基于cpDNA片段探討中-日間斷分布雙花木屬植物的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)

李麗卡李象欽謝國(guó)文李海生鄭毅勝藤婕華高錦偉

（1.廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州 510006；2.廣東第二師范學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，廣州 510303）

基于cpDNA片段探討中-日間斷分布雙花木屬植物的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)

李麗卡1李象欽1謝國(guó)文1李海生2鄭毅勝1藤婕華1高錦偉1

（1.廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州 510006；2.廣東第二師范學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，廣州 510303）

雙花木屬（Disanthus）植物為東亞特有瀕危物種和典型的中-日間斷分布成分，基于葉綠體DNA（cpDNA）的3個(gè)片段（psbA-trnH、rps16F-R2、psaA-ycf3）聯(lián)合對(duì)雙花木屬16個(gè)居群的164個(gè)個(gè)體進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究，系統(tǒng)發(fā)育的結(jié)果支持日本的D. Cercidifolius和中國(guó)的D. cercidifolius subsp. Longipes為單系類群，兩個(gè)群體間無(wú)共享單倍型，且結(jié)果進(jìn)一步支持日本群體分為兩個(gè)地理組，一個(gè)來(lái)自日本本州島的中部（居群QF，CY），一個(gè)是來(lái)自日本本州島的西南部（居群gz、gd和JH）。PERMUT分析結(jié)果表明，雙花木屬居群間總的遺傳多樣性Ht（0.725）高于居群內(nèi)平均遺傳多樣性場(chǎng)Hs（0.148），居群遺傳差異Nst（0.905）大于Gst（0.796），存在極顯著的譜系地理學(xué)結(jié)構(gòu)。AMOVA進(jìn)一步表明，雙花木屬的變異主要來(lái)自群體間，即中國(guó)和日本的兩個(gè)群體分化明顯，變異占53.08%，組內(nèi)種群間的變異占24.11%，來(lái)自個(gè)體間的變異為22.80%。

雙花木屬；瀕危；系統(tǒng)發(fā)育

雙花木屬（Disanthus）隸屬金縷梅科（Hamamelidaceae），現(xiàn)存雙花木原種（D. cercidifolius）和亞種長(zhǎng)柄雙花木（D. cercidifolius subsp. Longipes），由于分布區(qū)域生境破壞嚴(yán)重，自然居群大小正驟減，被列為國(guó)家二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)瀕危物種。該屬植物為落葉小喬木或灌木，并且是一種優(yōu)良的（觀葉、花和果）珍稀觀賞植物［1］。其葉為寬卵圓形，基部心形，后期轉(zhuǎn)紅色，長(zhǎng)柄雙花木因葉柄長(zhǎng)而得名；花序頭狀，腋生，有花5-8朵，排在一個(gè)平面上；果是蒴果，種子黑色，室間開(kāi)裂，每室有光亮的種子數(shù)顆。該屬植物大多分布于山體陰坡或半陰坡，零星生長(zhǎng)于低山丘陵地、山洼谷底灘地、溝谷溪流邊或溪邊坡上常綠與落葉闊葉混交林林緣，樹(shù)高約為2-5 m。雙花木自然地理分布區(qū)僅殘存于日本南部本州和四國(guó)的山地，長(zhǎng)柄雙花木為我國(guó)中亞熱帶中東部特有，僅分布于廣東與廣西北部、湖南、江西及浙江西部的山地，近年在粵、桂北和贛東北發(fā)現(xiàn)新居群［2，3］。對(duì)雙花木屬染色體和核型的分析結(jié)果表明［4，5］，雙花木的染色體為2n=16，潘開(kāi)玉與楊親二［6］的研究結(jié)果進(jìn)一步得出中國(guó)的與日本的核型差異十分明顯，但是形態(tài)學(xué)的差異很小，因此兩個(gè)亞種的分類地位存在爭(zhēng)議。Shi等［7］通過(guò)基因序列檢測(cè)來(lái)探討金縷梅科的系統(tǒng)發(fā)育（宏觀進(jìn)化）關(guān)系，認(rèn)為雙花木屬與紅花荷屬、殼菜果屬、馬蹄荷屬等近緣，而與形態(tài)性狀不太一致［8-11］。近年來(lái)，隨著DNA測(cè)序技術(shù)的迅猛發(fā)展，對(duì)植物基因組研究的不斷深入，DNA序列以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)被廣泛應(yīng)用于譜系地理研究。對(duì)于植物而言，葉綠體cpDNA和核糖體rDNA常被用于屬及屬以下分類單元的研究，其中葉綠體DNA的非編碼區(qū)序列（內(nèi)含子和基因間隔區(qū)）和核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）［12，13］因其功能上的限制較少，所以進(jìn)化速率比編碼區(qū)快，因此很適合用于種內(nèi)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究。本研究從分子遺傳學(xué)的角度研究雙花木屬的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，為后續(xù)深入研究雙花木屬的譜系地理等科學(xué)問(wèn)題提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)所用樣本均來(lái)自雙花木屬在自然分布區(qū)采集的16個(gè)居群共384個(gè)個(gè)體的葉片樣本，每個(gè)居群24個(gè)個(gè)體，分別采集新鮮嫩葉，分裝于裝有硅膠塑料袋內(nèi)進(jìn)行快速烘干，并帶回實(shí)驗(yàn)室冰箱保存。

