基于 CdSe/ZnS 量子點構(gòu)建多巴胺熒光檢測方法的研究

申晨凡，張直峰，郭瑜桉，閆桂琴

(山西師范大學(xué)　生命科學(xué)學(xué)院，山西　臨汾　041000)

?

基于 CdSe/ZnS 量子點構(gòu)建多巴胺熒光檢測方法的研究

申晨凡，張直峰，郭瑜桉，閆桂琴*

(山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西臨汾041000)

以 CdSe/ZnS 量子點為熒光探針，基于多巴胺對 CdSe/ZnS 量子點的熒光猝滅效應(yīng)，建立了一種可快速測定多巴胺的熒光檢測方法。在最優(yōu)實驗條件下(pH 7.4，反應(yīng)時間20 min)，多巴胺濃度在 0.01～0.7 μmol/L范圍內(nèi)與CdSe/ZnS 量子點的熒光猝滅強(qiáng)度比值呈良好的線性關(guān)系(r=0.996)，方法檢出限為1.6×10-4μmol/L，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.2%。與文獻(xiàn)報道的方法相比，該方法的檢出限更低，更為靈敏，可用于多巴胺注射液及人體尿樣中多巴胺的快速檢測。

CdSe/ZnS量子點；多巴胺；熒光；檢測

多巴胺(Dopamine，DA)作為哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的神經(jīng)遞質(zhì)，在維持與調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、腎臟功能以及荷爾蒙的分泌等方面具有重要作用，其在機(jī)體內(nèi)的濃度變化與許多疾病的發(fā)生密切相關(guān)。體內(nèi)多巴胺分泌失調(diào)是導(dǎo)致神經(jīng)肌肉失調(diào)、精神分裂癥、帕金森病、阿爾茨海默氏病等多種精神類疾病發(fā)生的重要原因[1-3]。體內(nèi)多巴胺含量也是臨床上精神類疾病檢測的重要指標(biāo)。作為一種心血管藥物，多巴胺具有增強(qiáng)心肌收縮、擴(kuò)張內(nèi)臟血管、增加腎血流量的功能，常用于心肌梗塞、腎功能衰竭、支氣管哮喘以及失血性、心源性及感染性休克的治療[4]。因多巴胺在機(jī)體內(nèi)的濃度變化直接影響人體的精神活動，在藥物注射與服用時不但需要嚴(yán)格控制劑量，而且需要一個準(zhǔn)確的定量檢測方法。目前,已報道的多巴胺檢測方法主要包括毛細(xì)管電泳分析法[5]、電化學(xué)分析法[6]、比色分析法[7]和流動注射分析法[8]等。其中，熒光檢測法由于簡單快速且檢出限低而受到廣泛關(guān)注。Zhao 等[9]通過ZnO量子點的發(fā)光特性實現(xiàn)了對人血清中多巴胺的檢測；Mu 等[10]利用腺苷酸包覆的CdSe/ZnS量子點對多巴胺進(jìn)行了檢測；Liu等[11]構(gòu)建了3-氨基苯硼酸功能化的 CuInS2量子點作為近紅外熒光探針來檢測多巴胺。因此，基于熒光檢測法的優(yōu)越性，探索一種簡單快速、靈敏且成本低的多巴胺檢測方法具有重要意義。

近年來，量子點作為一種新型的半導(dǎo)體納米發(fā)光材料為各種分析物的快速測定提供了可能。與傳統(tǒng)的有機(jī)染料相比，量子點由于具有量子產(chǎn)率高、光穩(wěn)定性強(qiáng)、發(fā)射波長可調(diào)、抗漂白能力強(qiáng)且易于修飾等特性而廣泛應(yīng)用于無機(jī)離子、有機(jī)小分子以及生物大分子的靈敏檢測[12-14]。目前廣泛應(yīng)用的量子點主要有CdTe[15],CdSe[16], CdS[17]等單核型量子點，但單核型量子點存在表面缺陷較多、熒光效率較低、光致氧化的穩(wěn)定性較差等不足。最近研究顯示，在單核型量子點的基礎(chǔ)上進(jìn)一步經(jīng)量子點包覆形成核殼型量子點后，可有效克服單核型量子點的不足，且光學(xué)性能更為穩(wěn)定，可有效增加對分析物檢測的靈敏性[18-19]。

