獺兔酪氨酸酶相關蛋白1（Tyrp1）基因序列分析及外顯子多態(tài)性研究

郝曄 施麗娟 閆曉榮 趙博昊 朱杰 陳陽 翁巧琴 吳信生

摘要[目的]探索獺兔酪氨酸相關蛋白1（Tyrp1）基因在毛色形成過程中的分子機制。[方法]對獺兔Tyrp1基因序列的核苷酸序列、編碼產(chǎn)物的基本理化性質等進行預測和分析，同時利用PCRSSCP（Single strand conformation polymorphism analysis of polymerase chain reaction products）技術檢測Tyrp1基因CDS序列的多態(tài)性分布狀況。[結果]信息學分析發(fā)現(xiàn)，TYRP1蛋白是不穩(wěn)定的親水性蛋白，有信號肽，具有酪氨酸酶家族特征性功能結構域。多態(tài)性檢測發(fā)現(xiàn)僅在Tyrp1基因CDS的483 bp處存在1個C→T的同義突變，位于外顯子2上，該堿基的突變沒有造成氨基酸的改變（AUC→AUT，異亮氨酸）。HardyWeinberg 平衡檢驗表明，青紫藍色獺兔群體處于非平衡狀態(tài)，白色獺兔群體處于平衡狀態(tài)。青紫藍兔群體為中度多態(tài)信息含量（0.25

關鍵詞 獺兔；Tyrp1；SNPs；序列分析

中圖分類號 S829.1 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2016）09-164-04

Abstract [Objective] To discuss the molecular mechanism of tyrosinaserelated protein 1 （Tyrp1） gene of Rex rabbit （Oryctolagus cuniculus） during the formation of hair color. [Method] The Tyrp1 gene sequence， the nucleotide sequence， and the basic physical and chemical properties of coding products were forecasted and analyzed. At the same time， PCRSSCP（singlestrand conformational polymorphism）was used to detect the distribution of CDS sequences of Tyrp1. [Result] Bioinformatics analysis found out that Tyrp1 protein was an unstable hydrophilic protein， which had a signal peptide and a functional domain of the tyrosinase family. The polymorphism detection result indicated that the exon 2 of Tyrp1 in 29 bp （the gene CDS 483 bp） had a C→T mutation， and the nucleotide mutation did not lead to the amino acid change （AUC→AUT， isoleucine）. HardyWeinberg equilibrium test showed that the Chinchilla Rex rabbit population was at HardyWeinberg disequilibrium， the white Rex rabbit population was at HardyWeinberg equilibrium. PIC of chinchilla Rex rabbit population was of medium polymorphism （0.25 < PIC < 0.50）， white Rex rabbit population was of low polymorphism （PIC < 0.25）. [Conclusion] Tyrp gene has certain effects on the hair color of Rex rabbit. This research provides certain references for the selection of hair color of Rex rabbit.

Key words Rex rabbit； Tyrp1； SNPs； Sequence analysis

Tyrp1基因是第1個克隆成功的色素基因，由于該基因編碼的蛋白與酪氨酸酶同源，因此被稱為酪氨酸酶相關蛋白1（Tyrosinaserelated protein1，TYRP1）[1]。很多學者提出了黑色素生物合成的三酶理論，即酪氨酸酶、多巴色素互變酶和5，6二羥基吲哚羧酸氧化酶，它們對黑色素的形成都有十分重要的作用，其中Tyrp1基因編碼的5，6二羥基吲哚羧酸氧化酶是酪氨酸酶重要的協(xié)同因子，與酪氨酸（Tyrosine，TYR）、酪氨酸酶相關蛋白2（Tyrosinaserelated protein2，TYRP2）一起組成酪氨酸酶相關蛋白家族[2]。也有研究表明，Tyrp1基因除了直接參與黑色素的生成反應外，還可能幫助穩(wěn)定并調(diào)節(jié)酪氨酸酶的催化活性，參與維持黑色素小體的結構，并影響著黑色素細胞的增殖和凋亡[3-4]。筆者通過PCR技術擴增Tyrp1基因7個外顯子的序列，對Tyrp1基因氨基酸序列進行了生物學信息分析，并利用PCR-SSCP技術和直接測序的方法對每個外顯子進行多態(tài)性檢測，分析Tyrp1基因在不同顏色獺兔（Oryctolagus cuniculus）群體的多態(tài)性，探索其與獺兔毛色形成的關系，旨在為獺兔毛色的選種選育提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物。

隨機抽取同批出生、健康的6月齡青紫藍色獺兔392只、白色獺兔174只，共566只獺兔作為試驗對象，試驗個體均來自浙江省余姚市欣農(nóng)兔業(yè)有限公司。