表1 材料的來(lái)源、海拔及每一居群的樣品數(shù)目

1.2 方法

1.2.1 DNA提取、PCR擴(kuò)增和測(cè)序 采用改良的CTAB法［14］提取葉片總DNA，PCR引物序列如下：

rps16F：5'-GTGGTAGAAAGCAACGTGCGACTT -3'；rps16R2：5'-TCGGGATCGAACATCAATTGCAAC-3'［15］。

psbA：5'-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3'；trnH：5'-CGCGCATGGTGGATTCACCCAATCC-3'［16］。

psaA-ycf3-F：5'-CATTCCTCGAACGAAGTTTTTACGGGATCC-3'；psaA-ycf3-R：5'-TCCCGGTAATTATATTGAAGCGCATAATTG-3'［17］。

PCR反應(yīng)在PTC-200（MJ Research，USA）熱循環(huán)儀上來(lái)進(jìn)行。20 μL PCR反應(yīng)體系如下：10 μL 2×Taq PCRMixC（北京博邁德生物技術(shù)有限公司），DNA模板1 μL，引物0.2 μL，加ddH20補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃加熱變性30 s，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，循環(huán)35次；最后在72℃延伸10 min。

擴(kuò)增產(chǎn)物在1.8%瓊脂糖凝膠上檢測(cè)，用溴化乙錠染色，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察有無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物并拍照留記錄，若擴(kuò)增電泳條帶整齊單一，亮度較高，則將擴(kuò)增產(chǎn)物送到北京華大基因生物有限公司進(jìn)行純化并測(cè)序。部分樣本引物擴(kuò)增效果，見(jiàn)圖1。

圖1 長(zhǎng)柄雙花木部分個(gè)體cpDNA psaA-ycf3序列擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

1.2.2 數(shù)據(jù)處理 測(cè)序獲得的序列先用contig軟件進(jìn)行正反拼接，獲得原始數(shù)據(jù)，再用clustalX軟件進(jìn)行序列比對(duì)，對(duì)有差異的位點(diǎn)在Chromas軟件中對(duì)應(yīng)原始峰形圖確認(rèn)是否為真實(shí)變異位點(diǎn)，最后在BioEdit 7.0.9［18］軟件對(duì)不準(zhǔn)確位點(diǎn)進(jìn)行手工校正，保存獲得最終數(shù)據(jù)文件。利用DnaSP5.0［19］軟件對(duì)cpDNA單倍型、序列變異位點(diǎn)（Polymorphic）以及簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)（Parsimony informativesites）等參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。用DIVA-GIS7.5.0軟件和ArcMaplO繪制單倍型分布圖。