本研究基于多巴胺對水溶性羧基 CdSe/ZnS 量子點熒光的靈敏猝滅特性，建立了一種簡單、快速、靈敏且選擇性好的多巴胺檢測方法，該方法可有效應(yīng)用于多巴胺注射液與人體尿液中多巴胺濃度的快速測定。

1　實驗部分

1.1試劑與儀器

CdSe/ZnS 量子點(熒光量子產(chǎn)率為82%，武漢珈源量子點技術(shù)開發(fā)有限公司)；多巴胺( 純度≥98% ，北京百靈威科技有限公司)；鹽酸多巴胺注射液(2 mL：20 mg，上海禾豐制藥有限公司)；高純水(18.2 MΩ·cm)采用 WaterPro 水純化系統(tǒng)(Labconco 公司，美國)制備；其它所用試劑均為分析純。

CdSe/ZnS 量子點的外觀形貌通過 JEM-2100 透射電鏡(日本電子,日本)在 200 kV 高速電壓下掃描獲得：將量子點分散于水中，超聲30 min后，取數(shù)滴樣品分散于銅網(wǎng)上，充分干燥后測定；熒光光譜分析采用 Cary Eclipse 熒光分光光度計(瓦里安公司，美國)進(jìn)行測定：樣品溶液置于四面通石英比色池(1 cm×1 cm)中，激發(fā)波長300 nm，掃描范圍500 ～700 nm，激發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度均為10 nm；紫外吸收光譜采用 UV-29100 紫外-可見分光光度計(島津公司，日本)進(jìn)行測定；溶液pH值采用PHS-3C型pH計(雷磁公司)進(jìn)行測定。

1.2實驗方法

1.2.1測定方法將多巴胺用水配成終濃度為10 μmol/L 的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液，在一系列10 mL 比色管中，依次加入0.5 mL 2.0×105μmol/L 磷酸緩沖液(PBS，pH 7.4)、0.01 mL 0.08 μmol/L 的 CdSe/ZnS 量子點溶液和不同濃度的多巴胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，用水定容至 5 mL，搖勻，于室溫下反應(yīng) 20 min 后，進(jìn)行熒光分析。

1.2.2樣品分析將多巴胺注射液用水稀釋成終濃度為50 μmol/L的母液，采集正常成年人志愿者的尿樣，分析前稀釋 100 倍，無需做其它預(yù)處理。

2　結(jié)果與討論

2.1CdSe/ZnS 量子點的表征

通過高分辨率透射電鏡對水溶性 CdSe/ZnS 量子點掃描觀測可知，量子點顆粒近似于球型，尺寸均一，總體分散性良好，粒徑約為5 nm(圖1A)；熒光光譜掃描顯示(圖1B)，量子點的最大激發(fā)波長位于 300 nm 處(曲線a)，而最大發(fā)射波長位于 595 nm 處(曲線b)。與文獻(xiàn)報道結(jié)果基本吻合[20]，說明量子點發(fā)光性能良好。

2.2多巴胺濃度對CdSe/ZnS量子點熒光猝滅的影響

為了證實利用CdSe/ZnS量子點測定多巴胺的可行性，分析了多巴胺濃度對量子點熒光強(qiáng)度的影響，從圖2可知，多巴胺可有效猝滅CdSe/ZnS量子點的熒光，且猝滅程度隨多巴胺濃度的增加而增加(插圖)，說明采用CdSe/ZnS量子點測定多巴胺具有一定可行性。

2.3實驗條件的優(yōu)化

基于以上結(jié)果，進(jìn)一步考察了相同pH值條件下2.0×104μmol/L的Tris-HCl與 PBS緩沖液對CdSe/ZnS量子點熒光強(qiáng)度的影響，發(fā)現(xiàn)CdSe/ZnS量子點在PBS 緩沖液中具有較強(qiáng)的熒光強(qiáng)度，且多巴胺猝滅CdSe/ZnS量子點熒光強(qiáng)度的效果更明顯。因此，實驗選擇PBS緩沖液為最佳介質(zhì)。

考察了緩沖液 pH值及濃度對體系熒光強(qiáng)度的影響，結(jié)果顯示，PBS緩沖液在pH 5.5～6.5時，多巴胺對CdSe/ZnS量子點的熒光猝滅強(qiáng)度隨溶液pH值的增加而明顯增強(qiáng)，在pH 6.5～8.0之間時，猝滅強(qiáng)度相對穩(wěn)定，為了便于體液的測定，實驗選擇pH 7.4 的PBS緩沖液。當(dāng)緩沖液的濃度在4.0×103～1.6×104μmol/L范圍時，隨著濃度的增加，體系熒光猝滅強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，在2.0×104～4.0×104μmol/L范圍時，猝滅強(qiáng)度相對穩(wěn)定。因此，選擇2.0×104μmol/L pH 7.4的PBS緩沖液進(jìn)行后續(xù)實驗。

