用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)研究禁用物質(zhì)氫氯噻嗪在人尿中的代謝情況

馬艷華 閆寬 董穎

國(guó)家體育總局反興奮劑中心（北京100029）

用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)研究禁用物質(zhì)氫氯噻嗪在人尿中的代謝情況

馬艷華 閆寬 董穎

國(guó)家體育總局反興奮劑中心（北京100029）

目的：使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法研究口服利尿劑氫氯噻嗪（Hydrochlorothiazide）后，尿樣中藥物原形、其代謝物氯噻嗪（Chlorothiazide）和降解產(chǎn)物4-氨基-6-氯-1，3苯二磺酰氯（4-Amino-6-chlorobenzene-1，3-disulphonamide）的代謝規(guī)律和檢測(cè)窗口期。方法：選取男女各1名年齡為26歲和27歲的健康志愿者，進(jìn)行氫氯噻嗪人體受試實(shí)驗(yàn)，收集服藥前的空白尿和服藥后3天內(nèi)的所有尿樣，以及之后14天的晨尿。尿樣經(jīng)同等體積的5%醋酸鉛水溶液沉淀蛋白質(zhì)后，上清液用多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)模式（MRM）直接進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果：氫氯噻嗪、氯噻嗪和4-氨基-6-氯-1，3苯二磺酰氯的檢測(cè)限分別為2.5、1和5 ng/ml；定量限分別為10、3和15 ng/ml；3種藥物在低、中和高3個(gè)濃度的日內(nèi)和日間精密度均小于10%；準(zhǔn)確度均介于88%至110%之間；平均基質(zhì)效應(yīng)在75%～120%范圍內(nèi)。對(duì)受試者的尿樣進(jìn)行分析后，發(fā)現(xiàn)氫氯噻嗪原形的檢測(cè)窗口期為7天，代謝物氯噻嗪的檢測(cè)窗口期為3天，降解產(chǎn)物ACB的檢出時(shí)間為13天。結(jié)論：該檢測(cè)方法對(duì)氫氯噻嗪原形、其代謝物氯噻嗪和降解產(chǎn)物ACB具有前處理簡(jiǎn)單、靈敏度高、準(zhǔn)確可靠和重現(xiàn)性好等特點(diǎn)。與之前的文獻(xiàn)相比，3種禁用物質(zhì)的檢測(cè)窗口期都有不同程度的延長(zhǎng)。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；人體受試；氫氯噻嗪；代謝曲線；興奮劑控制

氫氯噻嗪（Hydrochlorothiazide，簡(jiǎn)稱“HCT”）為中等強(qiáng)度利尿劑，既能快速減輕體重，又能稀釋尿液以掩蔽其它禁用物質(zhì)的濫用，因此，被世界反興奮劑機(jī)構(gòu)（WADA）列為利尿劑和掩蔽劑類禁用物質(zhì)。縱觀WADA近十年的年度檢查統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，我們不難發(fā)現(xiàn)，氫氯噻嗪陽(yáng)性率一直居高不下，占利尿劑陽(yáng)性率的30%左右。氫氯噻嗪只是中等強(qiáng)度的利尿劑，國(guó)際上包括我國(guó)所有興奮劑檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室都有很成熟的檢測(cè)方法［1-7］，為什么陽(yáng)性率還如此之高？為此，比利時(shí)根特興奮劑檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室在2009年曾經(jīng)做過(guò)復(fù)方制劑Docspirochlor（25 mg氫氯噻嗪/25 mg螺內(nèi)酯）的人體受試代謝研究［8］，研究結(jié)果顯示，在尿中除藥物原形外，還發(fā)現(xiàn)了代謝物氯噻嗪（Chlorothiazide，簡(jiǎn)稱“CT”）和降解產(chǎn)物4-氨基-6-氯-1，3苯二磺酰氯（4-Amino-6-chloro-benzene-1，3-disulphonamide，簡(jiǎn)稱“ACB”），但因?yàn)橹皇占?天的尿樣，因此對(duì)其代謝規(guī)律的研究并不完整。根據(jù)我們以往經(jīng)驗(yàn)，在氫氯噻嗪陽(yáng)性尿中從未發(fā)現(xiàn)螺內(nèi)酯陽(yáng)性案例，因此本研究只針對(duì)氫氯噻嗪進(jìn)行人體受試實(shí)驗(yàn)，對(duì)其代謝情況進(jìn)行深入研究。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1主要儀器與試劑