1.2.3 居群遺傳結(jié)構(gòu)分析 用軟件PERMUT計(jì)算居群cpDNA序列的遺傳多樣性（Ht）和居群內(nèi)平均遺傳多樣性（Hs），居群間遺傳分化系數(shù)Gst以及Nst值，計(jì)算時(shí)進(jìn)行1 000次的置換檢驗(yàn)。計(jì)算Gst值時(shí)只考慮單倍型頻率，其計(jì)算公式為Gst=（Ht-Hs）/Ht。用ARLEQUIN 3.0［20］軟件包中的分子變異分析（AMOVA）檢測(cè)組間、組內(nèi)居群間和居群內(nèi)的遺傳差異以及居群內(nèi)，居群間單倍型分布的分子變異分析（Fst）［21］，并在ARLEQUIN中計(jì)算每個(gè)居群的單倍型多態(tài)性（Hd）和核苷酸多態(tài)性（π）［22］。

1.2.4 系統(tǒng)發(fā)育分析 用PAUP4.0聚類和Bayesian方法對(duì)所得葉綠體單倍型進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析。先用MODELTEST 3.06［23］搜索最適合當(dāng)前數(shù)據(jù)的模型和各種參數(shù)。在PAUP*4.0bl0［24］軟件下，構(gòu)建最大簡(jiǎn)約樹(shù)（Most parsimony，MP），其中，空位或缺失在分析之前進(jìn)行替代處理。在MrBayes軟件［25］分析中，在一條冷鏈和連續(xù)遞增的三條熱鏈下共運(yùn)行了1×107代，其中每2 500代保存一顆樹(shù)，最后獲得4 000顆樹(shù)，本文中在計(jì)算多數(shù)一致性樹(shù)及各分枝的后驗(yàn)概率均舍棄了前2 500棵樹(shù)。

2 結(jié)果

2.1 cpDNA序列變異和居群分布

從雙花木屬自然地理分布區(qū)16個(gè)居群的164個(gè)個(gè)體中檢測(cè)了3個(gè)cpDNA片段，分別為：psbA-trnH、rps16F-R2和psaA-ycf3。序列經(jīng)比對(duì)后長(zhǎng)度分別為：321 bp、601 bp及611 bp，其中psbA-trnH片段檢測(cè)出3種單倍型，rps16F-R2片段檢測(cè)出6種單倍型，psaA-ycf3片段檢測(cè)出5種單倍型?；赾pDNA無(wú)重組、單親遺傳的特點(diǎn)，我們可以把3個(gè)葉綠體片段串聯(lián)起來(lái)分析，串聯(lián)后共檢測(cè)出11種單倍型（H1-H11）（表2），串聯(lián)序列總長(zhǎng)度為1 553 bp，包含22個(gè)變異位點(diǎn)，其中12個(gè)是簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)。

分析得到雙花木屬所有序列單倍型多態(tài)性（Hd）為0.679 77，總核昔酸多態(tài)性（π）為0.002 52。檢測(cè)的11種單倍型中，H1和H3為廣布單倍型（圖3），其中單倍型H1分布最廣，中國(guó)的長(zhǎng)柄雙花木大多數(shù)居群共享這種單倍型，為85個(gè)個(gè)體所共有。此外，日本的雙花木群體除了gs居群只有單一的一種單倍型外，其他居群都檢測(cè)到兩種或兩種以上的單倍型；中國(guó)的長(zhǎng)柄雙花木群體則所有居群都只檢測(cè)到單一的一種單倍型，且除了官山（GS）和井岡山（JG）有獨(dú)享單倍型外，其他居群都共享單倍型H1。

表2 每個(gè)居群的cpDNA單倍型統(tǒng)計(jì)

圖2 雙花木屬樣品居群和cpDNA單倍型分布圖

2.2 cpDNA遺傳多樣性、居群遺傳結(jié)構(gòu)

