沉淀聚合法制備3-吲哚乙酸印跡聚合物微粒及其固相萃取應(yīng)用

張鐵莉,赫彩霞，王　磊

(1.唐山師范學(xué)院　化學(xué)系，河北　唐山　063000；2.河北科技大學(xué)　生物科學(xué)與工程學(xué)院,河北　石家莊　050018)

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沉淀聚合法制備3-吲哚乙酸印跡聚合物微粒及其固相萃取應(yīng)用

張鐵莉1*,赫彩霞1,2，王磊1

(1.唐山師范學(xué)院化學(xué)系，河北唐山063000；2.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,河北石家莊050018)

以3-吲哚乙酸(IAA)為模板分子、丙烯酰胺(AA)為功能單體，采用沉淀聚合法制備了IAA印跡聚合物微粒，研究了致孔劑乙腈的用量及IAA的加入量對印跡聚合物結(jié)合性能的影響，采用色譜法對其進行評價。結(jié)果表明，當(dāng)乙腈為37.5 mL，IAA為2 mmol(與AA物質(zhì)的量比為1∶1)時，制得印跡聚合物P7對IAA的親和力最大(k=4.24)，印跡因子(IF)為14.1，其對IAA展示了最顯著的特異識別能力。將P7作為固相萃取柱的填料，研究了分子印跡固相萃取IAA的方法，測得綠豆芽樣品的加標(biāo)回收率為90.6%～92.6%。結(jié)果表明，以AA為功能單體沉淀聚合法制備的IAA印跡聚合物顆粒適合作為固相萃取柱填料，可實現(xiàn)實際樣品中IAA的選擇性分離凈化。該文提出的采用適當(dāng)增大模板分子加入量的方法是制備高親和力與高選擇性印跡聚合物的一條新途徑。

3-吲哚乙酸;沉淀聚合;分子印跡聚合物;固相萃取;高效液相色譜(HPLC);綠豆芽

沉淀聚合屬于非均相溶液聚合，可直接制得聚合物微粒，避免了傳統(tǒng)本體聚合制得棒狀或塊狀聚合物需要研磨、過篩等繁瑣操作，具有操作簡便的優(yōu)點，因此在分子印跡聚合物的制備中得到了日益廣泛的研究和應(yīng)用[1-5]。沉淀聚合印跡聚合物的性能受許多因素的影響[6]，目前研究最多的是致孔劑和功能單體的影響[1-4]。分子印跡聚合物對模板分子具有預(yù)定的選擇性，特別適宜作為固相萃取的填料，開發(fā)基于分子印跡固相萃取(MISPE)的樣品前處理方法，以用于環(huán)境、食品、天然產(chǎn)物等復(fù)雜樣品的分析測定[7-9]。3-吲哚乙酸(IAA)是一種植物激素，對植物的生長發(fā)育具有重要的調(diào)控作用，但植物內(nèi)源IAA的含量甚微，測定時通常需對樣品進行分離富集等前處理，因此研制對IAA具有高選擇性的印跡識別材料已引起廣泛關(guān)注[10-15]。采用沉淀聚合法直接制備IAA印跡聚合物微粒并用于固相萃取尚未見文獻報道。

為了得到高親和力與高選擇性且適宜MISPE的IAA印跡聚合物，本文在已有研究工作[15]的基礎(chǔ)上，以AA為功能單體，系統(tǒng)考察了沉淀聚合法中模板分子及致孔劑的用量對所制備IAA印跡聚合物結(jié)合性能的影響，將優(yōu)化的印跡聚合物作為MISPE的柱填料，建立了MISPE萃取IAA的方法，并成功用于實際樣品的分離凈化。

1　實驗部分

1.1儀器與試劑

LC 2000高效液相色譜儀(上海天美科學(xué)儀器有限公司)；S-4800-1場發(fā)射掃描電鏡(日本Hitachi公司)；TENSOR37 傅立葉變換紅外光譜儀(德國Bruker公司)；CT15RT臺式高速冷凍離心機(上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司)；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；SYC-15C超級恒溫水浴(鄭州南北儀器設(shè)備有限公司)；KQ-400 KDE 高功率數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Agilent12管真空固相萃取儀(美國Agilent公司)；AP-01P無油真空/壓力泵(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)。3-吲哚乙酸(IAA)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)、乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)均購于北京百靈威科技有限公司；3-吲哚甲酸(ICA)、3-吲哚丙酸(IPA)、3-吲哚丁酸(IBA)、對氨基苯甲酸(ABA)、煙酸(NA)、丙烯酰胺(AA)均購于北京化學(xué)試劑公司；偶氮二異丁腈(AIBN，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)使用前以甲醇重結(jié)晶；冰乙酸(天津市天大化學(xué)試劑廠)。除特殊注明外，以上試劑均為分析純；實驗用水為超純水。

