何旭江,江武軍,顏偉玉,曾志將
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蜜蜂蜂王與雄蜂幼蟲饑餓信息素鑒定及其生物合成通路
何旭江,江武軍,顏偉玉,曾志將
(江西農(nóng)業(yè)大學蜜蜂研究所,南昌330045)
【目的】蜜蜂幼蟲在饑餓狀態(tài)下會通過釋放特定信息素來向外界傳遞饑餓信號,稱為蜜蜂幼蟲饑餓信息素(hunger pheromone)。論文旨在研究西方蜜蜂()蜂王與雄蜂幼蟲饑餓信息素化學成分及在幼蟲體內(nèi)的生物合成通路,明確蜜蜂幼蟲與成年蜂之間的化學信息素交流機制。【方法】采集2日齡與4日齡西方蜜蜂蜂王與雄蜂幼蟲及其食物,將其分為饑餓組、飼喂組與純食物組。飼喂組幼蟲平躺在預先準備好的食物表面,饑餓處理組則不提供食物。所有樣品分別放入20 mL密封采樣瓶中并在35℃條件下放置45 min。利用Needle trap技術(shù)從樣品瓶中采集10 mL氣體,富集氣體中的揮發(fā)性化學物質(zhì)。在氣質(zhì)聯(lián)用進樣口以250℃高溫將富集的化學物質(zhì)解離,并通過氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析鑒定蜂王與雄蜂幼蟲饑餓信息素。同時,采用RNA-Seq技術(shù)分析饑餓信息素在蜂王與雄蜂幼蟲體內(nèi)的生物合成通路及相關(guān)基因表達?!窘Y(jié)果】從蜂王與雄蜂幼蟲中分別分析鑒定出10種與9種信息素,其中蜂王幼蟲含有一種特有的幼蟲信息素——2-庚酮,且在蜂王食物中含量最高。E--羅勒烯在蜂王與雄蜂幼蟲各饑餓組含量均顯著高于其飼喂幼蟲組與食物組,表明蜂王與雄蜂幼蟲均以E--羅勒烯為其饑餓信息素。2日齡蜂王與雄蜂幼蟲饑餓組E--羅勒烯含量均差異不顯著,但4日齡蜂王幼蟲饑餓組E--羅勒烯含量顯著低于雄蜂幼蟲組。其余8種信息素為肉豆蔻酸、棕櫚酸、甲基棕櫚酸脂、硬脂酸、棕櫚油酸、十五烷酸、乙酸與乙酸乙酯,均未出現(xiàn)饑餓組高于其他兩組的規(guī)律。其中乙酸乙酯與乙酸在食物組與飼喂組含量高于饑餓組,推測其可能來自于幼蟲食物。RNA-Seq結(jié)果表明蜂王與雄蜂幼蟲通過甲羥戊酸途徑由乙酰輔酶A從頭合成E--羅勒烯。發(fā)現(xiàn)與等9個基因參與該通路,但在饑餓組與其飼喂組幼蟲中表達差異均不顯著?!窘Y(jié)論】蜜蜂蜂王與雄蜂幼蟲利用E--羅勒烯作為其饑餓信息素乞求食物,并且在體內(nèi)從頭合成E--羅勒烯。工蜂利用2-庚酮標記蜂王幼蟲,但未對雄蜂幼蟲進行標記。
西方蜜蜂;饑餓信息素;E--羅勒烯;生物合成;表達分析
【研究意義】蜜蜂是一種真社會性昆蟲,其內(nèi)部具有一套十分完整的信息交流系統(tǒng),保證群體與個體能夠正常生長、發(fā)育與繁衍[1]。研究蜜蜂蜂群內(nèi)部的信息交流機制是深入探索其社會性的重要內(nèi)容,也可為人類及其他動物的社會性研究提供科學借鑒。【前人研究進展】蜜蜂的信息交流主要分為舞蹈語言系統(tǒng)與化學語言系統(tǒng)。其中蜜蜂信息素是蜂群內(nèi)社會管理、婚飛交尾、個體交流以及報警防衛(wèi)等主要交流媒介[2-6]。例如,蜂王利用反式-9-氧代-2-癸烯酸((2E)- 9-oxodecenoic acid)等9種蜂王信息素來引起工蜂的侍從行為、雄蜂的追逐行為以及參與蜂群的社會管理[7-9];工蜂利用牻牛兒醇(geraniol)、橙花醛(neral)和金合歡醇(farnesol)信息素招引處女王與工蜂回巢,招引本群的工蜂結(jié)團,以及招引其他工蜂前來采集[10-11];而蜜蜂幼蟲利用甲基棕櫚酸酯(methyl palmitate)與甲基油酸酯(methyl oleate)等10種表皮信息素可以誘導工蜂封蓋幼蟲巢房行為與刺激工蜂出巢采集等[12]。在正常蜂群中,哺育蜂每天需要飼喂大量幼蟲以保證整個蜂群的正常繁衍。He等[13]研究表明工蜂幼蟲利用信息素E--羅勒烯(E--ocimene,C10H16)向其哺育蜂乞求食物,并發(fā)現(xiàn)了該饑餓信息素(hunger pheromone)的生物合成通路。然而,蜂群中含有蜂王、工蜂與雄蜂,稱為三型蜂,它們在發(fā)育過程中所需的食物存在明顯差異。蜂王幼蟲在5 d飼喂期均食用蜂王漿,而工蜂與雄蜂幼蟲在1—3日齡時采食工蜂漿與雄蜂漿,4—5日齡采食蜂蜜與花粉混合而成的蜂糧[14]。有研究表明蜂王漿與工蜂漿及雄蜂漿成分不同,且即使是同一類型的蜜蜂幼蟲,每天采食的王漿在成分與數(shù)量上也存在顯著差異[14-17]?!颈狙芯壳腥朦c】蜂王與雄蜂幼蟲如何進行乞食,其乞食信息素成分是否有所不同?哺育蜂又是如何區(qū)分三型蜂幼蟲以及其日齡,并飼喂以不同成分的食物的?針對上述問題,利用Needle trap與氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù),分析鑒定蜂王與雄蜂幼蟲的饑餓信息素,并利用RNA-Seq技術(shù)分析鑒定蜂王與雄蜂幼蟲饑餓信息素的生物合成通路?!緮M解決的關(guān)鍵問題】通過分析鑒定蜂王與雄蜂幼蟲的饑餓信息素,并對比兩者之間的饑餓信息素差異,從而深入探索蜂群內(nèi)蜜蜂幼蟲的乞食行為及哺育蜂的飼喂行為機制。