雙花木屬每個(gè)居群的cpDNA單倍型多態(tài)性（Hd）、核苷酸多態(tài)性（π）及核苷酸差異數(shù)（k）等遺傳多樣性參數(shù)見(jiàn)表3。結(jié)合表2可以看出，日本的居群QF的單倍型種類最多，有4種單倍型（H2、H3、H4和H5），其單倍型多態(tài)性（Hd）為0.490 91。在所有居群中cpDNA遺傳多樣性（Hd）范圍在0-0.533 33，核苷酸多態(tài)性（π）的范圍為0-0.002 01，最高的單倍型多態(tài)性和核苷酸多態(tài)性存在于日本本州島中部的CY居群和JH居群中，分別為0.533 33和0.002 01。在所有16個(gè)居群中，居群間總的遺傳多樣性Ht（0.725）高于居群內(nèi)平均遺傳多樣性場(chǎng)Hs（0.148）。由表4可知，居群間遺傳分化系數(shù)Gst為0.796，在1 000次置換檢驗(yàn)中，950次的置換結(jié)果Nst（0.900）大于Gst，即Nst＞Gst（P＜0.05），說(shuō)明親緣關(guān)系較近的單倍型發(fā)生在同樣居群中的概率較高，且存在著顯著的譜系地理學(xué)結(jié)構(gòu)；在1 000次置換檢驗(yàn)中，990次的置換結(jié)果Nst（0.905）也大于Gst，即Nst＞Gst（P＜0.01），說(shuō)明雙花木屬植物親緣關(guān)系較近的單倍型發(fā)生在同樣居群中的概率極高，且存在著極顯著的譜系地理學(xué)結(jié)構(gòu)。基于cpDNA單倍型的AMOVA分析結(jié)果（表5）顯示，雙花木屬的變異主要來(lái)自群體間，即中國(guó)和日本的兩個(gè)群體分化明顯，變異占53.08%，組內(nèi)居群間的變異占24.11%，來(lái)自個(gè)體間的變異為22.80%。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

本研究選用蕈樹(shù)（Altingia chinensis）為外類群，是與雙花木屬同為金縷梅科的蕈樹(shù)屬（Altingia），基于PAUP的最大簡(jiǎn)約法（Most parsimony tree，MP）和貝葉斯模型（Bayesian）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，利用1 000次重復(fù)的自展分析做可靠性檢驗(yàn)，其中，空位或缺失在分析之前進(jìn)行替代處理。兩種方法構(gòu)樹(shù)得到的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本一致，結(jié)構(gòu)如圖3所示。從圖中可以看到雙花木屬分為明顯的中國(guó)和日本兩大支系，一支來(lái)自中國(guó)居群所屬的單倍型H1、H10和H11，MP支持率為86%，Bayesian后驗(yàn)概率PP值為1；一支來(lái)自日本居群所屬的單倍型H2-H9，MP支持率為95%，Bayesian后驗(yàn)概率PP值為1。其中，日本的雙花木群體又分為兩組支系，支系的MP支持率為80%，Bayesian后驗(yàn)概率PP值為1。兩組支系一組來(lái)自日本本州島的中部（居群QF、CY），所在單倍型為H2和H5；另一組來(lái)自日本本州島的西南部（居群gz、gd和JH），所在單倍型為H3、H4和H9。中國(guó)的長(zhǎng)柄雙花木則所有居群擁有的單倍型以平行單支系的方式聚在一起，系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果揭示了雙花木屬植物中國(guó)與日本兩亞種間發(fā)生了遺傳分化。

表3 雙花木屬各居群的cpDNA片段遺傳多樣性統(tǒng)計(jì)

表4 雙花木屬cpDNA片段遺傳分化系數(shù)Nst和Gst的U統(tǒng)計(jì)（1 000次置換檢驗(yàn)）

表5 雙花木屬cpDNA片段AMOVA分析

圖3 基于PAUP和MrBayes的雙花木屬cpDNA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 討論

3.1 居群遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)

本研究中通過(guò)對(duì)雙花木屬cpDNA 3個(gè)基因片段序列的聯(lián)合分析，得到雙花木屬總單倍型多態(tài)性（Hd）為0.679 77，總核苷酸多態(tài)性（π）為0.002 52，日本群體的遺傳多樣性高于中國(guó)群體，單倍型多態(tài)性和核苷酸多態(tài)性最高的居群存在于日本本州島的中部的CY居群和JH居群，分別為0.533 33和0.002 01，結(jié)合野外采集樣品的調(diào)查結(jié)果，分析造成這一結(jié)果的原因可能是由于生境地人為的破壞，如當(dāng)?shù)鼐用袼烈獾目撤?。在中?guó)的地理分布區(qū)，除了在保護(hù)區(qū)的居群以外，其他居群都受到不同程度的人為砍伐，當(dāng)?shù)鼐用裼脕?lái)當(dāng)柴火使用，而在日本的自然地理分布區(qū)，幾乎沒(méi)有被人為破壞的痕跡。

