家禽卵泡顆粒細胞體外培養(yǎng)方法研究進展

羅　茜　陳　偉　鄭春田　林映才　王勝林　阮　棟　王　爽

夏偉光　邱月琴　熊云霞

(廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物科學研究所,畜禽育種國家重點實驗室,農(nóng)業(yè)部華南動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室,廣東省動物育種與營養(yǎng)公共實驗室,廣東省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點實驗室,廣州510640)

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家禽卵泡顆粒細胞體外培養(yǎng)方法研究進展

羅茜陳偉*鄭春田*林映才王勝林阮棟王爽

夏偉光邱月琴熊云霞

(廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物科學研究所,畜禽育種國家重點實驗室,農(nóng)業(yè)部華南動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室,廣東省動物育種與營養(yǎng)公共實驗室,廣東省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點實驗室,廣州510640)

家禽卵巢中顆粒細胞在卵泡發(fā)育和閉鎖中起著重要作用，包括信號傳遞、營養(yǎng)供給以及離子平衡等。卵泡顆粒細胞的增殖與分化自身也受到生殖激素和細胞因子的綜合調(diào)節(jié),其作用機制是當前研究熱點。家禽卵泡顆粒細胞的體外培養(yǎng)可作為研究繁殖生理調(diào)節(jié)的理想細胞模型。本文對家禽卵泡顆粒細胞的體外培養(yǎng)研究現(xiàn)狀及顆粒細胞在卵泡生長發(fā)育和閉鎖中的作用進行簡要概述，并總結了原代顆粒細胞體外培養(yǎng)模型的建立方法。

家禽；卵泡顆粒細胞；體外培養(yǎng)

卵巢是雌性動物主要繁殖器官,位于卵泡內(nèi)的顆粒細胞在維持卵巢繁殖功能上發(fā)揮著極其重要的作用。家禽的卵泡壁結構上主要由卵黃膜周圍層、顆粒細胞層、卵泡膜內(nèi)層、卵泡膜外層以及外圍的結締組織和生殖上皮層構成(圖1)。卵泡壁主要功能是為卵母細胞的生長提供營養(yǎng)物質(zhì)、合成和分泌類固醇激素,從而調(diào)控卵泡生長發(fā)育及排卵[1]。研究表明,家禽產(chǎn)蛋性能很大程度上取決于卵泡的發(fā)育狀況[1],卵泡中顆粒細胞可通過合成激素與生長因子(如孕酮、干細胞生長因子和表皮生長因子等)參與卵泡調(diào)控,包括原始卵泡的啟動、生長卵泡的發(fā)育、優(yōu)勢卵泡的選擇及成熟卵泡的排卵[2]。研究表明,顆粒細胞凋亡是導致卵泡閉鎖的根本原因,而由于閉鎖卵泡的數(shù)量直接影響到產(chǎn)蛋率的高低[2],因此顆粒細胞的發(fā)育決定著卵泡的生長和蛋禽最終產(chǎn)蛋性能。理論上,建立原代顆粒細胞體外培養(yǎng)模型是探索家禽卵巢內(nèi)分泌功能及調(diào)控機制和卵泡發(fā)育機制的重要途徑,這不僅有助于研究顆粒細胞在卵泡閉鎖時的作用,而且對為生產(chǎn)提供提高禽繁殖能力的相應措施具有重要指導意義。

