T140靶向阻斷SDF-1/CXCR4信號通路對豚鼠關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原蛋白及聚集蛋白聚糖的影響

王坤趙灃凱李彥林賈迪余洋高寰宇肖渝李龍滕閆祥甲

1昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院運(yùn)動醫(yī)學(xué)科（云南昆明650031）

2山東省棗莊市棗礦集團(tuán)公司中心醫(yī)院（山東棗莊277800）

T140靶向阻斷SDF-1/CXCR4信號通路對豚鼠關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原蛋白及聚集蛋白聚糖的影響

王坤1趙灃凱2李彥林1賈迪1余洋1高寰宇1肖渝1李龍滕1閆祥甲1

1昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院運(yùn)動醫(yī)學(xué)科（云南昆明650031）

2山東省棗莊市棗礦集團(tuán)公司中心醫(yī)院（山東棗莊277800）

目的：明確T140體內(nèi)靶向阻斷SDF-1/CXCR4信號通路對豚鼠關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原蛋白及聚集蛋白聚糖的影響，探討T140減緩軟骨退變的作用。方法：健康9月齡雄性Hartley豚鼠36只，隨機(jī)分成A、B、C三組，A組為實驗組，B組為實驗對照組，C組為空白對照組，每組12只。于12周時，獲取膝關(guān)節(jié)軟骨，采用RT-PCR法檢測Ⅱ型膠原蛋白（ColⅡ）及聚集蛋白聚糖mRNA的表達(dá)；Western blot檢測ColⅡ含量。結(jié)果：RT-PCR檢測結(jié)果顯示A組Ⅱ型膠原蛋白及聚集蛋白聚糖的mRNA表達(dá)量高于B、C組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；Western blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)A組ColⅡ含量高于B、C組（P＜0.05）。結(jié)論：T140于體內(nèi)靶向阻斷SDF-1/CXCR4信號通路，減少關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原蛋白及聚集蛋白聚糖的降解，進(jìn)而減緩關(guān)節(jié)軟骨的退變。

T140；SDF-1/CRCR4信號通路；Ⅱ型膠原蛋白；聚集蛋白聚糖

研究表明，基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1（stromal cell derived factor 1，SDF-1）是一種小分子趨化蛋白，在骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）的發(fā)生發(fā)展過程中起關(guān)鍵性作用［1］。趨化因子受體4（chemokine receptor 4，CXCR4）是SDF-1唯一的受體。在膝關(guān)節(jié)內(nèi)，基質(zhì)細(xì)胞衍生因子（SDF-1）由滑膜組織分泌至關(guān)節(jié)腔中，CXCR4則表達(dá)于軟骨細(xì)胞表面，SDF-1與CXCR4結(jié)合可啟動SDF-1/CXCR4信號通路，該信號通路是引起骨關(guān)節(jié)炎（OA）的關(guān)鍵［2］。在軟骨組織中，Ⅱ型膠原蛋白及聚集蛋白聚糖是構(gòu)成軟骨基質(zhì)的主要成分，Ⅱ型膠原蛋白及聚集蛋白聚糖的減少或破壞被認(rèn)為是軟骨退變的重要形式。

我們的前期實驗中，在體外培養(yǎng)軟骨的培養(yǎng)液里添加100 ng/ml的外源性SDF-1，并加入該信號通路的特異性拮抗劑T140進(jìn)行拮抗，結(jié)果表明T140可體外阻斷SDF-1/CXCR4信號通路，阻止軟骨細(xì)胞釋放MMP-3、MMP-9及MMP-13，進(jìn)而減少軟骨中II型膠原蛋白及聚集蛋白聚糖的降解［3］。本研究以豚鼠原發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎為模型，在前期體外實驗研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步深入探討T140體內(nèi)靶向阻斷SDF-1/CXCR4信號通路，觀測關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)II型膠原蛋白及聚集蛋白聚糖的表達(dá)情況，進(jìn)一步探索T140延緩關(guān)節(jié)軟骨退變的作用。

1　材料與方法

本實驗在中國科學(xué)院昆明動物研究所完成。

1.1實驗動物

取健康的9月齡雄性Hartley豚鼠（四川達(dá)碩生物公司；實驗動物生產(chǎn)許可證號；TBA287640-334）36只，體重1.2±0.1 kg，雄性，純化清潔級。所有實驗動物的對待和照顧嚴(yán)格遵循《實驗動物管理條例》，并經(jīng)過昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會許可。