AMOVE分析結(jié)果顯示，雙花木屬的變異主要來(lái)自中國(guó)和日本兩個(gè)群體間，變異占53.08%，而組內(nèi)居群間的變異只占24.11%，來(lái)自個(gè)體間的變異也只有22.80%。該結(jié)果與PERMUT計(jì)算結(jié)果相符，雙花木屬中國(guó)和日本兩個(gè)群體間遺傳分化系數(shù)Gst為0.796，且Nst（0.905）＞ Gst（P＜0.01），說(shuō)明雙花木屬植物親緣關(guān)系較近的單倍型發(fā)生在同樣居群中的概率極高，且存在著極顯著的譜系地理學(xué)結(jié)構(gòu)。與Enstrand和Elam［26］認(rèn)為Gst＞0.1意味居群間分化程度較高的研究結(jié)果一致。葉綠體DNA（cpDNA）是母系遺傳，因此在探討造成居群間遺傳分化的因素時(shí)主要考慮種子的傳播。雙花木屬種子僅靠蒴果開(kāi)裂時(shí)的彈力傳播［27］，且種子的萌發(fā)受自身因素限制和外界條件的干擾較大，該屬種子發(fā)育不良，空殼多且種皮厚，不利于種子發(fā)芽，存在“花多果少”和嚴(yán)重的“大小年”結(jié)果現(xiàn)象［28］。另外，該屬植物種子萌發(fā)對(duì)溫度、光照及水分等環(huán)境因素敏感，自然條件下種子的繁殖率極低［29］。因此，當(dāng)種子通過(guò)風(fēng)力傳播到較遠(yuǎn)的地方時(shí)，由于環(huán)境的改變影響了種子的萌發(fā)，使得種子成活率較低，導(dǎo)致在兩個(gè)亞種間缺乏基因交流產(chǎn)生了遺傳分化。其次，該屬植物兩個(gè)亞種間存在的地理隔離屏障可能是造成其較高遺傳分化水平的另一個(gè)原因。雖然在末次冰期，中國(guó)東?？赡茏鳛檫B接中國(guó)大陸與日本的陸橋，但是雙花木屬植物對(duì)環(huán)境的依賴性較強(qiáng)，當(dāng)?shù)谒募o(jì)末次冰期氣候來(lái)臨時(shí)，暴露的陸橋地區(qū)沒(méi)有適合雙花木屬生長(zhǎng)的環(huán)境，因此阻礙了該物種的遷移和傳播，致使了兩個(gè)亞種間的遺傳分化。另外，雙花木屬為較原始的類群，所以在漫長(zhǎng)的進(jìn)化歷史過(guò)程中，兩個(gè)地區(qū)間的雙花木屬群體在分子遺傳上積累了大量可以有效區(qū)分彼此的核苷酸變異，導(dǎo)致兩個(gè)亞種間的遺傳分化。