1　顆粒細胞在卵泡生長發(fā)育中的作用

家禽原始卵泡發(fā)育成生長卵泡的過程不依賴于激素的調(diào)節(jié),而是通過顆粒細胞分泌的干細胞因子與卵母細胞中c-Kit受體結合,從而啟動原始卵泡募集,促進卵母細胞的生長[2]。細胞因子如胰島素樣生長因子家族、表皮生長因子家族和轉(zhuǎn)化生長因子-β超家族能促進顆粒細胞的增殖和孕酮分泌,參與維持卵母細胞和顆粒細胞間的功能性偶聯(lián),進而促進卵母細胞的發(fā)育成熟[3]。卵母細胞通過間隙連接從周圍的顆粒細胞中攝取小分子代謝物,并且通過與顆粒細胞間的離子交換得以調(diào)節(jié)卵母細胞內(nèi)pH。卵母細胞和顆粒細胞之間通過縫隙連接蛋白相互影響,顆粒細胞可通過縫隙連接相互傳遞信息,促進卵母細胞的成熟和發(fā)育；同時,卵母細胞也可分泌細胞因子,反饋性促進顆粒細胞的增殖、分化。為了改善卵母細胞體外成熟的環(huán)境,體外培養(yǎng)最開始會加入顆粒細胞之類的卵泡膜層細胞共同培養(yǎng)[4]。Fukui等[5]研究發(fā)現(xiàn)顆粒細胞與卵母細胞體外共同培養(yǎng)可以

促進卵母成熟。可見,顆粒細胞與卵母細胞的互相作用決定著卵泡的發(fā)育命運[6]。

A:整個成熟卵泡 The whole mature follicle；B:A中圓圈部分放大圖 A larger version of the circle part of Fig.A；C:B中圓圈部分放大圖 A larger version of the circle part of Fig.B；1:初級卵母細胞 Primary oocyte；2:卵黃膜和放射帶 Vitelline membrane and zona radiata；3:卵黃膜周圍層 Enveloping layer of the vitelline membrane；4:顆粒細胞層 Stratum granulosum；5:基膜 Bsilemma；6:卵泡膜內(nèi)層 Theca folliculi interna；7:卵泡膜外層 Theca folliculi externa；8:結締組織層 The connective tissue layer；9:生殖上皮層 Reproductive epithelial layer；10:卵泡帶 Follicles band；11:卵泡柄 Follicles handle；12:動脈 Artery；13:靜脈 Vein；14:顆粒細胞 Granulosa cells。

圖1家禽成熟卵泡結構示意圖

Fig.1Schematic diagram of poultry mature follicle structure[1]

卵泡閉鎖是一種正常的繁殖生理過程,是指卵泡從發(fā)育到排卵前所發(fā)生的退化并最終被清除的生理過程。而在家禽中,閉鎖卵泡的數(shù)量直接影響到產(chǎn)蛋率的高低。有研究先后在雞、大鼠、豬、牛和綿羊等動物卵泡閉鎖中發(fā)現(xiàn)顆粒細胞的凋亡,當發(fā)育卵泡中10%以上的顆粒細胞發(fā)生凋亡時,則表明該卵泡已經(jīng)或正在發(fā)生閉鎖,且卵泡一旦進入閉鎖就不能再回到正常的發(fā)育軌道中[7]。在關于哺乳動物體外培養(yǎng)的顆粒細胞的研究發(fā)現(xiàn)孕酮具有抑制卵泡顆粒細胞凋亡的作用,而禽類的孕酮主要由卵泡顆粒細胞產(chǎn)生[2],因此禽類的顆粒細胞調(diào)控著卵泡閉鎖的發(fā)生。大量研究通過使用不同激素或藥物對體外培養(yǎng)顆粒細胞進行誘導,根據(jù)顆粒細胞凋亡狀況來探討該激素或藥物對卵泡閉鎖的影響。其中李彩萍[8]的體外培養(yǎng)水牛卵泡顆粒細胞試驗發(fā)現(xiàn),促卵泡激素可以顯著地抑制顆粒細胞凋亡。

綜上可見,卵泡顆粒細胞是成熟卵泡中最大的細胞群,其包圍且滋養(yǎng)著卵母細胞,在家禽卵泡的成熟過程中具有重要的調(diào)節(jié)作用,研究顆粒細胞的生物學調(diào)節(jié)具有重要意義。顆粒細胞體外培養(yǎng)是對其研究的一項很好的試驗方法,但目前由于顆粒細胞至今尚無建立的細胞系,僅能通過卵泡中細胞分離獲得原代細胞。

2　顆粒細胞的分離與體外培養(yǎng)