1.2聚合物的制備

按照表1，將2 mmol(142.0 mg) AA和一定量的IAA溶于一定體積的乙腈中，超聲30 min，于4 ℃冰箱放置過夜，加入10 mmol(1.89 mL)EGDMA和44.0 mg AIBN，混勻，通N210 min，密封后于60 ℃水浴反應(yīng)24 h。聚合物用甲醇-醋酸(9∶1)超聲分散并洗脫除去IAA，再用甲醇洗去聚合物中殘留的乙酸，60 ℃真空干燥得到印跡聚合物(P)。除制備時不加IAA外，相應(yīng)空白聚合物(BP)的制備和處理步驟同上。

表1　預(yù)聚合反應(yīng)液的組成Table 1　Compositions of the prepolymerization mixtures for preparation of IAA-imprinted polymers

1.3色譜法評價印跡聚合物的分子識別性能

將聚合物裝填于150 mm×4.6 mm色譜柱中，以乙腈為流動相，流速為1.0 mL/min，測定IAA及其類似物的保留時間tR，以丙酮測量死時間t0，組分濃度為0.1 mmol/L，進樣量為20 μL，紫外監(jiān)測波長固定為各組分的最大吸收波長，按公式k=(tR-t0)/t0計算保留因子k，根據(jù)α=kt/ki計算分離因子α，其中kt和ki分別為IAA和各類似物的k。采用印跡因子IF和選擇性因子f評價印跡效率[14]，其中，IF=kP/kBP；f=αP/αBP。

1.4掃描電鏡的測定

將聚合物P7和BP2樣品粉末均勻粘在導(dǎo)電膠上，噴金制樣后，測定其掃描電鏡圖像。

1.5綠豆芽樣品的提取

綠豆芽樣品購自本地菜市場，稱取5.00 g搗碎的綠豆芽樣品，加入20 mL冷甲醇，超聲提取30 min，于4 ℃冰箱放置過夜，離心，保存上清液，殘渣再用10 mL冷甲醇超聲提取1 h，重復(fù)提取1次，合并3次上清液，得到綠豆芽樣品的甲醇提取液，于40 ℃水浴中旋蒸至干，用10 mL乙腈溶解并過0.45 μm尼龍濾膜，得到樣品液，于4 ℃冰箱保存，作為綠豆芽樣品MISPE的上樣液備用。

1.6固相萃取

1.6.1固相萃取柱的制備稱取200.0 mg聚合物P7，于甲醇中超聲分散，勻漿全部轉(zhuǎn)移至6 mL聚丙烯固相萃取空柱(天津博納艾杰爾科技有限公司)，置于固相萃取裝置中，對MISPE小柱反復(fù)真空抽壓，確保聚合物緊密壓實，得到實驗用MISPE柱(兩端用配套的篩板封堵)。按照同法制備BP2為填料的非印跡聚合物固相萃取(NISPE)小柱。

1.6.2固相萃取操作MISPE或NISPE柱依次用5 mL甲醇和5 mL乙腈活化后，加入1.0 mL樣品液，待其自然流出后，加入2×1.0 mL乙腈淋洗，再用2×1.0 mL甲醇洗脫，收集洗脫液并濃縮至1.0 mL，過0.45 μm尼龍濾膜，供HPLC檢測。

1.7HPLC條件

色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18柱(150 mm ×4.6 mm,5 μm)；流動相：水(含0.01%甲酸)-甲醇(60∶40)；流速：1.0 mL/min；進樣量：20 μL；檢測波長：279 nm。

2　結(jié)果與討論

2.1聚合條件對印跡聚合物分子識別性能的影響

非共價分子印跡中，致孔劑會影響模板分子與功能單體形成復(fù)合物的結(jié)合強度及聚合物的形貌，進而影響印跡聚合物的結(jié)合性能。沉淀聚合分子印跡中，常用致孔劑有乙腈、甲醇、甲苯等單一溶劑或其二元混合溶劑[2,16-18]。此外，模板分子加入量對聚合物的結(jié)合性能亦有影響，但系統(tǒng)研究不多[16,19]。傳統(tǒng)的研究思路多是在保持功能單體大量過量的條件下，改變模板分子的加入量制備聚合物[20-22]，而在模板分子相對大量的情況下，通過適當(dāng)提高模板分子相對于功能單體的比例(1∶4～1∶10[21])來制備對模板分子具有高親和力的印跡聚合物的研究鮮見報道。為此，本文以IAA為模板分子，乙腈為致孔劑，采用沉淀聚合法制備了乙腈及IAA不同加入量條件下的一系列印跡聚合物，并以IAA及其類似物為結(jié)合底物，采用HPLC法對印跡聚合物的吸附性能進行評價，優(yōu)化了IAA印跡聚合物的制備條件。