安捷倫公司生產(chǎn)的1200/6410B系列LC-MS/MS液質(zhì)聯(lián)用儀，包括G1312B二元高壓泵和6410B型三重串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜儀；METTLER PM200感量0.0001 g的電子天平（瑞士Metter公司）；VORTEX-2漩渦混合器（美國(guó)Scientific Industries公司）；雷勃爾離心機(jī)（北京雷勃爾離心機(jī)有限公司）。

氫氯噻嗪、氯噻嗪、ACB和內(nèi)標(biāo)倍可降（mefruside）從美國(guó)西格瑪-奧德里奇公司購(gòu)買(mǎi)；氫氯噻嗪片來(lái)自山西利豐華瑞制藥有限責(zé)任公司；醋酸鉛（分析純）來(lái)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲酸、甲酸銨、乙腈（色譜純）為美國(guó)迪馬公司產(chǎn)品；甲醇（色譜純）購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為超純水（Milli-Q超純水系統(tǒng)）。

1.2儲(chǔ)備液和工作液的制備

分別稱取1 mg左右的氫氯噻嗪、氯噻嗪和ACB標(biāo)準(zhǔn)品，置于2 ml的樣品瓶中，用甲醇配成1 mg/ml的儲(chǔ)備液。取1粒25 mg的倍可降片劑，加入5 ml甲醇，用超聲波充分溶解，靜置過(guò)夜后，用離心機(jī)離心（3000 rpm）10 min，取上清液配成濃度約5 mg/ml的儲(chǔ)備液。上述儲(chǔ)備液置于-20℃冰箱中冷凍保存。

用甲醇分別倍比稀釋氫氯噻嗪、氯噻嗪和ACB儲(chǔ)備液至100 ng/μl，10 ng/μl和1 ng/μl，作為工作液，用于制備質(zhì)控樣品等；用甲醇稀釋倍可降儲(chǔ)備液至1000 ng/μl做內(nèi)標(biāo)（ISTD）工作液；取200 μl倍可降工作液加入999.8 ml、濃度為5%的醋酸鉛水溶液中，配成濃度為200 ng/ml的內(nèi)標(biāo)溶液。

1.3人體受試實(shí)驗(yàn)

本研究征集男女各1名健康志愿者參加，年齡分別為26和27歲。受試者在受試前簽署書(shū)面知情同意書(shū)并完成受試者情況調(diào)查表。受試前1個(gè)月未服用營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)劑和任何藥物。在收集志愿者空白尿后，每人單次單劑量服用25 mg氫氯噻嗪片劑，服藥后正常飲水。收集服藥后3天的全部尿樣和之后14天的晨尿。

1.4樣品前處理

利尿劑類禁用物質(zhì)通常采取液液萃取的方式進(jìn)行純化和富集［9-14］。根據(jù)我們實(shí)驗(yàn)室以前的研究成果［15］，本研究對(duì)樣品進(jìn)行簡(jiǎn)化處理：在1 ml尿樣中加入1 ml、濃度為5%的醋酸鉛水溶液（其中含有內(nèi)標(biāo)倍可降，濃度為200 ng/ml），渦旋震蕩30秒以沉淀尿樣中的蛋白質(zhì)，離心10分鐘（4000 rpm）后，倒出上清液，取10 μl進(jìn)樣分析。

1.5儀器條件

1.5.1色譜條件

安捷倫XDB Eclipse-C18色譜柱（3.5 μm，100 mm×2.1 mm）；流動(dòng)相：pH 3.5的10 mM甲酸銨緩沖液（A）和乙腈（B）；柱溫：40℃；進(jìn)樣體積10 μl；梯度洗脫程序如表1。

表1　禁用物質(zhì)液相梯度洗脫程序

1.5.2質(zhì)譜條件

多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)（MRM）；離子化方式：電噴霧（ESI）；離子極性：負(fù)離子模式；霧化氣壓力：35 psi；毛細(xì)管電壓：4000V；離子源溫度：330℃；干燥器流速：10L/min。