1.2主要實驗試劑及儀器

T140凍干粉（美國Sigma公司），PBS粉（武漢博士德生物工程有限公司），RNeasy isolation kit（北京美科美佳生物科技開發(fā)有限公司），RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas公司，加拿大），SDF-1（Sigma公司，美國），BCA蛋白濃度測定試劑盒（天根生化）。Alzet膠囊式微量滲透壓泵（上海普邁生物cellsciences公司），冰箱BCD-216AD（青島海爾股份有限公司），Real-Time PCR儀（Applied Biosystems，美國）。

1.3實驗分組及軟骨組織獲取

36只豚鼠隨機(jī)分成3組，即實驗組（A組）、實驗對照組（B組）、空白對照組（C組），每組12只。A組中每只豚鼠皮下植入Alzet膠囊式微量滲透壓泵，其內(nèi)灌注無菌PBS液充分稀釋過的T140凍干粉，T140以濃度為180 μg/ml.d泵入豚鼠皮下組織，B組中每只豚鼠皮下植入Alzet膠囊式微量滲透壓泵，其內(nèi)僅僅灌注PBS液，C組中各只豚鼠不做任何處理。36只豚鼠常規(guī)飼養(yǎng)至12周時，采用戊巴比妥鈉（30 mg/kg）腹腔注射法處死全部豚鼠，取下膝關(guān)節(jié)部軟骨。每組所取標(biāo)本隨機(jī)分為兩組，一組用于PCR檢測，一組用于Western blot檢測。

1.4檢測指標(biāo)

1.4.1RT-PCR檢測軟骨組織內(nèi)Ⅱ型膠原及聚集蛋白聚糖mRNA的表達(dá)

采用RNeasy isolation kit提取軟骨組織標(biāo)本中的總RNA。用紫外分光光度計分別在波長為260 nm和280 nm條件下，測定所提取RNA吸光值，以O(shè)D260/ OD280的比值來鑒定mRNA純度，OD260/OD280的比值在1.8～2.0之間時說明所提取得RNA較純，雜質(zhì)少，取該比值區(qū)間的RNA進(jìn)行后續(xù)實驗。然后取其中的1 μg蛋白樣品按照RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit說明書，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以濃度為40 μg/μl的cDNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增及β-Actin作為內(nèi)參照。根據(jù)引物設(shè)計原則，使用primers Express software軟件進(jìn)行分析設(shè)計各基因引物，豚鼠內(nèi)參基因β-ACTIN，上游引物：5'-CCACCATGTAC CCAGGCATT-3'，下游引物：5'-ACTCCTGCTTGCTGATCCAC-3'，DNA片段177 bp；豚鼠Ⅱ型膠原蛋白5'-ACATCTCAGCAGCATCATCACC-3'，5'-CATCACCACGCAGTCCTCAC-3'，DNA片段103 bp；豚鼠聚集蛋白聚糖，上游引物：5'-ACATCTCAGCAGCATCATCACC-3'，下游引物：5'-CATCACCACGCAGTCCTCAC-3'，DNA片段199 bp。循環(huán)參數(shù)：95℃5 min預(yù)變性，95℃變性30 sec，55℃退火30 sec，72℃延伸1 min，30個循環(huán)。使用Real-Time PCR儀檢測標(biāo)本中各基因的表達(dá)情況，為確保數(shù)據(jù)的有效性，每個樣品均平行做3個復(fù)孔。統(tǒng)計數(shù)據(jù)時將各組Ct值轉(zhuǎn)換成2Ct后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，分析Ⅱ型膠原蛋白及聚集蛋白聚糖mRNA表達(dá)。

1.4.2Western Blot檢測Ⅱ型膠原蛋白的水平

軟骨組織中的總蛋白參照BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書進(jìn)行提取，BCA法測定蛋白濃度計算上樣緩沖液中應(yīng)含總蛋白含量，使各組總蛋白水平相等。10 μg總蛋白在濃縮膠（6%）進(jìn)行SDS-PAGE電泳30min，繼續(xù)用15%分離膠將蛋白質(zhì)按分子量大小分離，然后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜進(jìn)行抗原抗體雜交反應(yīng)。先用脫脂牛奶封閉非特異蛋白結(jié)合位點，洗滌后加入一抗，再洗滌加二抗，孵育1～2 h，在暗室內(nèi)加入免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑（ECL Western blotting kit）曝光顯影，圖像分析軟件（Quantity One）進(jìn)行目標(biāo)蛋白和β-actin的光密度測定，用目標(biāo)條帶與β-actin光密度比值反映蛋白相對表達(dá)量，進(jìn)行組間比較。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較時采用LSD檢驗；檢驗水準(zhǔn)α=0.05，以P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1RT-PCR檢測結(jié)果