信息素鑒定試驗于2014年4—6月在南京中醫(yī)藥大學完成,轉(zhuǎn)錄組測序試驗于2014年4—7月在北京百邁克生物科技有限公司完成。
1.1 供試昆蟲
信息素鑒定試驗使用3個西方蜜蜂()種群,飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(32.6°N,118.56 °E)。RNA-Seq試驗使用西方蜜蜂3個種群,飼養(yǎng)于江西農(nóng)業(yè)大學蜜蜂研究所(28.46°N,115.49 °E)。試驗蜜蜂蜂群參照西方蜜蜂的營養(yǎng)標準進行飼養(yǎng)[18]。
1.2 氣質(zhì)聯(lián)用標準曲線的建立
利用捕集針(needle trap)系統(tǒng)(德國PAS科技公司)與氣質(zhì)聯(lián)用儀(安捷倫公司,7890A/5975C)結(jié)合來鑒定并精確定量蜜蜂饑餓信息素,在試驗前首先建立了標準曲線。從Sigma公司購得內(nèi)標物1-壬烯(CAS:124-11-8,C9H18,純度>99.5%)與標準物E--羅勒烯(CAS:13877-91-3,C10H16,純度>90%)。將2 μL的1-壬烯配入20 ml的無水乙醇(南京化學試劑股份有限公司,分析純)中,并分為6組,每組分別加入0、1、2、4、8和16 μL的E--羅勒烯,振蕩攪勻。用移液槍從各組中選取2 μL溶液,并迅速移入20 mL采樣瓶中,封蓋后立即放入35℃培養(yǎng)箱(揚州三發(fā)電子有限公司,SHP-250)中放置45 min。然后利用捕集針從采樣瓶中吸取10 mL氣體,注入氣質(zhì)聯(lián)用儀進行分析。結(jié)果表明DB-5與VOC的標準曲線2值為0.9916與0.9926,均>0.99,符合氣質(zhì)聯(lián)用一般的曲線標準[19]。
1.3 幼蟲樣品的采集
利用免移蟲產(chǎn)卵技術(shù)[20-21],控王產(chǎn)卵12 h,并將卵移到王臺中進行培育蜂王,在2日齡與4日齡幼蟲期取蜂王幼蟲,做進一步試驗分析;利用同群已婚飛交尾的成年蜂王,在預先準備好的雄蜂巢脾上控王產(chǎn)卵12 h??赝醍a(chǎn)卵時,將蜂王用隔王柵隔離在單一的雄蜂巢脾上,并放在蜜蜂平箱群所有巢脾的最內(nèi)側(cè),使其產(chǎn)卵。在雄蜂幼蟲發(fā)育到2日齡與4日齡幼蟲期,采集樣品進行試驗。
信息素鑒定試驗中,利用移蟲針在30℃室溫條件下采集20只2日齡蜂王或雄蜂幼蟲,立即放入20 mL采樣瓶中,并迅速加入2 μL 1-壬烯內(nèi)標溶液(v﹕v=1﹕10 000)。在35℃的培養(yǎng)箱中放置45 min,作為饑餓幼蟲組;另外采集20只幼蟲,放入之前已經(jīng)鋪好2日齡蜂王漿或雄蜂漿的采樣瓶中,使每只幼蟲橫躺在王漿表面,加入內(nèi)標后放置到培養(yǎng)箱45 min,作為飼喂組;最后采集2日齡蜂王漿或雄蜂漿到采樣瓶中,作為對照組。饑餓45 min后,利用捕集針從采樣瓶中采集10 mL氣體,并注入氣質(zhì)聯(lián)用儀進行分析。每個樣品采集時間嚴格控制在5 min內(nèi)。每組樣品采集12個平行樣,其中6個樣品由DVB、PDMS與CAR1000捕集針采集,剩余6個樣品由脂肪酸型捕集針采集。由于4日齡工蜂個體較大,每個樣品只采集10只幼蟲。
分別取2日齡與4日齡蜂王、雄蜂幼蟲,進行饑餓與飼喂處理45 min,然后立即液氮冷凍,用于RNA-Seq試驗。
1.4 Needle Trap與GC-MS分析
利用捕集針(needle trap)技術(shù)與氣質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)分析鑒定蜂王與雄蜂幼蟲饑餓信息素。將捕集針一頭插入密閉的20 mL采樣瓶,一頭連接采集器,從采樣瓶中抽取氣體。本試驗利用20 MPa的壓強以5 mL·min-1的速度從采樣瓶中采集10 mL氣體。采集時將采樣瓶放入35℃的溫控裝置中恒溫采集。捕集針為極性(DVB、PDMS與CAR1000)與非極性(脂肪酸)兩種,分別配對DB-5(長度30 m,直徑25 μm)與VOC柱子(長度30 m,直徑25 μm)分離柱。
