高效液相色譜法測(cè)定香鈴草子中還原型谷胱甘肽和總巰基含量

翟方圓， 張小勇， 崔勝云

(延邊大學(xué),長(zhǎng)白山生物資源與功能分子教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,吉林延吉13302)

香鈴草(HibiscustrionumL.) 俗稱野西瓜苗，屬錦葵科木槿屬一年生草本植物。香鈴草全草具有清熱解毒、祛風(fēng)除濕、止咳、利尿之功效，主治急性風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；外用治療燒傷、燙傷、瘡毒等癥；種子味辛、性平，主治肺結(jié)核、腎虛頭暈、耳聾耳鳴[1]。生物體內(nèi)含半胱氨酸殘基的巰基肽及蛋白質(zhì)扮演提高機(jī)體免疫、抗氧化、重金屬解毒、促氨基酸吸收和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等重要生物活性功能，因此藥用植物中的巰基(-SH)化合物是構(gòu)成其活性功能的重要的成分之一[2 - 5]。目前，植物樣品中還原型谷胱甘肽(GSH)等含半胱氨酸殘基的巰基化合物的測(cè)定大多采用光譜法、色譜法等分析方法。但光譜法受植物色素等干擾較大，而色譜法衍生化試劑較昂貴且前處理不當(dāng)導(dǎo)致巰基的氧化變性使得測(cè)定結(jié)果偏低。

本文采用5,5′-二硫雙-2-硝基苯甲酸(DTNB)為衍生化試劑，用細(xì)胞破壁、衍生化為一體的前處理方法，通過高效液相色譜(HPLC)法，測(cè)定衍生化試劑與半胱氨酸殘基的巰基發(fā)生二硫鍵交換反應(yīng)，定量釋放出2-硝基-4-巰基苯甲酸(NTB)和小分子巰基化合物衍生化產(chǎn)物復(fù)合物的方法，同時(shí)測(cè)定香鈴草子中的小分子巰基化合物和包括巰基蛋白在內(nèi)的總巰基含量。本研究為香鈴草子生物學(xué)功能及選擇性分析生物樣品中巰基化合物的研究提供可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與設(shè)備

HP1100高效液相色譜儀(美國(guó)，安捷倫公司)，附二極管陣列檢測(cè)器；SCIENT-IID型超聲波細(xì)胞破碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(江蘇昆山超聲儀器有限公司)； pHS-3C型酸度計(jì)(上海精密儀器有限公司)；Mini-10K型離心機(jī)(珠海黑白醫(yī)學(xué)儀器有限公司)；SZ-97型全自動(dòng)三重純水蒸餾器(上海亞榮公司)。

1.2 試劑與材料

5,5′-二硫雙-2-硝基苯甲酸(DTNB)(國(guó)藥試劑)；還原型谷胱甘肽(GSH，國(guó)藥試劑)；半胱氨酸(99%，Aldrich)；乙腈(色譜純，F(xiàn)isher)；甲酸(98%，色譜純，國(guó)藥試劑)；三乙胺(天津市光復(fù)化工精細(xì)研究所)；其它試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為三次蒸餾水。

香鈴草子(秋季本地野外采集)。

1.3 樣品處理

取香鈴草子干品，用研缽磨成粉末。稱取粉末樣品2.0 g，加入含過量DTNB(5.0×10-3mol/L)的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)20 mL，利用超聲細(xì)胞破壁儀超聲破壁5 min、超聲波清洗儀超聲30 min，離心，抽取上清液，加入2倍體積的乙醇，靜置30 min，抽濾，然后以8 000 r/min離心10 min，除蛋白、取上清液作為供試品溶液。

1.4 色譜條件

色譜柱：Inertsil ODS-SP柱(150×4.6 mm,5 μm,日本GL science 公司)；流動(dòng)相：A為含1%甲酸和0.05%三乙胺的水相 ，B為1%甲酸和0.05%三乙胺的乙腈有機(jī)相。采用梯度洗脫程序：14%B(10 min)→28%B(15 min)→90%B(40 min) →90%B(45min)→10%B(50 min),流速為0.8 mL/min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量10 μL；紫外檢測(cè)器的檢測(cè)波長(zhǎng)為327 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法原理

衍生化試劑DTNB在PBS(pH=7)中與含半胱氨酸殘基的小分子巰基化合物(RSH)，及含巰基蛋白質(zhì)(Prot-SH)發(fā)生定量衍生化反應(yīng)，并釋放出1-硫-5-硝基苯甲酸(TNB)和巰基化合物與TNB的復(fù)合物(RS-TNB，Prot-S-TNB)，反應(yīng)如下：

過量DTNB與樣品中含巰基蛋白質(zhì)(Prot-SH)和小分子巰基化合物(RSH)發(fā)生二硫鍵的交換反應(yīng)，并分別生成衍生化產(chǎn)物Prot-S-TNB和RS-TNB并定量釋放出TNB。由于蛋白質(zhì)衍生化產(chǎn)物(Prot-S-TNB)可通過除蛋白分離掉，分析溶液中的RS-TNB和TNB分別提供小分子巰基化合物和總巰基含量信息。借此，利用HPLC法分別測(cè)定GSH等小分子巰基化合物和總巰基含量。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