3.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

通過(guò)cpDNA 3個(gè)片段的聯(lián)合分析，基于PAUP和Bayes的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果都支持日本的D. Cercidifolius和中國(guó)的D. cercidifolius subsp. Longipes為單系類群，且結(jié)果進(jìn)一步支持日本群體分為兩個(gè)地理組，一個(gè)來(lái)自日本本州島的中部（居群QF、CY），一個(gè)是來(lái)自日本本州島的西南部（居群gz、gd和JH）。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的結(jié)果顯示，日本的6個(gè)居群分化較中國(guó)的居群明顯，日本的6個(gè)居群除了gs居群只有單一的一種單倍型外，其他居群都檢測(cè)到兩種或兩種以上的單倍型；中國(guó)的長(zhǎng)柄雙花木群體則所有居群都只檢測(cè)到單一的一種單倍型，且除了官山（GS）和井岡山（JG）有獨(dú)享單倍型外，其他居群都共享單倍型H1，兩個(gè)群體間無(wú)共享單倍型，因此，盡管兩個(gè)亞種在形態(tài)學(xué)上的差異有限，差異有限的原因推測(cè)與中國(guó)-日本具有相似的地質(zhì)因素有關(guān)，兩個(gè)地區(qū)之間的個(gè)體是否能夠進(jìn)行雜交以及雜交成種后的生存和繁育情況有待進(jìn)一步研究，但是本研究的結(jié)果從分子遺傳學(xué)的角度有力的支持了兩個(gè)亞種的分類地位。雙花木屬中-日間斷分布格局形成的原因可以用地理隔離假說(shuō)［30］解釋，在地理隔離情況下，兩個(gè)群體被隔離后，基因流消失，隨著突變和遺傳漂變的積累，群體間產(chǎn)生分化。而新產(chǎn)生的單倍型不能擴(kuò)張到被隔離的另一個(gè)地區(qū)，最終導(dǎo)致群體間無(wú)共享單倍型。雖然Harrison等的研究結(jié)果表明，在末次冰期，中國(guó)與日本地區(qū)之間可能被一條狹長(zhǎng)連續(xù)的落葉林所覆蓋，存在著可能的陸橋連接著這兩個(gè)地區(qū)，有望為這兩個(gè)地區(qū)的雙花木屬群體提供基因交流的機(jī)會(huì)。但是，本研究的結(jié)果表明，雙花木屬中國(guó)和日本的兩個(gè)群體間無(wú)共享單倍型，且產(chǎn)生了較大的遺傳分化水平，說(shuō)明兩者在該時(shí)期未能出現(xiàn)這個(gè)假設(shè)的情況?？赡艿慕忉尀檎f(shuō)明該陸橋連接存在局部地區(qū)生境片段化現(xiàn)象，阻礙了兩個(gè)群體之間的基因流。類似的情況已有研究報(bào)道，孫逸［31］對(duì)東亞特有瀕危植物黃山梅屬（Kirengeshoma）的親緣地理學(xué)研究結(jié)果表明，黃山梅屬種下中國(guó)和日本兩個(gè)地區(qū)的黃山梅在2.71個(gè)百萬(wàn)年開(kāi)始分化，即上新世晚期（Lower Pliocene），提出上新世中期氣候的波動(dòng)可能是黃山梅群體中-日間斷分布的原因，末次冰期存在的可能的陸橋未能給兩個(gè)群體提供基因交流的機(jī)會(huì)。祁新帥［30］對(duì)東亞間斷分布植物蛛網(wǎng)萼（Platycrater arguta Sieb. et Zucc）的生物地理學(xué)研究中，提出中國(guó)東海的冰期陸橋功能并不廣泛適用于陸橋兩側(cè)的所有落葉林地植物這一觀點(diǎn)，陸橋的存在對(duì)中-日間斷分布的蛛網(wǎng)萼植物幾乎沒(méi)有起到任何作用，本研究的結(jié)果從側(cè)面支持了以上學(xué)者的研究結(jié)果。

4 結(jié)論

基于PAUP和Bayes的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)一致，結(jié)果都支持日本的D. Cercidifolius和中國(guó)的D. cercidifolius subsp. Longipes為單系類群，兩個(gè)群體間無(wú)共享單倍型，缺乏有效的基因交流，且結(jié)果進(jìn)一步支持日本群體分為兩個(gè)地理組，一個(gè)來(lái)自日本本州島的中部（居群QF，CY），一個(gè)是來(lái)自日本本州島的西南部（居群gz、gd和JH）。

［1］廖飛勇. 長(zhǎng)柄雙花木的生理習(xí)性及其在園林中的應(yīng)用［J］. 北方園藝， 2010（8）：69-71.

［2］沈如江， 林石獅， 凡強(qiáng)， 等. 江西省三清山長(zhǎng)柄雙花木優(yōu)勢(shì)群落研究［J］. 武漢植物學(xué)研究， 2009， 27（5）：501-508.