采集好的捕集針立即注入安捷倫公司生產(chǎn)的7890A/5975C型氣質(zhì)聯(lián)用儀。通過摸索,按如下最佳程序進樣分析:進樣口溫度為250℃;柱溫程序為35℃保持2 min,然后以8℃·min-1的速度從35℃上升至250℃,最后250℃保持5 min。離子源為電子轟擊源(electron impact ionization,EI),流動相為氦氣。氦氣氣壓保持6.7776 psi。獲得的化學物質(zhì)離子圖譜采用NIST32I數(shù)據(jù)庫進行比對,最終鑒定出捕集針中所吸附的揮發(fā)性化學物質(zhì)。在進樣時取一個1 mL容量的無菌注射器,從氣質(zhì)聯(lián)用儀中抽取1 mL氦氣,然后與采集完樣品的捕集針相連,并手動插入氣質(zhì)聯(lián)用儀的進樣口,30 s內(nèi)將1 mL氦氣緩緩注入氣質(zhì)聯(lián)用儀。該處理可使捕集針中的化學物質(zhì)完全洗脫,進入氣質(zhì)聯(lián)用儀分析。
1.5 RNA-Seq
采集蜂王與雄蜂2日齡與4日齡幼蟲的饑餓組與飼喂組幼蟲,進行RNA-Seq測序,獲得饑餓信息素的生物合成通路與調(diào)控基因。按標準TRlzol Reagent方法提取RNA(Life technologies,California,USA),用于RNA-Seq測序分析。利用3群西方蜂群,每個試驗組含有3個生物學重復。
首先,利用TRlzol法提取樣品的總RNA,再通過NEBNext Poly(A) mRNA磁性分離技術(shù)(NEB,E7490)分離出所需的mRNA。將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,并連接到Illumina上構(gòu)建上機文庫。制備好的文庫用1.8%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測文庫插入片段大小,然后用Library Quantification Kit-Illumina GA Universal (Kapa,KK4824)進行qPCR定量。檢測合格的文庫在illuminacbot上進行簇的生成,最后用Illumina HiSeqTM2500進行測序。
為了保證測序結(jié)果的高度準確性,去除了未知堿基比率>5%的reads,只保留測序錯誤率<1%的reads(Q20>98%)。然后利用Tophat2軟件[22]將所獲得的所有clean reads與蜜蜂基因組(OGSv3.2)進行比對。比對后的各個基因?qū)膔eads在cufflinks軟件[23]中對其表達量水平進行估計,并以FPKM值來記錄每個基因的表達量。最后,利用DESeq差異分析與Q-value統(tǒng)計方法來比對饑餓組與飼喂組之間基因的reads數(shù),最終獲得差異表達基因。當FDR值<0.05且lg2≥1.5時,即為基因表達存在顯著差異[24]。使用BLAST軟件對提取的基因序列與nr、SwissProt、GO、COG與KEGG數(shù)據(jù)庫進行比對,獲得各基因的注釋信息。
1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法
氣質(zhì)聯(lián)用實驗所獲得的數(shù)據(jù)全部利用“ANOVA or ANCOVA”在Statview 5.01(SAS Institute,Cary,NC,USA)軟件中進行比較分析。
2.1 蜂王與雄蜂幼蟲饑餓信息素鑒定
通過Needle trap與氣質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)分析,從2日齡與4日齡的雄蜂幼蟲中獲得了9個化學物質(zhì):E--羅勒烯(E--ocimene)、肉豆蔻酸(myristic acid)、棕櫚酸(palmitic acid)、甲基棕櫚酸脂(methyl palmitic ester)、硬脂酸(stearic acid)、棕櫚油酸(palmitoleic acid)、十五烷酸(pentadecanoic acid)、乙酸(acetic acid)、乙酸乙酯(ethyl acetate),與其對應標準物的離子圖譜匹配率均高于78%(表1、圖1、圖2)。在蜂王幼蟲中,除了發(fā)現(xiàn)這9種化學物質(zhì),還發(fā)現(xiàn)了一種特殊的化學物質(zhì),即2-庚酮(2-haptanone)(表1)。同時,圖3表明,E--羅勒烯是雄蜂與蜂王幼蟲中唯一在饑餓組中的釋放量顯著高于飼喂組的信息素,且在蜂王漿中未測到任何E--羅勒烯,表明蜂王與雄蜂幼蟲饑餓信息素為E--羅勒烯。在饑餓幼蟲組對比中,2日齡的蜂王與雄蜂幼蟲E--羅勒烯含量沒有差異,而4日齡組對比中,蜂王幼蟲的E--羅勒烯含量顯著低于雄蜂幼蟲組。值得注意的是,2日齡饑餓幼蟲組E--羅勒烯釋放量顯著高于4日齡饑餓幼蟲組(圖4)。