進(jìn)一步考察了反應(yīng)時間對多巴胺猝滅CdSe/ZnS量子點熒光強(qiáng)度的影響。結(jié)果表明，在CdSe/ZnS量子點溶液中加入多巴胺，20 min 后反應(yīng)基本達(dá)到平衡，且在后續(xù)45 min基本無明顯變化。因此，選擇在反應(yīng) 20 min 后進(jìn)行測定。

實驗還考察了鹽濃度對多巴胺猝滅CdSe/ZnS量子點熒光強(qiáng)度的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)NaCl濃度達(dá)到3.0×102μmol/L時，多巴胺對CdSe/ZnS量子點的熒光猝滅強(qiáng)度基本保持穩(wěn)定，說明鹽濃度不影響CdSe/ZnS量子點對多巴胺的檢測。

2.4多巴胺的檢測

在上述優(yōu)化實驗條件下，考察了CdSe/ZnS量子點的熒光強(qiáng)度比值(F0/F)與多巴胺濃度(CDA，μmol/L)之間的線性關(guān)系。結(jié)果顯示，多巴胺在0.01～0.7 μmol/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為F0/F=2.51CDA+1.06(其中F0為不含多巴胺時的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)為含多巴胺時的熒光強(qiáng)度)，相關(guān)系數(shù)(r)為0.996，方法的檢出限(3σ)為1.6×10-4μmol/L。對含有和不含有多巴胺的體系連續(xù)平行檢測11次，熒光強(qiáng)度變化的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.2%。

將該方法與檢測多巴胺的其他方法進(jìn)行對比，結(jié)果顯示，本方法的檢出限更低(見表1)。

表1　不同檢測多巴胺方法的比較Table 1　Comparison of different analytical methods for detection of DA

2.5共存物質(zhì)的影響

考察了多巴胺注射液與生物體液中可能共存的無機(jī)離子與有機(jī)分子對檢測體系的干擾。當(dāng)多巴胺的濃度為0.1 μmol/L時，考察了500倍的Na+和K+，150倍的Ca2+，300倍的葡萄糖，250倍的蔗糖和谷氨酸，200倍的酪氨酸，150倍的賴氨酸和脯氨酸，25倍的抗壞血酸和尿酸，15倍的甘氨酸對多巴胺測定的影響。結(jié)果顯示，上述干擾物的加入對多巴胺測定均無明顯影響(相對誤差<5%)，說明該方法對檢測多巴胺具有較好的選擇性。

2.6實際樣品分析

為了證實該方法在實際應(yīng)用中的可行性，通過加標(biāo)回收的方法對多巴胺注射液(0.02～0.04 μmol/L)和人體尿樣進(jìn)行實驗。測得其回收率為97.5%～105.0% ，RSD為2.7%～3.3%(表2)，結(jié)果滿意，說明該方法具有一定的實用價值。

表2　加標(biāo)回收率實驗結(jié)果(n=3)Table 2　Results of recovery by standard addition method(n=3)

2.7機(jī)理探討

分析物對量子點熒光猝滅的機(jī)制主要是通過共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)[23]、電子轉(zhuǎn)移(ET)[24]以及表面吸附分子對量子點表面態(tài)能級的改變來改變體系的發(fā)光[25]。其中FRET和ET是兩種常見的信號傳導(dǎo)模式。對多巴胺紫外可見吸收光譜和CdSe/ZnS量子點發(fā)射光譜的分析顯示(圖3A)，多巴胺的紫外可見吸收光譜和CdSe/ZnS量子點的發(fā)射光譜無重疊，說明多巴胺與量子點之間不存在FRET的可能性，因此，F(xiàn)RET作為多巴胺猝滅CdSe/ZnS量子點熒光的機(jī)制可被排除。