2.1顆粒細胞的提取分離

建立原代顆粒細胞體外培養(yǎng)的主要目標是獲得數(shù)量充足、活力較好的卵泡顆粒細胞。根據(jù)國內(nèi)外文獻可大致將顆粒細胞層分離方法分為2種,其方法的選擇是根據(jù)卵泡的大小而定。

方法1:家禽大卵泡一般使用Gilbert等[9]首次發(fā)表的關于家禽卵泡顆粒細胞分離的方法。具體為處死動物后,無菌環(huán)境摘取卵巢。用鑷子夾住卵泡,迅速切開卵泡,將卵泡翻轉(zhuǎn)在裝有液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中,吹洗卵黃,將復合膜從卵黃中分離出來。得到的復合膜由卵黃周圍層、顆粒細胞層和基膜組成。方法2:小黃卵泡中顆粒細胞層的分離則是在Gilbert等[9]的方法基礎上改進。在卵黃釋放后,將復合膜翻轉(zhuǎn)在無菌生理鹽水中,振蕩,讓顆粒細胞層分離并沉降,收集沉淀物為顆粒細胞層和散在的顆粒細胞。目前禽類卵泡顆粒細胞分離方法得到的并不是純顆粒細胞,會包含卵黃和卵泡內(nèi)膜細胞。方法1在分離顆粒細胞層時,顆粒細胞層比較松散,常跟卵黃混在一起,卵黃能通過細胞清洗減少，而方法2振蕩復合膜還可能影響細胞活性。

顆粒細胞層分離后需進一步提取可獲得顆粒細胞,其提取方法可分為機械分離法和酶消化分離法[10]。機械分離法:將獲得的顆粒細胞層放入預冷的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中。用眼科剪剪切顆粒細胞層,過篩得到顆粒細胞[11]。酶消化分離法:在顆粒細胞層中加入含有膠原蛋白酶的培養(yǎng)液中消化,終止離心后,沉淀為顆粒細胞。Asem等[10]總結發(fā)現(xiàn)機械方法分離培養(yǎng)在Earle's平衡鹽溶液(EBSS)中的顆粒細胞激素刺激應答分泌的孕酮要明顯少于酶消化方法分離培養(yǎng)在M199培養(yǎng)液中的顆粒細胞。近年來,國內(nèi)外報道通常采用機械分離法和酶消化分離法相結合來提取顆粒細胞,即在機械分離獲得顆粒細胞層后,直接用眼科剪剪成碎片(不添加緩沖溶液),隨后加入含有膠原蛋白酶Ⅱ的培養(yǎng)液消化,消化終止后過篩。消化完成后建議裂解紅細胞,由圖1可知分離得到的復合膜層含有靜脈,提取的顆粒細胞中還會含有血細胞,這將影響細胞形態(tài)觀察,但是紅細胞裂解可能影響細胞活性,因此，可根據(jù)試驗目的進行調(diào)整。

2.2顆粒細胞的培養(yǎng)方法

顆粒細胞的培養(yǎng)通常在細胞培養(yǎng)液中添加血清(主要為胎牛血清),其目的是為細胞提供基本營養(yǎng)物質(zhì),并提供結合蛋白、促接觸和伸展因子使細胞貼壁免受機械損傷。根據(jù)試驗需要,禽類顆粒細胞培養(yǎng)液中胎牛血清的補充一般范圍在0～10%,一些試驗中會在無血清或低血清培養(yǎng)基中添加0.1%牛血清白蛋白(albumin from bovine serum,BSA)[6,12-18]。然而Chiang等[19]研究發(fā)現(xiàn)BSA可能改變顆粒細胞生理反應,如添加BSA可使顆粒細胞內(nèi)電壓激活性鈣離子電流快速增加。因此,在研究顆粒細胞功能時不建議添加BSA。Picton等[20]研究發(fā)現(xiàn)無血清培養(yǎng)基能維持體外培養(yǎng)的豬卵泡顆粒細胞正常分化。盡管不添加血清可減少對試驗處理的干擾,但在一定程度上影響到細胞的生長(血清中含有促細胞生長因子)。為兼顧細胞生長和試驗處理,研究者多采用含5%血清培養(yǎng)液培養(yǎng)觀察貼壁后,換掉原培養(yǎng)液用無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h,再進行試驗處理,從而減少血清中未知物質(zhì)對試驗造成的干擾[21]。浙江大學張才喬教授實驗室建立的雞顆粒細胞體外研究實驗模型是小黃卵泡顆粒細胞在低濃度(0.5%)胎牛血清培養(yǎng)16 h后換成無血清培養(yǎng)液[6]。