各個化學物質(zhì)的離子峰及出峰時間已標注。其中1-壬烯為內(nèi)標物,硅氧烷為色譜柱的柱流失
表1 氣質(zhì)聯(lián)用所測單只西方蜜蜂蜂王與雄蜂幼蟲釋放的化學物質(zhì)及含量
表中數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標準誤,是各化學物質(zhì)對1-壬烯的相對含量,E--羅勒烯為所測得的質(zhì)量(ng)。各幼蟲組內(nèi)食物組、飼喂組與饑餓組進行方差分析比較,同列不同小寫字母表示在5%水平上差異顯著
Values were the ratio of identified chemical to 1-nonene (means±SE), except the E--ocimene groups which were the real quality from each larva (ng). Food, fed and starving larvae in one larval group were analyzed with ANOVA test. Different letters in the same column indicated significant differences (<0.05)
各個化學物質(zhì)的離子峰及出峰時間已標注。1-壬烯為內(nèi)標物
不同字母表示同日齡幼蟲對比差異顯著Different letters on the bars indicated significant differences (P<0.05) within the same age larva comparisons
2.2 蜂王與雄蜂幼蟲饑餓組與飼喂組差異表達基因
2日齡蜂王幼蟲饑餓組與飼喂組差異基因為6個,4日齡對比組為287個;2日齡雄蜂幼蟲饑餓組與飼喂組差異基因為8個,4日齡對比組為0個。這些差異基因中,未發(fā)現(xiàn)任何基因與幼蟲的信息素合成相關(guān)。
蜂王幼蟲與雄蜂幼蟲具有一條從頭合成E--羅勒烯的生物合成通路(圖5),表明E--羅勒烯在幼蟲體內(nèi)由乙酰輔酶A經(jīng)甲羥戊酸途徑合成,這與工蜂幼蟲E--羅勒烯的生物合成通路相同[13]。參與該通路的9個基因在饑餓組與飼喂組中均表達差異不顯著(表2)。
“**”表示兩個日齡間差異顯著Significant differences between 2- and 4-day-old comparisons (P<0.05)
信息素是蜜蜂幼蟲與成年蜂之間的重要交流方式[12,25]。本研究鑒定分析出蜂王與雄蜂幼蟲饑餓信息素的主要成分為E--羅勒烯,這與工蜂幼蟲饑餓信息素成分相同[13]。前人研究表明,蜂王幼蟲采食5 d蜂王漿,而雄蜂幼蟲采食3 d雄蜂漿,后2 d采食蜂糧。即使在1—3日齡,蜂王漿與雄蜂漿成分也不同[14]。圖4表明2日齡時蜂王與雄蜂幼蟲釋放的羅勒烯并無顯著差異。那么哺育蜂是如何在黑暗的蜂箱中分辨出蜂王與雄蜂幼蟲,并飼喂其所需的各種食物的?有研究表明,蜂王在產(chǎn)卵過程中,先利用其觸角與前足丈量巢房的大小,再進行產(chǎn)受精卵或未受精卵[26]。因此,推測哺育蜂也可能利用相似的測量來分辨巢房大小,進而飼喂不同食物。有趣的是,蜂王幼蟲含有獨特的2-庚酮這類物質(zhì)。該信息素是工蜂上顎腺分泌的標記信息素,主要用于標記蜂巢的巢門方向與采集的花朵上,同時也可作為標記敵人的報警信息素[27-29]。因此,哺育蜂也可能利用2-庚酮標記需要飼喂的蜂王幼蟲,從而引導其他哺育蜂對蜂王幼蟲進行準確定位與飼喂。
圖5 蜂王與雄蜂幼蟲E-β-羅勒烯的生物合成通路
表2 蜂王與雄蜂幼蟲E-β-羅勒烯合成通路基因基因表達
本試驗表明2日齡蜂王與雄蜂幼蟲釋放E--羅勒烯量均顯著高于與其4日齡幼蟲,這與前人在不同日齡工蜂幼蟲中測得的E--羅勒烯量相一致[13,30]。哺育蜂是否可通過感知E--羅勒烯不同釋放量來區(qū)分幼蟲的日齡,仍需進一步研究。蜂王4日齡幼蟲E--羅勒烯釋放量顯著低于4日齡雄蜂幼蟲,這可能是由于蜂王幼蟲采食蜂王漿且個體較大,其耐餓性較強,從而在饑餓處理狀態(tài)下E--羅勒烯釋放量較低。