［3］謝國(guó)文， 譚巨清， 曾宇鵬， 等. 國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)物種長(zhǎng)柄雙花木南嶺群落植物區(qū)系與資源［J］. 廣東教育學(xué)院學(xué)報(bào)， 2010， 30（5）：79-87.

［4］ Morawetz W， Samuel MRA. Karyological patterns in the Hamamelidae//Crane PR， Blackmore S. eds.， Evolution， Systematics and Fossil History of the Hamamelidae［M］. Oxford：Clarendon Press， 1987， 1：129-154.

［5］ Oginuma K， Tobe HK. Karyomorphology and evolution in some Hamamelidaceae and Platanaceae（Hamamelidae：Hamamelidales）［J］. Bot Mag Tokyo， 1991， 104：115-135.

［6］潘開(kāi)玉， 楊親二. 雙花木屬和殼菜果屬（金縷梅科）的核型研究［J］. 植物分類學(xué)報(bào)， 1994， 32（3）：235-239.

［7］ Shi SH， Chang HT， Chen YQ， et al. Phylogeny of the Hamamelidaceae based on the ITS sequences of nuclear ribosomal DNA［J］. Biochem Syst Eco， 1998， 26：55-69.

［8］ Li JH， Bogle AL， Klein AS. Phylogenetic relationships in the Hamamelidaceae：evidence from the nucleotide sequences of the plastid gene matK［J］. Plant Syst Evol， 1999， 218：205-219.

［9］Wen J， Shi SH. A phylogenetic and biogeographic study of Hamamelis（Hamamelidaceae）， an eastern Asian and eastern North American disjunct genus［J］. Biochem Syst Eco， 1999， 27：55-66.

［10］Ickert-Bond SM， Wen J. Phylogeny and biogeography of Altingiaceae- Evidence from combined analysis of five non-coding chloroplast regions［J］. Mol Phylogenet Evol， 2006， 39：512-528.

［11］袁長(zhǎng)春， 張錫亭. 金縷梅科各亞科間的親緣關(guān)系分析［J］. 湘潭師范學(xué)院學(xué)報(bào)， 1999， 20（3）：97-100.

［12］侯新東， 尹帥， 盛桂蓮， 等. 基于ITS序列探討10種蕁麻科植物的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系［J］. 生物技術(shù)通報(bào)， 2013（8）：68-73.

［13］陳誠(chéng)， 沈和定， 吳文健， 等. 基于28SrDNA部分序列的石磺科系統(tǒng)發(fā)育研究［J］. 生物技術(shù)通報(bào)， 2010（6）：172-178.

［14］謝國(guó)文， 趙俊杰， 李榮華， 等. 瀕危植物長(zhǎng)柄雙花木ISSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化［J］. 廣州大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版， 2010， 9（2）：45-50.

［15］ Oxelman B， Liden M， Berglund D. Chloroplast rps16 intron phylogeny of the tribe Sileneae（Caryophyllaceae）［J］. Plant Syst Evol， 1997， 206：393-410.

［16］ Sang T， Crawford D， Stuessy T. Chloroplast DNA phylogeny reticulate evolution and biogeography of Paeonia（Paeoniaceae）［J］. American Journal of Botany， 1997， 84（8）：1120.

［17］ Huang YL， Shi SH. Phylogenetics of Lythraceae sensu lato：a preliminary analysis based on chloroplast rbcL gene， psaA-ycf3 spacer， and nuclear rDNA internal transcribed spacer（ITS）sequences［J］. Int J Plant Sci， 2002， 163：215-225.

［18］ Hall TA. BioEdit：a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program or indows 95/98/NT［C］//Nucleic Acids Symposium Series； 1999， 41：95-98.

［19］ Librado P， Rozas J. DNA SP v5：a software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data［J］. Bioinformatics， 2009，25（11）：451-1452.

［20］Excoffier L， Laval G， Schneider S. Arlequin（version 3. 0）：an integrated software package for population genetics data analysis［J］. Evolutionary Bioinformatics Online， 2005：1- 47.

［21］Weir BS， Cockerham CC. Estimating F-statistics for the analysis of population structure［J］. Evolution， 1984：1358-1370.