2　結(jié)果與討論

2.1色譜和質(zhì)譜條件的優(yōu)化

倍可降在樣本處理過(guò)程中性質(zhì)穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，保留時(shí)間及峰形良好，對(duì)氫氯噻嗪、氯噻嗪和ACB的色譜峰無(wú)干擾，適合做內(nèi)標(biāo)。氫氯噻嗪、氯噻嗪和ACB在C18色譜柱上的保留時(shí)間較短，因此首先采用流動(dòng)相A∶B=90∶10的比例進(jìn)行等梯度洗脫3分鐘，并且將流速降低至0.3 ml/min，待3種待測(cè)物全部洗脫后，再將流動(dòng)相比例調(diào)高至A∶B=10∶90，且流速調(diào)為0.5 ml/min進(jìn)行快速洗脫。為確保得到響應(yīng)高且穩(wěn)定的信號(hào)，經(jīng)過(guò)反復(fù)優(yōu)化后，氫氯噻嗪、氯噻嗪、ACB和內(nèi)標(biāo)4種藥物的的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。

表2　優(yōu)化后4種物質(zhì)的質(zhì)譜參數(shù)

2.2檢測(cè)限（LOD）、定量限（LOQ）和線性范圍

2.2.1檢測(cè)限

檢測(cè)限指禁用物質(zhì)在尿樣中色譜峰的信噪為≥3時(shí)所對(duì)應(yīng)的濃度。先用1份空白尿添加一定濃度的待測(cè)物預(yù)估檢測(cè)限，然后用6份不同的空白尿添加待測(cè)物以確定檢測(cè)限。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，氫氯噻嗪、氯噻嗪和ACB的檢測(cè)限分別為2.5 ng/ml、1 ng/ml和5 ng/ml。

2.2.2定量限

定量限指禁用物質(zhì)在尿樣中色譜峰的信噪比為≥10時(shí)所對(duì)應(yīng)的濃度。先用1份空白尿添加一定濃度的待測(cè)物預(yù)估定量限，然后用6份不同的空白尿添加待測(cè)物以確定定量限。氫氯噻嗪、氯噻嗪和ACB的定量限分別為10、3和15 ng/ml。

2.2.3線性范圍

指某一方法標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線部分所對(duì)應(yīng)的待測(cè)物質(zhì)濃度的變化范圍。在空白尿中配制一系列濃度的工作曲線溶液進(jìn)行測(cè)定，由系列濃度值對(duì)相應(yīng)的測(cè)定值繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，再經(jīng)過(guò)二次回歸分析確定線性方程和相關(guān)系數(shù)（r2≥0.99）。該實(shí)驗(yàn)應(yīng)至少平行做3次，反復(fù)測(cè)定以確定線性范圍。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，氫氯噻嗪、氯噻嗪和ACB的線性范圍分別為10～250、3～200和15～1000 ng/ml。

2.3精密度和準(zhǔn)確度

在空白尿中，將HCT、CT和ACB配制成低、中和高3個(gè)濃度（HCT的濃度分別為10、100和250 ng/ml；CT的濃度分別為5、100和200 ng/ml；ACB的濃度分別為20、500和1000 ng/ml）的質(zhì)控樣品，按1.4方法進(jìn)行前處理。每個(gè)濃度在同日內(nèi)連續(xù)測(cè)定6次，計(jì)算其日內(nèi)精密度；在連續(xù)3天內(nèi)重復(fù)測(cè)定，計(jì)算其日間精密度。準(zhǔn)確度用實(shí)測(cè)濃度與標(biāo)示濃度的比值百分?jǐn)?shù)（%）表示。結(jié)果表明，3種禁用物質(zhì)的日內(nèi)、日間精密度及準(zhǔn)確度均滿足生物樣品分析的要求（表3）。

2.4基質(zhì)效應(yīng)

在6份不同的空白尿中分別添加低、中和高3個(gè)濃度級(jí)別的待測(cè)樣品（濃度見(jiàn)2.3），按1.4方法前處理后上機(jī)檢測(cè)，得到峰面積A。在純凈水中重復(fù)上述操作，上機(jī)檢測(cè)得到峰面積B。基質(zhì)干擾可用下述公式計(jì)算：基質(zhì)效應(yīng)=（色譜峰面積A/內(nèi)標(biāo)峰面積A）÷（色譜峰面積B/內(nèi)標(biāo)峰面積B）×100%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該方法的基質(zhì)干擾在75%～120%范圍內(nèi)（表3）。

2.5方法專屬性考察

特異性是指在樣品介質(zhì)中有其它組分共存時(shí)，檢測(cè)方法對(duì)待測(cè)物準(zhǔn)確而專屬的測(cè)定能力。當(dāng)樣品中含有被分析物時(shí)呈陽(yáng)性反應(yīng)，不含被分析物時(shí)呈陰性反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)選擇100份空白尿樣，經(jīng)上機(jī)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，尿樣中其它雜質(zhì)對(duì)待測(cè)離子的窗口無(wú)干擾。因此，該方法具有很好的專屬性。