蜂王幼蟲與雄蜂幼蟲的E--羅勒烯由乙酰輔酶A與乙酰乙酰輔酶A通過甲羥戊酸途徑合成(圖5)。這一單萜生物合成途徑是一條十分保守的途徑,在其他昆蟲與植物中均發(fā)現(xiàn)了相似的合成途徑與同源基因[31-32]。因此,蜜蜂幼蟲通過該生物合成通路從頭合成E--羅勒烯,然而饑餓幼蟲組的-β-羅勒烯通路相關(guān)基因的表達量與其飼喂組并無顯著差異。這可能是E--羅勒烯的合成量只有幾納克,其基因表達量較低,不能直觀地從基因表達中表現(xiàn)出來。同時,飼喂幼蟲也釋放E--羅勒烯,從而減小了與饑餓組的基因表達差異。
利用Needle trap與氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析鑒定出了蜜蜂蜂王與雄蜂幼蟲的饑餓信息素為E--羅勒烯,并且利用RNA-Seq技術(shù)證實在幼蟲體內(nèi)通過甲羥戊酸途徑從頭合成該信息素。蜂王具有一種特有的信息素——2-庚酮。
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(責任編輯 岳梅)
Identification and biosynthetic pathway of a hunger pheromonein honeybee queen and drone larvae
HE Xu-jiang, JIANG Wu-jun, YAN Wei-yu, ZENG Zhi-jiang
(Institute of Honeybee, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045)
【Objective】The objective of this study is to identify the hunger pheromone of honeybee queen and drone larvae and its biosynthetic pathway, which would enormously contribute to understanding of the mechanism of communication between adults and larvae in honey bees. 【Method】Two- and four-day-old queen and drone larvae and their food were collected and divided into three groups: fed larvae, starving larvae and food. For the fed larvae they were lain on their relative foods prepared in advance, and for the starving larvae their foods were totally deprived. All samples were immediately put into 20 mL sealed glass bottles and were kept in an incubator under 35℃for 45 min. Afterward, a needle trap system was employed to extract 10 mL gas from those bottles and the volatile chemicals were enriched in needles. The needles were injected into a gas chromatography-mass spectrometry system and the chemicals were dissociated by a high temperature of 250℃for identifying the hunger pheromone of honeybee queen and drone larvae. RNA-Seq was used for identifying the biosynthetic pathway of their hunger pheromone and the expression of related genes. 