溫度是維持細胞生長的必要條件,因細胞類型不同其適宜培養(yǎng)溫度也存在著差異性。一般而言,在培養(yǎng)溫度達到細胞耐受上限之前,細胞活力隨溫度升高而增加；而當溫度超過耐受上限時,細胞活力則受到抑制,細胞功能受到影響[22]。不同動物卵泡中顆粒細胞的體外培養(yǎng)溫度存在一定差異。人和豬的顆粒細胞體外培養(yǎng)溫度為37 ℃[23-24],大鼠和小鼠的體外培養(yǎng)溫度一般為37 ℃,而牛、綿羊體外培養(yǎng)溫度則需38.0～38.5 ℃。家禽的體溫較哺乳動物的高,因此推斷38.5～41.0 ℃培養(yǎng)的家禽卵泡顆粒細胞增殖率可能高于37 ℃。例如，Wen等[14]采用38.5 ℃培養(yǎng)鵝F1～F3卵泡顆粒細胞；Rangel等[23]則選擇41 ℃培養(yǎng)雞F1卵泡顆粒細胞,但也有較多研究者選擇37 ℃進行培養(yǎng)。

細胞生長除需適宜溫度外,還依賴于營養(yǎng)的供給。在培養(yǎng)液選擇方面,哺乳動物顆粒細胞培養(yǎng)液因種屬差異而不同。大鼠或小鼠選擇杜爾伯科改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)效果較好,羊選用M199培養(yǎng)液顆粒細胞的存活率更高[21]；Asem等[10]比較不同培養(yǎng)基發(fā)現(xiàn),對雞的卵泡顆粒細胞采用M199或者F12培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞時,其分泌的孕酮最多[7]；而Wen等[14]體外培養(yǎng)鵝卵泡顆粒細胞時使用DMEM/F12培養(yǎng)液[14]；大部分禽類顆粒細胞研究中多選擇M199培養(yǎng)液[21]。

2.3顆粒細胞的鑒定

獲取得到卵泡顆粒細胞后,首先需采用臺盼藍染色法檢測顆粒細胞活性[14],一般要求細胞活力達到90%以上。同時可采用噻唑藍(MTT)法[25]或者細胞計數(shù)試劑盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)法[14]檢測細胞增殖率,觀測細胞增殖情況。MTT法中,由于不同裂解液的溶解能力及其產(chǎn)生的背景信號對光密度(OD)值的測量結果的影響,和實際操作中容易帶走部分細胞,而導致誤差增大。而在使用CCK-8試劑時,實際操作時細胞損失少,誤差較小[26]。

分離獲得的顆粒細胞可通過促卵泡激素受體(follicle-stimulating hormone receptor,FSHR)免疫組化或抗繆勒氏管激素(AMH)免疫組化來進行鑒定。顆粒細胞是卵巢組織中唯一表達FSHR的細胞,眾多研究選擇FSHR免疫組化染色對卵泡顆粒細胞進行鑒定。AMH是轉(zhuǎn)化生長因子-β超家族的一員,主要在生長卵泡的顆粒細胞中表達,但閉鎖卵泡顆粒細胞和內(nèi)膜細胞不表達,因此也有研究選擇AMH免疫組化染色鑒定顆粒細胞[27]。