巰基化合物衍生化反應(yīng)定量釋放的TNB提供總-SH含量信息。但用紫外檢測(cè)器同時(shí)測(cè)定RS-TNB和TNB，因其兩者的光譜特性的不同，在選定的檢測(cè)波長(zhǎng)(327 nm)條件下，TNB色譜峰嚴(yán)重拖尾導(dǎo)致無法定量測(cè)定總巰基含量。拖尾的原因可能為洗脫過程中TNB與其還原態(tài)2-硝基-4-巰基苯甲酸(NTB)相互轉(zhuǎn)換所致，如圖1。

TNB 在λmax=412 nm的可見光區(qū)有較強(qiáng)的吸收，是目前利用光度法測(cè)定GSH等巰基化合物的主要衍生化產(chǎn)物形態(tài)。而在酸性條件下，其還原態(tài)NTB在所設(shè)色譜檢測(cè)波長(zhǎng)(λ=327 nm)處具有強(qiáng)吸收。因此利用所選檢測(cè)波長(zhǎng)下同時(shí)得到所有衍生化產(chǎn)物的靈敏、無拖尾的色譜峰，須把TNB轉(zhuǎn)換成光譜特性與其他衍生化產(chǎn)物相匹配的還原態(tài)NTB。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明；通過流動(dòng)相中加入甲酸使TNB充分轉(zhuǎn)換成NTB的形態(tài)，同時(shí)在流動(dòng)相中加入三乙胺來調(diào)節(jié)洗脫能力，可有效消除拖尾和譜峰不對(duì)稱及保留值的位移等現(xiàn)象。

2.3 香鈴草子中GSH和總巰基測(cè)定

2.3.1香鈴草子提取液及GSH和半胱氨酸(Cys)衍生產(chǎn)物的對(duì)照測(cè)定分別用過量DTNB(5.0×10-3mol/L)同步衍生化香鈴草子提取液，DTNB與小分子巰基化合物GSH和Cys標(biāo)準(zhǔn)混合溶液進(jìn)行了HPLC對(duì)照測(cè)定，結(jié)果見圖2。如圖2所示，在過量DTNB與GSH和Cys標(biāo)準(zhǔn)混合溶液中，分別觀察到衍生化產(chǎn)物GS-TNB、Cys-TNB、NTB及剩余的DTNB的色譜峰。在香鈴草子提取液中只觀察到GS-TNB及NTB及DTNB的色譜峰而觀察不到Cys-TNB的色譜峰，說明樣品中小分子巰基化合物主要是GSH。

2.3.2校正曲線和樣品測(cè)定由于DTNB與含半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)，及小分子巰基化合物中巰基的二硫鍵交換反應(yīng)無選擇性，同時(shí)GSH的衍生化產(chǎn)物(GS-TNB)及NTB的色譜峰面積與GSH濃度均呈良好線性關(guān)系，因此可用GSH標(biāo)準(zhǔn)溶液校正曲線法測(cè)定樣品中的GSH和總巰基含量，通過總巰基和GSH含量之差得出樣品中蛋白巰基的含量。校正曲線制作過程為；用新配制的含過量DTNB(1.0×10-2mol/L)衍生化試劑的PBS分別配制一系列GSH濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，分別在優(yōu)化的HPLC條件下測(cè)定。結(jié)果表明；三次平行測(cè)定的衍生化產(chǎn)物GS-TNB和NTB的色譜峰面積(A)與GSH濃度(c)間呈良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程分別為:A=15.9722+20.81457c,A=-49.145+33.258c，相關(guān)系數(shù)R2均為0.9999。利用校正法測(cè)定了香鈴草子中的GSH與總巰基及蛋白巰基的含量，結(jié)果見表1。

表1 香鈴草子中GSH、總巰基及巰基蛋白(Prot-SH)含量

2.4 回收率和檢測(cè)限

采用回收率試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了方法的準(zhǔn)確度。分別取一定量的香鈴草子提取液，然后分別加入一定濃度的不同量的GSH標(biāo)準(zhǔn)溶液，根據(jù)測(cè)定的GSH和總巰基的色譜測(cè)定結(jié)果分別計(jì)算加標(biāo)回收率。檢測(cè)限是利用公式：YE=μ+ks。式中，YE為可被檢測(cè)出的最小分析信號(hào)值，μ指空白的平均信號(hào)值，s為空白測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)偏差，k是與置信度有關(guān)的整數(shù)，這里取k=3。然后分別利用校正曲線的線性回歸方程分別計(jì)算出GSH和巰基測(cè)定的檢測(cè)限。測(cè)定結(jié)果見表2。GSH 測(cè)定的回收率均值為100.43%，檢測(cè)限為5.31 μmol/L ，總巰基測(cè)定的回收率均值為101.79%，檢測(cè)限為6.18 μmol/L，滿足本測(cè)定的準(zhǔn)確度和靈敏度要求。

表2 方法的回收率和檢測(cè)限

3 結(jié)論

建立了HPLC同時(shí)測(cè)定香鈴草子中GSH和總巰基含量的方法。采用細(xì)胞破壁、同步衍生化的前處理方法，有效阻止巰基在前處理過程中氧化變性，避免巰基氧化變性導(dǎo)致的靈敏度降低及漏檢，為準(zhǔn)確測(cè)定生物樣品中活性巰基化合物的測(cè)定提供了方法學(xué)依據(jù)。香鈴草子中GSH含量為4.07 μmol/g，總巰基含量為6.06 μmol/g，總巰基含量與GSH含量差值1.99μmol/L為香鈴草子含巰基蛋白含量，說明香鈴草子是富含GSH及含巰基活性蛋白質(zhì)的物種。