對CdSe/ZnS量子點、多巴胺和CdSe/ZnS量子點-DA的紫外吸收光譜進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)多巴胺和CdSe/ZnS量子點在200～350 nm波長范圍內(nèi)均無明顯吸收峰(圖3B曲線a和c)。當(dāng)加入量子點后，多巴胺的吸收光譜位置(280 nm處)和強(qiáng)度未發(fā)生明顯變化(圖3B曲線b)，因此多巴胺猝滅CdSe/ZnS量子點的熒光并非由于光譜的內(nèi)過濾效應(yīng)所致。從熒光光譜圖(圖2)也可看出，隨著多巴胺濃度的增加，CdSe/ZnS量子點的熒光光譜未出現(xiàn)明顯的紅移或藍(lán)移，表明加入多巴胺不會導(dǎo)致CdSe/ZnS量子點發(fā)生團(tuán)聚或尺寸減小[26]。因此，可排除基于表面相互作用所引起CdSe/ZnS量子點團(tuán)聚或尺寸減小而導(dǎo)致熒光猝滅。

根據(jù)文獻(xiàn)報道，兒茶酚胺[27-28]與量子點發(fā)生相互作用后，由于兒茶酚胺具有鄰苯二酚結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)極易在堿性環(huán)境中氧化為苯醌，氧化苯醌可作為電子受體使量子點的熒光猝滅。多巴胺為兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)，結(jié)構(gòu)上具有鄰苯二酚結(jié)構(gòu)，且易在堿性環(huán)境中氧化為多巴醌。因此，推斷多巴胺猝滅CdSe/ZnS量子點的熒光機(jī)理可能為：在CdSe/ZnS量子點溶液中加入多巴胺后，多巴胺被氧化為多巴醌，多巴醌與CdSe/ZnS量子點表面修飾的羧基發(fā)生氫鍵作用后作為電子受體使CdSe/ZnS量子點的熒光猝滅(如圖4)。

3　結(jié)　論

本文基于多巴胺與水溶性羧基CdSe/ZnS量子點之間的電子轉(zhuǎn)移熒光猝滅效應(yīng)，建立了一種快速檢測多巴胺的熒光分析方法。該方法可在0.01 ～0.7 μmol/L濃度范圍內(nèi)實現(xiàn)多巴胺的有效檢測，檢出限為1.6×10-4μmol/L，方法具有靈敏、簡單、成本低且選擇性好的優(yōu)點，可用于多巴胺注射液及人體尿樣中多巴胺的快速檢測。

[1]Robinson D L,Hermans A,Seipel A T,Mark W R.Chem.Rev.,2008,108(7):2554-2584.

[2]Yi S Y,Chang H Y,Cho H,Park Y C,Lee S H,Bae Z U.J.Electroanal.Chem.,2007,602(2):217-225.

[3]George O,Moal M L,Koob G F.Physiol.Behav.,2012,106(1):58-64.

[4]National Pharmacopoeia Committee.PharmacopoeiaofthePeople'sRepublicofChina(Ⅱ).2005 Ed.Beijing:Chemical Industry Press(國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部).2005年版.北京:化學(xué)工業(yè)出版社),2005:500.

[5]Yuan Q,Hein S,Misra R D K.ActaBiomater.,2010,6(7):2732-2739.

[6]Zhang W,Chai Y,Yuan R,Chen S H,Han J,Yuan D H.Anal.Chim.Acta,2012,756(23):7-12.

[7]Feng J J,Zhao Y M,Wang H Y.Chem.J.Chin.Univ.(馮娟娟,趙祎曼,王海燕.高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報),2015,36(7):1269-1274.

[8]Wang J L,Xiao H Y,Han Y,Ding R,Lü J Q.J.HubeiNormalUniv.:Nat.Sci.(王金麗,肖虎勇,韓韻,丁然,呂鑒泉.湖北師范學(xué)院學(xué)報:自然科學(xué)版),2015,35(1):79-85.

[9]Zhao D,Song H J,Hao L Y,Liu X,Zhang L C,Lv Y.Talanta,2013,107(2):133-139.

[10]Mu Q,Xu H,Li Y,Ma S J,Zhong X H.Analyst,2014,139(1):93-98.

[11]Liu S Y,Shi F P,Zhao X J,Chen L,Su X J.Biosens.Bioelectron.,2013,47(2):379-384.

[12]Thakar R,Chen Y,Snee P T.Nano.Lett.，2007,7(11):3429-3432.

[13]He Y，Wang H F，Yan X P.Anal.Chem.,2008,80(10):3832-3837.

[14]Yang M Q,Miao Y M,Li Y,Wu Y X,Yan G Q.Chin.J.Anal.Lab.(楊茂青,苗艷明,李艷,武宇霞,閆桂琴.分析試驗室),2015,34(11):1246-1250.

