯酰胺、甲基丙稀酸、4-乙烯基吡啶等。實驗分別以該三種功能單體制備了印跡模板，測定了三種模板對蛋白質的吸附容量，結果分別為：12.8 mg/g、67.4 mg/g和34.7 mg/g。由結果可知，甲基丙烯酸作為功能單體制備的分子印跡模板吸附容量最大，因此選擇甲基丙烯酸作為蛋白質分子印跡模板制備過程中的功能單體。

2.2 吸附時間的選擇

采用1.2.2方法，吸附一定時間后，測定吸光度值，結果示于圖1。由圖1可知，吸光度在120 min后變化較小，說明120 min時吸附到達平衡，因此，選擇吸附時間120 min。

2.3 pH值的影響

配制不同pH值的磷酸鹽緩沖溶液作為配制蛋白質溶液的溶劑，考察不同pH值下蛋白質印跡模板對蛋白質的吸附作用。采用1.2.2方法測定了不同pH值下吸附后蛋白質溶液的吸光度，結果示于圖2。由圖2可知，pH=5.6時吸光度值最大，表明此時吸附量最??；在pH值5.2時吸光度最小，表明此時吸附量最大。因此，pH=5.2磷酸鹽緩沖溶液適合作為吸附溶液，pH=5.6的緩沖溶液適合作為洗脫劑。

2.4 吸附溫度的選擇

采用1.2.2方法，考察了不同溫度下的吸附量，結果顯示，10～30 ℃吸附容量無明顯變化，高于30 ℃吸附容量下降，可能是溫度升高蛋白質結構發(fā)生了變化，所以測定在室溫下進行即可。

2.5 吸附容量的考察

配制不同濃度的蛋白質溶液，采用1.2.2方法測定蛋白質分子模板對不同濃度蛋白質溶液的吸附量，結果如圖3所示。由圖3可知，隨著蛋白質溶液的濃度增大，吸附容量增大，最大吸附容量為72 mg/g。

2.6 工作曲線與檢測限

用pH=5.6的磷酸鹽緩沖溶液作為溶劑，配制一系列不同濃度的蛋白質溶液。測定不同濃度蛋白質溶液在280 nm波長處的吸光度A，以吸光度A對濃度c作圖，結果表明蛋白質濃度在0.2022～2.022 mg/mL之間與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關系，線性方程為：A=0.0111+0.587c相關系數(shù)為0.9997。檢測限為0.124 mg/mL。

2.7 干擾試驗

配制2 g/L的人尿中可能存在的共存物質溶液代替蛋白質溶液，采用1.2.2方法進行試驗，其吸附容量示于表1。由表1可知，除半胱氨酸外，蛋白質分子印跡模板對其它共存物質無明顯吸附，雖然半胱氨酸的吸附容量較大，但半胱氨酸在280 nm處無明顯的吸收，所以對測定結果的準確度無影響。

表1 選擇性試驗

2.8 樣品的測定與回收率

按1.2.3方法取樣測定，并用考馬斯亮藍法進行對照，結果見表2。采用標準加入法進行回收率試驗，結果見表3。由表2、表3可知，本文所建立的方法具有較好的準確度和精密度。

表2 人尿中蛋白質測定結果(n=5)

表3 回收率試驗(n=5)

3 結論

合成了蛋白質分子印跡模板，并用它吸附人尿中的蛋白質，洗脫后進行測定。結果表明，該方法成功地除去共存的干擾物質，具有測定專屬性強、靈敏度高、準確度較高等特點。該方法用于人尿中蛋白質的測定，結果滿意。