【Result】Nine and ten chemicals were identified in drone larvae and queen larvae, respectively, in which queen larvae had one more chemical (2-heptanone) that was the highest royal jelly. E--ocimene was identified as the hunger-signal pheromone of queen and drone larvae, since their starving larvae had significantly more E--ocimene than related fed larvae. The E--ocimene released from queen and drone starving larvae was not significantly different at 2-day-old, but queen larvae released significantly less E--ocimene than drone larvae at 4-day-old. Other eight chemicals were myristic acid, palmitic acid, methyl palmitic ester, stearic acid, palmitoleic acid, pentadecanoic acid, acetic acid and ethyl acetate, but did not show a clear pattern that significantly more amount of these chemicals were detected in starving larvae released than fed larvae and food groups. Acetic acid and ethyl acetate were detected higher in food and fed larvae groups compared to starving larvae groups, indicating that these two chemicals may be from their food rather themselves. RNA-Seq analysis showed that there was aE--ocimene biosynthetic pathway in queen and drone larvae via a mevalonate pathway. Nine genes such asandwere involved in this biosynthetic pathway, but all these genes were not significantly differentially expressed between starving larvae and their relative fed larvae. 【Conclusion】Honeybee queen and drone larvae both use E--ocimene as their hunger pheromone for food begging, and they have aE--ocimene biosynthetic pathway. Further, nurse honeybees specifically use 2-heptanone to mark queen larvae for guiding other nurses. This study will enrich our understanding of the biological characteristics of honeybees.
; hunger pheromone; E--ocimene; biosynthetic pathway; gene expression
2016-06-07;接受日期:2016-08-03
國家蜂產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-45-KXJ12)、江西省科技落地計劃(KJLD13028)、江西省研究生創(chuàng)新專項基金(YC2014-B033)
何旭江,E-mail:hexujiang3@163.com。江武軍,E-mail:1165703453@qq.com。何旭江和江武軍為同等貢獻作者。通信作者曾志將,E-mail:bees1965@sina.com