1.1.2 試劑。蛋白酶K、10 × TBE、Tris、EDTA、丙烯酰胺等試劑均購自生物（上海）工程有限公司；10%過硫酸銨、TEMED、SDS、甘油、甲醛等試劑均購自北京鼎國生物技術有限責任公司。

1.1.3 引物設計。

根據(jù)NCBI網(wǎng)站上公布的兔Tyrp1基因全序列（登錄號：NC_013669.1），分別在7個外顯子區(qū)域外的鄰近內(nèi)含子區(qū)域設計并合成特異性較好的引物，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，引物信息見表1。

1.1.4 Tyrp1基因序列分析軟件。

利用ExPASy工具對基因編碼的蛋白質性質進行分析，利用ProtParam分析蛋白的氨基酸序列組成、相對分子質量和等電點等理化性質，利用網(wǎng)上在線工具SMART（http：//smart.emblheidelberg.de/），分析TYRP1蛋白結構域，并使用 NPS@服務器上的SCOPMA分析預測蛋白的二級結構。利用TMPRED（http//www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html）進行蛋白質序列的跨膜區(qū)分析；運用ProtScale（http：//web.expasy.org/protscale/）進行氨基酸序列的親水性分析。利用SwissModel（http：//swissmodel.expasy.org/）對TYRP1編碼蛋白進行高級結構預測。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取。

采用傳統(tǒng)酚/氯仿抽提法提取獺兔耳組織樣基因組DNA，使用TE稀釋到100 ng/μL，使用NanoDrop ND1000核酸濃度測定儀測定DNA濃度，一般OD值的范圍為1.7～1.9，峰圖平滑的樣品可用。

1.2.2 PCR擴增。

PCR反應體系（20 μL）為：10×PCR Buffer 2 μL、10 mmol/L dNTPs 2 μL、10 pmol/L上、下游引物各1 μL、5 U/μL Taq酶0.2 μL、100 ng/μL DNA 模板1 μL、ddH2O 12.8 μL。PCR反應條件如下：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，適宜的溫度退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃最終延伸10 min，10 ℃下保存。

1.2.3 PCRSSCP檢測。

在20 μL PCR擴增產(chǎn)物中加入5 μL上樣緩沖液，混合體系在98 ℃變性10 min后，置于-20 ℃冰箱中冷卻5 min，于10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳迅速點樣，先用250 V電泳，10 min后將電壓調(diào)至120 V，電泳12 h。銀染顯色后觀察是否有不同帶型。若有不同帶型出現(xiàn)，將其PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）有限公司測序，以鑒定堿基突變的類型。

1.3 數(shù)據(jù)分析

1.3.1 基因頻率和基因型頻率。

基因頻率（Gene frequency）是指群體中某一特定等位基因與其他等位基因的比率；基因型頻率（Genotypic frequency）是指群體中某特定基因型個體數(shù)占全部個體數(shù)的比率。

2 結果與分析

2.1 Tyrp1基因各外顯子的擴增結果

對該基因的7個外顯子序列進行擴增，并用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。檢測擴增片段大小所用的Marker均為DL 500 Marker。從圖1可以看出，Tyrp1基因各外顯子的條帶特異性均較好，雜帶較少，特異條帶的片段大小與理論值一致。經(jīng)PCRSSCP檢測后，在Tyrp1基因外顯子1、3、4、5、6、7中均未檢測到多態(tài)位點，僅在外顯子2上檢測到2個等位基因、3種基因型（AA、BB、AB）。

2.2 Tyrp1基因多態(tài)序列分析

使用AlignIR V2.0軟件，將測序得到的DNA序列進行對比。從圖2～3可以看出，Tyrp1基因外顯子2在29 bp（整個基因CDS的483 bp）處有1個C→T的突變，堿基的突變并沒有造成氨基酸的改變（AUC→AUT，異亮氨酸），為同義突變。

2.3 Tyrp1基因外顯子2的遺傳多樣性分析

白色和青紫藍色獺兔外顯子2各基因型和基因型頻率經(jīng)卡方適合性檢驗，BB基因型頻率在青紫藍色獺兔中較高，在白色獺兔中較低，表明等位基因B是青紫藍色獺兔群體中的優(yōu)勢等位基因，而在白色獺兔中等位基因A是優(yōu)勢等位基因。HardyWeinberg 平衡檢驗表明，青紫藍色獺兔群體處于非平衡狀態(tài)，白色獺兔群體處于平衡狀態(tài)。青紫藍兔群體為中度多態(tài)信息含量（0.25