2.1.1致孔劑乙腈加入量的影響在3種乙腈加入量條件下(表1)，制備了印跡聚合物P1，P2，P3及對應(yīng)的空白聚合物BP1，BP2，BP3，HPLC法分別測得其在乙腈流動相中對IAA的保留因子k。P1，P2和P3對IAA的k值分別為1.02，1.65和1.58，即IAA在P2上的k值最大，而IAA在BP1，BP2和BP3上的k值分別為 0.23，0.30和0.29，其k值相近，且明顯小于在印跡聚合物上的k值。表明P2對IAA具有最大的親和力與印跡效應(yīng)。因此，后續(xù)研究選擇乙腈的加入量為37.5 mL。

2.1.2模板分子IAA加入量的影響功能單體與模板分子的比例對印跡聚合物的印跡效應(yīng)會產(chǎn)生影響。該比例過大時，會導(dǎo)致功能單體的自聚，不利于特異識別位點的形成；比例過小時，則會因預(yù)聚合反應(yīng)液中形成的模板分子-功能單體復(fù)合物的量不足而降低聚合物的特異結(jié)合能力[16,21]。為制備對IAA有高親和力與選擇性的印跡聚合物微粒，考察了模板分子IAA的加入量對印跡聚合物結(jié)合性能的影響。

固定功能單體AA的加入量為2 mmol，改變模板分子IAA的加入量，制備了6種印跡聚合物P2及P4～P8(表1)，其對應(yīng)的空白聚合物為BP2。HPLC測得各聚合物在乙腈流動相中對IAA的k值(圖1)。由圖1可知，隨著IAA加入量的增加，IAA的k值逐漸增大，P7時k值達到最大。IAA的加入量繼續(xù)增大時，所得聚合物P8對IAA的k值降低。IAA加入量為2 mmol時，對應(yīng)IAA∶AA為1∶1(物質(zhì)的量比)，即當(dāng)預(yù)聚合反應(yīng)液中模板與功能單體的物質(zhì)的量比(常用配比為1∶4[23])較大時，制得聚合物P7對IAA的親和力最大。表2給出了P7對IAA及類似物的色譜保留數(shù)據(jù)。由表2可知，IAA的IF為14.1，且各類似物的f值較大，說明由于IAA的印跡效應(yīng)，P7對IAA表現(xiàn)出顯著的印跡親和力及選擇性。

研究結(jié)果表明，通過適當(dāng)增大預(yù)聚合反應(yīng)液中模板分子IAA的加入量，可顯著提高印跡聚合物對IAA的選擇性結(jié)合能力。其原因為：當(dāng)AA的濃度固定不變時，隨著IAA加入量的增大，預(yù)聚合反應(yīng)液中模板-功能單體復(fù)合物的量增多，這有利于增加印跡聚合物中的識別位點數(shù)，因為交聯(lián)共聚反應(yīng)發(fā)生在AA和交聯(lián)劑EGDMA之間，而預(yù)聚合反應(yīng)液中二者的濃度保持不變，因此反應(yīng)所得單位質(zhì)量的印跡聚合物中形成的識別位點數(shù)目隨之增多，從而使得印跡聚合物對IAA的親和力與選擇性提高。然而，與功能單體大量過量的情況相似[16,21]，當(dāng)IAA加入量過大時，由于IAA分子自身發(fā)生締合作用的機會亦隨之增多，反而會減小其與功能單體形成復(fù)合物的機會，從而導(dǎo)致印跡聚合物對IAA的親和力減弱。從化學(xué)平衡的角度考慮，對于廉價易得的模板化合物，制備其印跡聚合物時，可考慮適當(dāng)增大模板分子的加入量，來提高印跡聚合物對目標(biāo)化合物的特異親和力。

表2　IAA及其類似物在P7 和 BP2上的色譜保留Table 2　Chromatographic retentions of IAA and its analogues on P7 and BP2