[15]Yuan X Y,Wang T L,Guan T T,Wang J L,Huang H W,Yi S J,Tang C R,Zeng Y L.J.Instrum.Anal.(元曉云,王天倫,關(guān)婷婷,王金龍,黃昊文,易守軍,唐春然,曾云龍.分析測試學(xué)報),2015,34(4):463-467.

[16]Gao Y L,Wang Z H,Zhang F F,Xia J F,Xia Y Z,Li Y H.J.Instrum.Anal.(高艷麗,王宗花,張菲菲,夏建飛,夏延致,李延輝.分析測試學(xué)報),2011,30(11):1241-1245.

[17]Du B A,Cao X H,Wang X W,Ma G,Hu X Q.ChemicalIndustryTimes(杜保安,曹雨虹,王曉薇,馬剛,胡曉倩.化工時刊),2014,28(10):1-5.

[18]Yu M J,Liu W X,Wang D P,Huang W,Zhou N,Wang L.J.Chin.Ceram.Soc.(郁美娟,劉維學(xué),王德平,黃文,周萘,王璐.硅酸鹽學(xué)報),2007,35(7):822-827.

[19]Yu Y,Liang Y Z，Lai Y,Cao Y J.J.Anal.Sci.(俞英,梁耀珍,賴艷,曹玉娟.分析科學(xué)學(xué)報), 2009,25(1): 59-62.

[20]Zhong X H,Feng Y Y,Knoll W G,Han M Y.J.Am.Chem.Soc.,2003,125(44):13559-13563.

[21]Hu Y G,Li X X,Pang Z T.J.Chromatogr.A,2005,1091(1/2):194-198.

[22]Wang H,Li F,Chen X Y,Yu S Y,Zhou L Y,Lang J X,Cheng Y Y.Contemp.Chem.Ind.(王歡,李芳,陳曉英,余思瑩,周李佑,郎金曉，程陽穎.當(dāng)代化工),2015,44(10):2497-2499.

[23]Tang B,Cao L H,Xu K H,Zhuo L H,Ge J C,Li Q L,Yu L J.Chem.Eur.J.,2008,14(12):3637-3644.

[24]Chen J L,Yan X P,Meng K,Wang S F.Anal.Chem.,2011,83(22):8787-8793.

[25]Chen Z Z,Ren X L,Meng X W,Zhang Y,Chen D,Tang F.Anal.Chem.,2012,84(9):4077-4082.

[26]Smith A M,Gao X,Nie S.Photochem.Photobiol.,2004,80(3):377-385.

[27]Ma Y,Yang C,Li N,Yang X R.Talanta,2005,67(5):979-983.

[28]Ji X,Palui G,Avellini T,Na B H,Yi C Y,Kenneth L,Knappenberger J R,Mattou-Ssi H.J.Am.Chem.Soc.,2012,134(13):6006-6017.

Research on Development of Dopamine Fluorescence Detection Method Based on CdSe/ZnS Quantum Dots

SHEN Chen-fan,ZHANG Zhi-feng,GUO Yu-an,YAN Gui-qin*

( College of Life Science,Shanxi Normal University,Linfen041000,China )

By taking CdSe/ZnS quantum dots as a fluorescence probe,a method for the rapid detection of fluorescence of dopamine was developed based on fluorescence quenching effect of dopamine to CdSe/ZnS quantum dots.Under the optimal experimental conditions(pH 7.4,reaction time:20 min),the fluorescence quenching strength ratio of CdSe/ZnS quantum dots had a good linear relationship(r=0.996) with concentration of dopamine in the range of 0.01-0.7 μmol/L.The detection limit was 1.6×10-4μmol/L,and the relative standard deviation of this method was 1.2%.Compared with some approaches reported in current literatures,this method has a lower detection limit and higher sensitivity.The method could be applied in the rapid detection of dopamine injection and dopamine in human's urine sample.Key words：CdSe/ZnS quantum dots;dopamine;fluorescence;detection

2016-03-12；

2016-05-11

山西省重點化學(xué)優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)項目(912019)；國家教育部博士點聯(lián)合基金項目(20111404110002)

閆桂琴，教授，研究方向：植物分子生物學(xué)及生物分子化學(xué)，Tel：0357-2051867,E-mail：gqyan2013@163.com

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.08.004

O657.3；O623.732

A

1004-4957(2016)08-0949-06