2.4 Tyrp1基因序列分析

2.4.1 TYRP1氨基酸序列的理化性質。

根據(jù) GenBank數(shù)據(jù)庫上已發(fā)表的家兔的Tyrp1基因序列可知，家兔的Tyrp1基因位于1號染色體上，全長15 843 bp，有7個外顯子和6個內(nèi)含子。編碼序列由1 683個堿基組成，編碼560個氨基酸殘基，是一個較為保守的基因。經(jīng)ProtParam在線軟件預測，分子式為C2802H4268N786O831S30，原子總數(shù)為8 717個，分子量為63 223.2 kD，理論等電點為6.06。在所有編碼氨基酸中，Leu（L）含量最高，為8.6%，Trp（W）只占1.8%（表3）。帶負電荷殘基的總數(shù)量（ASP + Glu）為56，帶正電荷殘基的總數(shù)量（Arg+Lys）為47，不穩(wěn)定指數(shù)是52.92，證明這個蛋白質不穩(wěn)定。

從圖4可以看出，TYRP1蛋白疏水性最大值為3.711，最小值為-3.133。TYRP1的主要親水平均數(shù)（GRAVY）值是-0.381，由于 GRAVY 值的范圍介于-2與2之間，其為正值時表明此蛋白為疏水蛋白，而負值表明為親水蛋白，因此該蛋白是親水蛋白。同時，TYRP1氨基酸序列內(nèi)絕大多數(shù)為親水性殘基，表明Tyrp1基因編碼蛋白為水溶性蛋白。

2.4.2 TYRP1氨基酸序列的二級結構和三級結構預測。

通過NPS@服務器上的SOPMA對TYRP1進行二級結構預測，結果如表4所示。其中，TYRP1蛋白二級結構以α螺旋和無規(guī)則卷曲為主，有利于穩(wěn)定蛋白質的結構，無規(guī)則卷曲是TYRP1蛋白最大的結構元件。這表明TYRP1蛋白的二級結構為混合型。

從圖5可以看出，三級結構序列的相似度達到84.17%，Evalue值為0，說明模型與提交的預測蛋白序列匹配性較好。

2.4.3 TYRP1氨基酸序列的功能性結構域預測。

利用SMART（Simple Modular Architecture Research Tool，簡單模塊構架搜索工具）分析結果顯示 TYRP1蛋白有3個功能性片段（圖 6）。紅色區(qū)（1～47）代表信號肽；灰色區(qū)（205～440）代表酪氨酸酶家族特征性區(qū)域；藍色區(qū)（502～524）代表跨膜區(qū)。

3 討論與結論

大量研究表明，Tyrp1基因與動物的毛發(fā)顏色和羽色相關，該基因編碼的5，6二羥基吲哚羧酸氧化酶，是酪氨酸酶重要的協(xié)同因子，在黑色素的形成中具有十分重要的作用。人類Tyrp1基因外顯子6上的1個堿基缺失，致使開放閱讀框截短，導致TYRP1蛋白喪失活性，使得其對酪氨酸羥化酶的催化作用減弱，引起眼皮膚白化病3（OCA3）[5]。Rieder等[6]研究發(fā)現(xiàn)灰色馬皮膚中Tyrp1基因的表達量較非灰色馬低，推測Tyrp1基因與馬的隱性灰毛色性狀相關。Li等[7]研究發(fā)現(xiàn)，鴨不同羽色中Tyrp1基因的表達存在差異，黑羽鴨中Tyrp1基因的表達量為白羽鴨的10 000倍以上。研究表明，Tyrp1基因編碼的TYRP1多巴色素互變異構酶（DCT）一起催化多巴醌轉化為真黑色素，影響黑色素小體的成和黑色素細胞的增殖與凋亡，也可直接參與黑色素的生成[8]。

為了揭示Tyrp1基因在毛色形成過程中的作用機制，筆者獲取了獺兔Tyrp1基因序列，對Tyrp1氨基酸序列的理化性質進行分析，初步斷定該蛋白為親水不穩(wěn)定蛋白，加上二級結構及模體分析，可以對該蛋白的結構及功能進行初步推測。筆者對 TYRP1 蛋白氨基酸序列的分析結果與已有的報道[9]相吻合，該蛋白為 I 型跨膜糖蛋白，定位在黑色素體的囊膜上，相當大部分區(qū)域溶于黑色素體囊內(nèi)的溶膠內(nèi)，單獨工作不穩(wěn)定，需要通過類表皮生長因子基序等同其他蛋白如酪氨酸酶結合的方式穩(wěn)定工作，α螺旋和無規(guī)則卷曲是TYRP1蛋白序列最大量的結構元件，散布于整個蛋白質中；SMART分析顯示了該蛋白的3個功能性片段，即N端的信號肽，中間相當大片段的酪氨酸酶相關家族特征性結構域及C端的跨膜結構域。