［22］ Nei M. Molecular evolutionary genetics［M］. New York：Columbia University Press， 1987.

［23］Posada D， Crandall KA. Modeltest：testing the model of DNA substitution［J］. Bioinformatics， 1998， 14（9）：817-818.

［24］Swofford D. PAUP. Phylogenetic analysis using parsimony and other Methods， Version 4. 0b 10［M］. Sunderland（MA， USA）：Sinauer Associates， 2003.

［25］Huelsenbeck JP， Ronquist F. MRBAYES：Bayesian inference of phylogenetic trees［J］. Bioinformatics， 2001， 17（8）：754-755.

［26］Ellstrand NC， Elam DR. Population genetic consequences of small population size；implication for plant conservation［J］. Annual Review of Ecology Systematics， 1993， 24：217-242.

［27］高浦新， 李美瓊， 周賽霞， 等. 瀕危植物長(zhǎng)柄雙花木（Disanthus cercidifolius var. longipes）的資源分布及瀕?，F(xiàn)狀［J］. 植物科學(xué)學(xué)報(bào)， 2013， 31（1）：34-41.

［28］史曉華， 徐本美， 黎念林， 等. 長(zhǎng)柄雙花木種子休眠與萌發(fā)的初步研究［J］. 種子， 2002， 6：5-7.

［29］ 肖宜安. 瀕危植物長(zhǎng)柄雙花木繁殖生態(tài)學(xué)與光適應(yīng)性研究［D］. 重慶：西南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 2005.

［30］ 祁新帥. 東亞特有間斷分布植物殊網(wǎng)薷厲的生物地理學(xué)研究［D］. 杭州：浙江大學(xué)， 2013.

［31］ 孫逸. 東亞特有瀕危植物黃山梅的親緣地理學(xué)與群體遺傳學(xué)研究［D］. 杭州：浙江大學(xué)， 2012.

（責(zé)任編輯狄艷紅）

An Analysis of Phylogenetic Relationship of the Genus Disanthus Distributed Disjunctively in China and Japan Based on cpDNA Sequences

LI Li-ka1LI Xiang-qin1XIE Guo-wen1LI Hai-sheng2ZHENG Yi-sheng1TENG Jie-hua1GAO Jin-wei1
（1. School of Life Sciences，Guangzhou University，Guangzhou 510006；2. School of Biology and Food Engineering，Guangdong University of Education，Guangzhou 510303）

Disanthus is an endemic and endangered genus in East Asia and distributed disjunctively in China and Japan. In this project，we conducted the phylogenetic study of 164 individual plants in 16 natural populations of Disanthus based on the 3 fragments（psbA-trnH，rps16F-R2， and psaA-ycf3）of chloroplast DNA（cpDNA）. The results of the phylogenetic relationship confirmed that Disanthus gercidifolius in Japan and Disanthus cercidifolius subsp. Longipes in China were monophyletic groups， and they had no share of haploid type. Furthermore，Japanese populations could be divided into 2 geographical branches， one from the center of Honshu（population QE and CY）， and the other from the southwestern Honshu（population ga， gd and JH）. PERMUT analysis showed that total genetic diversity（Ht = 0.725）of Disanthus between populations was higher than the average genetic diversity（Hs = 0.148）within populations. Regarding the genetic difference between populations， Nst（0.905）was larger than Gst（0.976；P ＜ 0.01）， demonstrating that there were significantly geographical structure of pedigree. AMOVA results further revealed that genetic variation occurred mainly between populations（53.08%）， while 24.11% among populations within a group and 22.80% among individuals within a population. These results indicated that the genetic differentiation within Disanthus between Chinese and Japanese subspecies were obvious.

Disanthus；endangered；phylogenetic

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.013

2015-03-30

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31270259，30970191，30470146）

李麗卡，女，碩士研究生，研究方向：植物學(xué)及保護(hù)生物學(xué)；E-mail：421106575@qq.com

謝國(guó)文，男，教授，研究方向：植物系統(tǒng)進(jìn)化與物種多樣性保護(hù)；E-mail：xieguowen126@126.com