2.2聚合物的形貌特征

由圖2可知，采用沉淀聚合法制備的P7與BP2的總體形貌相似，為微米級不規(guī)則的聚集態(tài)粒子。實驗中發(fā)現(xiàn)，功能單體的性質(zhì)對印跡聚合物的形態(tài)有很大影響[15]。當(dāng)以4-乙烯基吡啶為功能單體時，制備的IAA印跡聚合物和空白聚合物均能很好地分散在聚合體系中(呈乳濁液)，聚合物顆粒較小，盡管其對IAA具有一定的分子識別能力，但因其易穿過萃取柱的篩板，不宜作為固相萃取柱填料；而以AA為功能單體制備的印跡聚合物和空白聚合物，均為疏松的蜂窩狀，經(jīng)超聲很容易分散開，顆粒大小適合作為常用MISPE小柱的填料。

圖2P7和BP2的掃描電鏡圖
Fig.2Scanning electron micrographs of P7and BP2

2.3分子印跡固相萃取

2.3.1HPLC法測定IAA與IBA的分析性能參數(shù)測定了一系列不同濃度(c，μmol/L) IAA和IBA標(biāo)準溶液的色譜峰面積(A)，得到IAA和IBA的標(biāo)準曲線方程分別為A=3 700.9c-576.0(r2=0.996 3)和A=5 114.4c-92.4(r2=0.997 4)；線性范圍分別為0.5～20 μmol/L和1～20 μmol/L，檢出限(S/N=3)分別為0.2 μmol/L和0.5 μmol/L。

2.3.2MISPE柱容量的測定選用印跡聚合物P7為柱填料，制備了MISPE小柱。為了保證目標(biāo)物質(zhì)的定量回收，目標(biāo)物質(zhì)的上樣量必須小于MISPE柱的容量。采用固定上樣體積，通過檢測上樣流出液中是否有IAA流出，測定了MISPE柱允許IAA的最大上樣濃度。分別以濃度為5，10，15，20，25 μmol/L的IAA乙腈標(biāo)準溶液為上樣液，固定上樣體積為1.00 mL，抽真空使上樣液全部流出小柱，收集上樣流出液，HPLC法檢測。結(jié)果表明，當(dāng)上樣液中IAA濃度≤20 μmol/L時，流出液中均未檢出IAA，而當(dāng)IAA濃度為25 μmol/L時，可檢出IAA。因此，本文操作模式下，上樣液中IAA濃度為20 μmol/L時，MISPE柱對IAA達到最大吸附，計算得到其對IAA的最大動態(tài)吸附量即柱容量為3.50 μg/200 mg。2.3.3MISPE上樣、淋洗和洗脫條件的確定及其選擇性為了使印跡聚合物對模板分子保持最大的特異性結(jié)合作用，并減小其非特異性結(jié)合作用，本文的上樣溶劑及淋洗劑均選用乙腈[20]，淋洗MISPE柱的方法為2×1.00 mL乙腈。甲醇及甲醇-醋酸常用作MISPE的洗脫劑[20,24]，分別考察了甲醇和甲醇-醋酸(90∶10)對IAA的洗脫效果。當(dāng)選用甲醇洗脫時，每次加入甲醇1.00 mL，洗脫2次IAA可全部洗脫；而用1.00 mL甲醇-醋酸(90∶10)即可將IAA全部洗脫。為了方便后續(xù)操作，選擇2×1.00 mL甲醇洗脫。

采用濃度均為10 μmol/L 的IAA-IBA乙腈混合液作為上樣液，考察了MISPE小柱的選擇性。分別收集其在MISPE 3個不同階段的流出液并進行HPLC檢測，測得在上樣階段二者均未流出柱子；在淋洗階段，淋洗液中未檢出IAA，但有61.3%IBA進入淋洗液中；在洗脫階段，IAA的回收率為93.8%，而IBA的回收率為34.0%。由此可知，MISPE柱能夠選擇性萃取IAA，這與HPLC表征印跡聚合物的結(jié)果一致。

2.3.4綠豆芽樣品的分離分析選擇新鮮綠豆芽為測試樣品，考察了MISPE 柱對實際樣品中IAA分離凈化的可行性。對綠豆芽樣品液及3個不同加標(biāo)水平的加標(biāo)液，按“1.6.2”方法進行MISPE處理，圖3為HPLC測得綠豆芽樣品的色譜圖。

圖3綠豆芽樣品液(A)、加標(biāo)液(B)、加標(biāo)液經(jīng)MISPE洗脫液(C)的色譜圖
Fig.3Chromatograms of mungbean sprout extract(A),spiked with 5 μmol/L IAA(B),and its eluents after MISPE(C)