目前，很多國內(nèi)外學者研究Tyrp1基因的多態(tài)性在毛色形成過程中的作用。李蓓等[10]研究發(fā)現(xiàn)蒙古馬Tyrp1基因外顯子2的1個錯義突變與深色毛色相關。Rieder 等[11]研究發(fā)現(xiàn)馬Tyrp1基因外顯子2的SNP（C189T）引起蘇氨酸到蛋氨酸的錯義突變。Gratten等[12]對黑色和淺色索艾綿羊Tyrp1基因的研究發(fā)現(xiàn)，外顯子4的869 bp處存在錯義突變（T869G），淺色索艾羊基因型全為TT，黑色索艾羊基因型為GG或GT，表明該位點的突變與索艾綿羊毛色相關。徐瑩[13]對3種羽色朝鮮鵪鶉Tyrp1基因PCRSSCP 分析發(fā)現(xiàn)在 Tyrp1基因存在2個多態(tài)性位點（T367C 和C1153T），但是未發(fā)現(xiàn)這2個多態(tài)性位點與朝鮮鵪鶉羽色之間存在顯著相關性。該研究中對Tyrp1的CDS序列的多態(tài)性分布狀況進行檢測，檢測了獺兔Tyrp1基因7個外顯子的多態(tài)性，在其基因外顯子1、3、4、5、6、7中未檢測到多態(tài)位點，僅在外顯子2的29 bp（整個基因CDS的483 bp）處有1個C→T的同義突變。遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)，青紫藍獺兔群體的He值高于白色獺兔群體，說明它們具有更為豐富的遺傳多樣性，更好的選擇潛力。多態(tài)信息含量（PIC）是用來衡量基因片段多態(tài)性的重要指標，在外顯子2的基因型中，青紫藍獺兔群體的PIC值介于0.25與0.50之間，外顯子2基因座呈中度多態(tài)，說明該群體對于外顯子2基因型的選擇具有一定的潛力，這些結果與基因雜合度的研究結果基本一致。此外，青紫藍色獺兔群體偏離了哈代-溫格平衡，可以初步斷定該位點的突變有利于真黑色素的合成。基因及基因型在群體中的分布情況也支持該推論，因此Tyrp1基因對獺兔的毛色有一定影響。

參考文獻

[1]崔嘉，孫守榮，苗魯旭，等.TYRP1基因控制動物色素形成的研究進展[J].中國畜牧獸醫(yī)，2009，36（9）：94-96.

[2] 高莉，趙英虎，劉朝亮，等.酪氨酸酶相關蛋白1調(diào)控黑色素形成的研究進展[J].畜牧與飼料科學，2010，31（10）：114-116.

[3] KOBAYASHI T，HEARING V J.Direct interaction of tyrosinase with Tyrp1 to form heterodimeric complexes in vivo[J].J Cell Sci，2007，120（Pt 24）：4261-4268.

[4] RAD H H，YAMASHITA T，JIN H Y，et al.Tyrosinaserelated proteins suppress tyrosinasemediated cell death of melanocytes and melanoma cells[J].Exp Cell Res，2004，298（2）：317-328.

[5] BOISSY R E，ZHAO H，OETTING W S，et al.Mutation in and lack of expression of tyrosinaserelated protein1（TRP1）in melanocytes from an individual with brown oculocutaneous albinism：A new subtype of albinism classified as "OCA3"[J].Am J Hum Genet，1996，58（6）：1145-1156.

[6] RIEDER S，STRICKER C H，JOERG H，et al.A comparative genetic approach for the investigation of ageing grey horse melanoma[J].J Anim Breed Genet，2000，117（2）：73-82.

[7] LI S J，WANG C，YU W，et al.Identification of genes related to white and black plumage formation by RNASeq from white and black feather bulbs in ducks[J].PloS one，2012，7（5）：36592.

[8] AROCA P，URABE K，KOBAYASHI T，et al.Melanin biosynthesis patterns following hormonal stimulation[J].J Biol Chem，1993，268（34）：25650-25655.

[9] SARANGARAJAN R，BOISSY R E.Tyrp1 and oculocutaneous albinism type 3[J].Pigment Cell Res，2001，14（6）：437-444.

[10] LI B，HE X，ZHAO Y，et al.Tyrosinaserelated protein 1（TYRP1）gene polymorphism and skin differential expression related to coat color in Mongolian horse[J].Livestock science，2014，167：58-64.

[11] RIEDER S，TAOURIT S，MARIAT D，et al.Mutations in the agouti（ASIP），the extension（MC1R），and the brown（TYRP1）loci and their association to coat color phenotypes in horses（Equus caballus）[J].Mamm Genome，2001，12（6）：450-455.

[12] GRATTEN J，BERALDI D，LOWDER B V，et al.Compelling evidence that a single nucleotide substitution in TYRP1 is responsible for coatcolour polymorphism in a freeliving population of Soay sheep[J].P Roy Soc Lond B Bio，2007，274（1610）：619-626.

[13] 徐瑩.TYR、TYRP1 基因與朝鮮鵪鶉羽色相關性研究[D].洛陽：河南科技大學，2014：29-39.