表3　3種藥物的方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果數(shù)據(jù)

3　藥物人體受試實(shí)驗(yàn)及方法應(yīng)用

邀請(qǐng)1男1女兩名年齡分別為26和27歲的健康志愿者進(jìn)行氫氯噻嗪人體受試實(shí)驗(yàn)。受試當(dāng)天留取空白尿后，單次單劑量服用25 mg氫氯噻嗪片劑，收取服藥后3天的所有尿樣，及之后14天的晨尿。對(duì)受試者的尿樣進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，氫氯噻嗪原形的檢測(cè)窗口期從根特實(shí)驗(yàn)室的5天延長(zhǎng)至7天；代謝物氯噻嗪的檢測(cè)窗口期也延長(zhǎng)了10小時(shí)左右，為3天；而降解產(chǎn)物ACB的檢出時(shí)間從5天延長(zhǎng)到13天。受試尿樣中氫氯噻嗪濃度峰值在服藥后3～9小時(shí)之間，最高濃度在23～40 μg/ml之間；氯噻嗪濃度峰值在服藥后6～12小時(shí)之間，最高濃度介于825～948 ng/ml；ACB濃度峰值在服藥后9～36小時(shí)之間，最高濃度在940～2970 ng/ml左右。尿樣中3種藥物代謝規(guī)律曲線見(jiàn)圖1～3（陽(yáng)性尿樣中藥物濃度超過(guò)線性范圍時(shí)，需要稀釋后重新進(jìn)行檢測(cè)）。

圖1　口服25mgHCT后HCT的濃度變化

圖2　口服25mgHCT后CT的濃度變化

圖3　口服25mgHCT后ACB的濃度變化

4　總結(jié)

該方法對(duì)檢測(cè)氫氯噻嗪原形、其代謝物氯噻嗪和降解產(chǎn)物ACB具有前處理簡(jiǎn)單、靈敏度高、準(zhǔn)確可靠和重現(xiàn)性好等特點(diǎn)。與之前的文獻(xiàn)相比，上述3個(gè)禁用物質(zhì)的檢測(cè)窗口期都有不同程度的延長(zhǎng)，在查出更多作弊者的同時(shí)，對(duì)試圖使用興奮劑的運(yùn)動(dòng)員具有很大的威懾作用。該方法在我們實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)檢測(cè)工作中發(fā)揮了重要作用。

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The Metabolic Profile and Detection Window of Hydrochlorthiazide in Human Urine

Ma Yanhua，Yan Kuan，Dong Ying
National Anti-Doping Agency，Beijing，China 100029

Dong Ying，Email：dongying@chinada.cn

Objective To study the metabolic profile and detection window period of hydrochlorothiazide（HCT）anditsmetabolite（chlorothiazide，CT）anddegradationproduct（4-amino-6-chloro-1，3-benzenedisulphonamide，ACB）in human urine for the purpose of doping control.Method Two volunteers including 1 male（aged 26）and 1 female（aged 27）were orally administered one tablet of hydrochlorothiazide containing 25 mg HCT after signing the statement of informed consent.Their urine samples were collected before，within 3 days and in the morning from 4th to 17th day after the administration of hydrochlorothiazide. After precipitation of protein with 5%PbAc2aqueous solution，the supernatant of the samples were injected into liquid chromatography-tandem mass spectrometry（LC-MS/MS）without sample pre-concentration.Results The limits of detection for HCT，CT and ACB were 2.5 ng/ml，1 ng/ml and 5 ng/ml，respectively.The limits of quantification of HCT，CT，and ACB were 10 ng/ml，3 ng/ml and 15 ng/ml，respectively.The intra-and interday precision，accuracy and matrix effects of the HCT，CT and ACB in low-moderate-and highconcentration were＜10%，88%～110%and 75%～120%，respectively.The detection windows of HCT，CT and ACB were 7，3 and 13 days，respectively after the administration of hydrochlorothiazide.Conclusions This approach provided easy pre-processing of sample，high sensitivity，satisfactory accuracy and reproducibility for the detection of HCT，CT and ACB.The detection window period for HCT，CT and ACB in this study wassomewhat prolonged as compared with the published literature.

LC-MS/MS，hydrochlorothiazide，doping-control

2015.70.20

國(guó)家體育總局反興奮劑中心科研項(xiàng)目（2013ZR002）

董穎，Email：dongying@chinada.cn