由圖3A可知，綠豆芽樣品液的組成較復(fù)雜，保留時間為8.32 min的組分為IAA，加標(biāo)液的色譜圖(圖3B)也證實該峰是樣品中IAA產(chǎn)生的。由加標(biāo)液經(jīng)MISPE后的洗脫液的色譜圖(圖3C)可知，以P7為填料的MISPE 柱對IAA具有特異性結(jié)合，能夠?qū)崿F(xiàn)綠豆芽樣品中IAA的分離凈化。作為對比，加標(biāo)液經(jīng)NISPE柱后所得洗脫液的色譜圖中，IAA及其共存組分的峰均大大降低或消失，這是由于組分在NISPE 柱上的保留為非特異性吸附，樣品中的大部分組分在上樣及沖洗階段從柱中流出。

采用綠豆芽樣品進行加標(biāo)，經(jīng)MISPE 柱處理后，考察該方法對IAA的加標(biāo)回收率，測定結(jié)果列于表3。結(jié)果顯示，IAA的加標(biāo)回收率為90.6%～92.6%，相對標(biāo)準偏差(RSD)均小于5%。因此，以P7為填料的MISPE 柱適于綠豆芽樣品中IAA的分離凈化。

表3　綠豆芽加標(biāo)樣品中IAA的回收率(n=3)Table 3　Recoveries of IAA in spiked mungbean sprout(n=3)

3　結(jié)　論

以IAA為模板分子，AA為功能單體，在IAA與AA物質(zhì)的量比為1∶1，即模板分子加入量較傳統(tǒng)配比量更大的條件下，采用沉淀聚合法制得對IAA具有高親和力與選擇性的分子印跡聚合物顆粒，將其用于綠豆芽樣品的MISPE處理，可實現(xiàn)IAA的分離凈化，為實際樣品中IAA的分離測定提供了依據(jù)。此外，本文研究結(jié)果為高親和力和選擇性印跡聚合物的制備提供了一條新途徑，即聚合反應(yīng)時采用適當(dāng)增大模板分子加入量的方法來提高印跡聚合物對目標(biāo)化合物的特異親和力。

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Preparation of Indole-3-acetic Acid-imprinted Polymer Particulates by Precipitation Polymerization and Their Application in Solid Phase Extraction

ZHANG Tie-li1*,HE Cai-xia1,2,WANG Lei1

(1.Department of Chemistry,Tangshan Normal College,Tangshan063000,China;2.College of Biological Science and Engineering,Hebei University of Science and Technology,Shijiazhuang050018,China)

Indole-3-acetic acid(IAA)-imprinted polymer microparticles were synthesized using IAA as template,acrylamide(AA) as functional monomer and ethylene glycol dimethacrylate as crosslinker in acetonitrile porogen via precipitation polymerization.Effects of amounts of IAA and acetonitrile utilized in the polymerization reaction on the binding performances of IAA-imprinted polymers were evaluated by high-performance liquid chromatography(HPLC).The results showed that the IAA-imprinted polymer P7with the highest affinity(k=4.24) and imprinting factor(IF=14.1) for IAA was obtained when the molar ratio of IAA to AA 1∶1 was adopted with 2 mmol of IAA in 37.5 mL of acetonitrile porogen.Furthermore,P7was chosen as the packing material to make the molecularly imprinted solid phase extraction(MISPE) column,and the MISPE method was developed for the purification of IAA .Under the optimized extraction conditions,the mungbean sprout samples spiked with IAA were extracted,and the recoveries of IAA ranged from 90.6%to 92.6%.The results demonstrated that the IAA-imprinted polymer particulates prepared using AA as the functional monomer by precipitation polymerization could be used as the adsorbent of solid phase extraction column for the selective separation and purification of IAA in real samples.A new route was proposed in this paper to synthesize an imprinted polymer with high affinity and high selectivity by means of increasing amount of template appropriately in the pre-polymerization mixture.

indole-3-acetic acid(IAA);precipitation polymerization;molecularly imprinted polymer;solid phase extraction;high performance liquid chromatography(HPLC);mungbean sprout

2015-12-25；

2016-02-15

唐山師范學(xué)院團隊支撐重點項目(2014D07)

張鐵莉，博士，教授，研究方向：分子印跡和分子發(fā)光，Tel：0315-3863197，E-mail:tielizhang@126.com

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.08.006

O657.72;O629.8

A

1004-4957(2016)08-0962-06