3　小　結

顆粒細胞體外培養(yǎng)研究始于20世紀70年代初,人與哺乳動物的顆粒細胞體外培養(yǎng)方法經(jīng)不斷改進、完善,現(xiàn)已成為研究生殖生理和內(nèi)分泌等的一種重要手段,并逐漸被應用到家禽顆粒細胞及卵泡發(fā)育調(diào)控研究中來。相比動物試驗,卵泡顆粒細胞體外培養(yǎng)具有費用低、周期短、易于重復的優(yōu)點,對應用于卵泡細胞甾體激素的生成和調(diào)節(jié)的研究具有較明顯的優(yōu)勢。顆粒細胞體外培養(yǎng)能避免其他細胞因子的干擾,更有利于深入研究顆粒細胞的生理學調(diào)控機制。卵泡顆粒細胞體外培養(yǎng)不僅可用于分析促卵泡激素等激素的生理活性,也可用于探討某些因子或藥物對卵巢的作用。然而,家禽卵泡分離提取獲得的顆粒細胞并未用FSHR免疫組化檢測細胞純度,亦未研究其純化方法,因而采用原代細胞提取的顆粒細胞中可能含有卵母細胞、膜內(nèi)層細胞和卵黃等物質(zhì),分離培養(yǎng)的顆粒細胞仍存有許多問題,如細胞是否能長期維持其活性、增殖力和特征性表型。研究發(fā)現(xiàn),長時期培養(yǎng)的原代顆粒細胞,形態(tài)逐漸類似于成纖維細胞,多數(shù)細胞在培養(yǎng)第7天左右就開始出現(xiàn)退行性反應[28]。因此,如何優(yōu)化純化顆粒細胞方法、延長體外顆粒細胞原代培養(yǎng)時細胞的生長時間,阻止細胞出現(xiàn)退行性反應,是顆粒細胞體外培養(yǎng)方法的重要研究方向。其目標的實現(xiàn)必將為更深入研究促性腺激素、甾體類激素及多肽類生長因子等對顆粒細胞功能的影響提供可靠方法。

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*Corresponding authors: CHEN Wei, associate professor, E-mail: cwei010230@163.com; ZHENG Chuntian, professor, E-mail: zhengcht@163.com

(責任編輯田艷明)

The Overview of Granulosa Cells CultureinVitroof Fowl Follicle

LUO XiCHEN Wei*ZHENG Chuntian*LIN YingcaiWANG ShenglinRUAN Dong WANG ShuangXIA WeiguangQIU YueqinXIONG Yunxia

(Institute of Animal Science, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, State Key Laboratory of Livestock and Poultry Breeding, Key Laboratory of Animal Nutrition and Feed Science in South China,Ministry of Agriculture, Guangdong Public Laboratory of Animal Breeding and Nutrition,Guangdong Key Laboratory of Animal Breeding and Nutrition, Guangzhou 510640, China)

Granulosa cells play an important role in the development and atresia of follicles in poultry, including mediating signal transduction, supplying nutrients for oocyte, and ion balance regulating, etc. Varieties of reproductive hormones and cytokines determine the fate of follicle by affecting the proliferation and differentiation of granulosa cells, and the related mechanism is of great interest for research. Cultureinvitroof granulosa cells provides an idea way in studying fowl reproductive physiology regulation. In this review, we overviewed the research progress of granulosa cells cultureinvitroof fowl follicle and the role of granulosa cells in follicular development and atresia, and summarized the method of primary cultureinvitrofor follicular granulosa cells.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2016, 28(9)：2681-2686]

fowl; follicle granulosa cells;invitroculture

10.3969/j.issn.1006-267x.2016.09.003

2016-03-03

國家自然科學基金(31301995)；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系建設專項資金資助(CARS-43-13)

羅茜(1990—)，女，湖南郴州人，實習助理研究員，碩士，研究方向為水禽營養(yǎng)與飼料。E-mail: xiaibm@163.com

陳偉，副研究員，E-mail： cwei010230@163.com；鄭春田，研究員，碩士生導師，E-mail: zhengcht@163.com

S814.1

A

1006-267X(2016)09-2681-06