II型膠原蛋白、聚集蛋白聚糖和β-ACTIN內(nèi)參基因引物擴(kuò)增的基因片段比照擴(kuò)增曲線及溶解曲線后，顯示了擴(kuò)增的單一性和一致性。膝關(guān)節(jié)軟骨組織標(biāo)本RT-PCR結(jié)果顯示，II型膠原蛋白（ColⅡ）及聚集蛋白聚糖（ACAN）mRNA的表達(dá)量A組最高，明顯高于B組和C組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）（表1）。B組與C組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1　II型膠原蛋白（ColⅡ）及聚集蛋白聚糖（ACAN）mRNA的表達(dá)量（n=12）

2.2Ⅱ型膠原蛋白的Western blot檢測

在軟骨組織的蛋白水平檢測中，可見II型膠原蛋白表達(dá)量A組比B、C組高，灰度最深，而B、C兩組灰度值差別不明顯（圖1）；A組與B、C兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表2）。這表明，T140在體內(nèi)可增加軟骨組織II型膠原蛋白的表達(dá)量，對骨關(guān)節(jié)炎中軟骨的修復(fù)具有積極作用。

圖1　T140干預(yù)對關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)Ⅱ型膠原蛋白（ColⅡ）表達(dá)的影響

表2　各組II型膠原蛋白灰度值比較（n=12）

3　討論

基質(zhì)細(xì)胞衍生因子（SDF-1）是由多種細(xì)胞產(chǎn)生的CXC類小分子趨化蛋白，能特異性結(jié)合趨化因子受體4（CXCR4）。在膝關(guān)節(jié)中，SDF-1由滑膜產(chǎn)生并分泌至關(guān)節(jié)腔及血液中，趨化因子受體4（CXCR4）屬于G蛋白偶聯(lián)受體，表達(dá)于軟骨細(xì)胞表面，是已知的SDF-1唯一的受體。SDF-1與CXCR4結(jié)合啟動SDF-1/CXCR4信號通路，進(jìn)而引起基質(zhì)金屬蛋白酶類（MMPs）的釋放，通過破壞軟骨細(xì)胞外基質(zhì)而發(fā)生骨關(guān)節(jié)炎。所以，SDF-1/CXCR4信號通路是引起骨關(guān)節(jié)炎（OA）的關(guān)鍵［2］。該通路還參與很多腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移與擴(kuò)散［4，5］。故本研究中，以CXCR4為SDF-1拮抗劑（T140）治療的靶點，通過阻斷SDF-1/CXCR4信號通路，探尋T140的靶向作用，為靶向治療OA尋找新的突破點。

由于Hartley豚鼠的原發(fā)性O(shè)A模型的病理特征與人原發(fā)性O(shè)A相似［6］，該原發(fā)性O(shè)A動物模型的組織學(xué)、生物化學(xué)及分子生物學(xué)類似人OA的變化特征［7，8］。OA病變于9月至12月最明顯，OA的嚴(yán)重程度與蛋白多糖及膠原含量的減少相平行。錢麗萍等［9］的觀點也認(rèn)為，豚鼠OA的動物模型與人OA相似性最高。故本實驗選用9月齡Hartley豚鼠作為原發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎的研究模型。

膠原和聚集蛋白聚糖對維持關(guān)節(jié)軟骨的彈性及硬度具有重要作用，在關(guān)節(jié)軟骨退變中是主要的保護(hù)性因素。II型膠原構(gòu)成纖維網(wǎng)架結(jié)構(gòu)中的主體，聚集蛋白聚糖使軟骨具有抵抗壓力和分散負(fù)荷的能力。聚集蛋白聚糖的丟失往往被認(rèn)為是關(guān)節(jié)炎的早期主要表現(xiàn)，聚集蛋白聚糖核心蛋白特定位點斷裂產(chǎn)生的片斷可在OA患者的軟骨及關(guān)節(jié)液中被發(fā)現(xiàn)。關(guān)節(jié)軟骨表面的纖維樣改變與軟骨基質(zhì)中小分子聚集蛋白聚糖的丟失有密切關(guān)系。II型膠原蛋白和聚集蛋白聚糖是軟骨基質(zhì)中的主要成分，所以二者的表達(dá)和凋亡情況是反映軟骨退變程度的最好指標(biāo)。因此，本研究中，我們通過RT-PCR檢測各組軟骨II型膠原和聚集蛋白聚糖mRNA表達(dá)情況，Western blotting檢測軟骨內(nèi)II型膠原蛋白的含量，以便觀測T140靶向阻斷SDF-1/CXCR4信號通路后，軟骨組織中保護(hù)性元素的變化情況。

T140是一種含14個氨基酸的能特異性結(jié)合并阻斷SDF-1/CXCR4信號通路的小分子多肽，是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的CXCR4受體拮抗劑，T140［10］是CXCR4受體的安全拮抗劑，能有效阻止SDF-1/CXCR4信號通路，目前主要用于抗艾滋病、抗腫瘤以及抗慢性炎癥疾病的靶向藥物研究，但在靶向治療OA軟骨退變方面報道甚少［11］。

在我們前期關(guān)于T140干預(yù)骨關(guān)節(jié)炎的體外實驗研究中［3］，通過體外培養(yǎng)骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織塊，加入T140進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)T140可體外阻斷SDF-1/CXCR4信號通路，緩解軟骨細(xì)胞降解II型膠原蛋白。此次體內(nèi)實驗進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，A組（含T140）豚鼠關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)II型膠原蛋白（ColⅡ）及聚集蛋白聚糖（ACAN）mRNA表達(dá)量最高，明顯高于B組和C組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Western Blot結(jié)果顯示，A組（含T140）II型膠原蛋白表達(dá)量也高于B、C兩組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。分析認(rèn)為，T140通過與SDF-1競爭性結(jié)合CXCR4位點，靶向阻斷SDF-1/CXCR4信號通路，抑制了基質(zhì)金屬蛋白酶的釋放，減少II型膠原蛋白及聚集蛋白聚糖的降解，進(jìn)而可以延緩關(guān)節(jié)軟骨退變。

綜上，雖然目前在改變OA病程進(jìn)展方面藥物治療基本無效［12］，但是通過靶點干預(yù)防治骨關(guān)節(jié)炎具有可能性。本研究發(fā)現(xiàn)，T140在體內(nèi)可以靶向阻斷SDF-1/CXCR4信號通路，減少II型膠原蛋白和聚集蛋白聚糖的降解，在防止關(guān)節(jié)軟骨退變方面有積極作用，有望成為治療OA的有效藥物。但是，本研究尚存在不足，如：Sox9基因作為轉(zhuǎn)錄激活因子，在軟骨細(xì)胞增殖、分化及軟骨形成中發(fā)揮了重要作用，加入T140干預(yù)后，如果進(jìn)一步檢測Sox9基因的表達(dá)變化，并且深入探討Sox9基因與ColⅡ及SDF-1/CXCR4信號通路的關(guān)系等，可能獲得更進(jìn)一步的支持。

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The Effect of T140 on TypeⅡCollagen and Aggrecan in Articular Cartilage of Guinea Pigs

Wang Kun1，Zhao Fengkai2，Li Yanlin1，Jia Di1，Yu Yang1，Gao Huanyu1，Xiao Yu1，Li Longteng1，Yan Xiangjia1
1 Department of Sports Medicine，F(xiàn)irst Affiliated Hospital of Kunming Medical University，Yunnan，China 650031
2 Department of Osteoarthritis，Central Hospital of Shandong Zaozhuang Mining Group，Shandong，China 277800

Li Yanlin，Email：852387873@qq.com

Objective The purpose of this study is to explore the effect of T140（an antagonist of SDF-1/ CRCR4 signaling pathway）on typeⅡcollagen and aggrecan in articular cartilage of guinea pigs.Methods 36 9-month-old male healthy Hartley guinea pigs were divided into three groups：experimental group（A，n=12），experimental control group（B，n=12）and blank control group（C，n=12）.Pigs in group A were implanted Alzet capsule type micro osmotic pressure pump containing T140 diluted by PBS solution and in group B implanted the pump containing PBS solution only.Articular cartilages of knee joint were harvested for measuring mRNA levels of typeⅡcollagen and aggrecan with RT-PCR and protein levels of typeⅡcollagen with Western blot 12 weeks later.Results The mRNA levels of the typeⅡcollagen and aggrecan in group A were significantly higher than in groups B and C（P＜0.05）.The content of typeⅡcollagen in group A was also significantly higher than in groups B and C（P＜0.05）.Conclusion T140 reduces the degradation of typeⅡcollagen and aggrecan through blocking the SDF-1/CRCR4 signaling pathway and so as decreases the risk of cartilage degeneration.

T140，SDF-1/CRCR4 signaling pathway，typeⅡcollagen，aggrecan

2015.07.05

國家自然科學(xué)基金項目（編號：81460340）；云南省創(chuàng)新團(tuán)隊項目（編號：2014HC018）；云南省醫(yī)學(xué)學(xué)科帶頭人培養(yǎng)項目（編號：D-201207）

李彥林，Email：852387873@qq.com