復合紅景天苷支架材料對大鼠骨髓間充質干細胞的影響

王九娜 向大偉 唐俊杰 李根 趙玲 秦文 趙紅斌

（蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院骨科研究所，蘭州 730050）

復合紅景天苷支架材料對大鼠骨髓間充質干細胞的影響

王九娜 向大偉 唐俊杰 李根 趙玲 秦文 趙紅斌

（蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院骨科研究所，蘭州 730050）

探討復合紅景天苷微球的膠原蛋白材料支架對大鼠骨髓間充質干細胞的影響及作用。將紅景天苷制作成微球復合到膠原蛋白中，掃描電鏡觀察材料支架的表征，接種大鼠骨髓間充質干細胞后掃描電鏡觀察細胞與材料的黏附性，CCK-8法測細胞在材料上的增殖情況，HE染色檢測細胞在材料上的增殖及形態(tài)，S100免疫熒光化學法檢測干細胞向神經細胞的分化情況。結果顯示，細胞接種到材料上，在材料上黏附并生長。同種材料，隨著時間的延長，材料上的細胞顯著增殖（P ＜0.05）。神經細胞標志性蛋白S100表達為陽性。復合紅景天苷微球的膠原蛋白具有良好的生物相容性，紅景天苷微球不影響細胞在材料上的增殖，且可有效誘導大鼠間充質干細胞向神經細胞分化。

紅景天苷；膠原蛋白；材料支架；骨髓間充質干細胞

隨著組織工程學的發(fā)展，天然高分子生物材料及人工合成高分子材料日益受到人們的重視。膠原蛋白作為一種天然高分子生物材料，已被證實可以用作組織工程支架。膠原蛋白是細胞外基質的主要成分，是構成動物機體的重要功能物質。膠原蛋白是動物體內含量最高的結構蛋白，占動物體內總蛋白量的25%-33%［1］，其中以結締組織最多，富含脯氨酸、甘氨酸和羥脯氨酸，能與各種細胞結合并構成性能各異的組織，可形成細胞外支架，維持組織和器官形態(tài)的完整性，對細胞、組織乃至器官行使正常功能并對外傷修復有重大影響。膠原蛋白的種類很多，一般皮膚和骨骼中的是Ⅰ型膠原蛋白。膠原分子鏈上含有大量的親水基團，與水結合的能力很強。近年來，膠原蛋白已廣泛應用于營養(yǎng)保健品、化妝品、生物肥料等領域，而且在醫(yī)藥工業(yè)和醫(yī)學臨床的研究和應用中發(fā)揮著巨大作用，同時在藥物釋放等方面存在著巨大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

紅景天苷（Salidroside）是景天科紅景天屬紅景天的主要有效成分。紅景天為多年生草本植物，主要生長在海拔1 600-4 000米的高寒、干燥、缺氧、強紫外線照射、晝夜溫差大的地區(qū)，具有極強的環(huán)境適應能力和生命力。紅景天具有很多藥理作用，包括抗病毒活性［2］、抗癌性［3］、保肝藥［4］、治療糖尿?。?］以及抗氧化作用［6］。近些年，大量體外研究［7-9］表明紅景天苷具有神經營養(yǎng)及保護神經的作用。國內外學者一直致力于對紅景天苷的研究。我們課題組亦對紅景天苷進行過相關研究報道［10，11］。

本研究以膠原蛋白為支架材料，并復合紅景天苷微球，探討與大鼠骨髓間充質干細胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）的相互作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 紅景天苷（中國食品藥品檢定研究院，純度為99.8%），殼聚糖（浙江金殼生物化學有限公司），司盤80（廣州市西陸化工有限公司），京尼平（和光純藥工業(yè)株式會社，日本），DMEM-F12培養(yǎng)基（Gibcol公司，美國），胎牛血清（杭州四季青公司），DAPI（Sigma公司，美國），F(xiàn)ITC標記的羊抗兔二抗（Abcam公司，美國），S100（兔抗，Abcam公司，美國），胰酶（Gibcol公司，美國），CCK-8（Sigma公司，美國）。

1.1.2 主要儀器 低速離心機（LD4-2A，北京醫(yī)用離心機廠），37℃烘箱（HH·B11·360-BS-II，上海躍進醫(yī)療器械廠），冷凍干燥機（LGJ，軍事醫(yī)學科學院實驗儀器廠），恒溫振蕩器（ZD-85，江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠），掃描電子顯微鏡（JSM-5600，日本電子光學公司），電子天平（AE200，上海威足醫(yī)療儀器廠），酶標儀（ABI7300，美國應用生物系統(tǒng)公司），37℃ CO2培養(yǎng)箱（HF90/HF240，SMART CELL），熒光倒置顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.1.3 實驗動物 清潔級雌性Wistar大鼠，體重200±15 g，由蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院動物實驗科提供，符合國家實驗動物檢疫標準。

1.2 方法

1.2.1 紅景天苷微球的制備 采用乳液法制備紅景天苷微球。將250 mg殼聚糖溶于10 mL 2%的乙酸溶液，20 mg紅景天苷溶于1 mL水中，二者混合均勻，制成水液。將100 mL液體石蠟與2 mL司盤80置于錐形瓶中，放在磁力攪拌器上攪拌（450 r/min）。水液裝入分液漏斗后對準攪拌中心，使水液滴下，被打散成均勻的微球，約每30-40 s滴一滴。待水液滴完后，再逐滴加入5% 三聚磷酸鈉25 mL，持續(xù)攪拌至形成穩(wěn)定的微球顆粒。靜置1 h，棄上清，2 000 r/min離心30 min，棄上清，分別用石油醚和異丙醇洗滌3次，棄上清后，-20℃冰箱過夜，真空冷凍干燥機凍干12 h，密閉封裝。

1.2.2 材料的制備 將自制膠原蛋白（從豬皮中提?。┗驈秃狭思t景天苷微球的膠原蛋白（每40 g膠原蛋白中加入30 mg紅景天苷微球）裝入到10 mL的注射器中，注入到24孔板中，蓋上蓋子，其間防止出現(xiàn)氣泡，置于-20℃冰箱里過夜，真空冷凍干燥機里凍干72 h，得到空白材料和加藥材料。將每個圓柱體材料分割成4個，用1%京尼平37℃交聯(lián)30min，每10 min翻轉1次，無水乙醇浸泡5 min，蒸餾水洗3遍，10 min/次，-20℃冰箱里過夜，真空冷凍干燥機凍干24 h，60Coγ射線滅菌法滅菌，自封袋分裝并密封常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 細胞的提取與培養(yǎng) 取雌性Wistar大鼠1只，體重200±15 g，脫頸處死，體積分數(shù)75%乙醇消毒10 min，在超凈工作臺里取其后腿的股骨及脛骨，去掉肌肉，分別用剪刀剪去一端，完全培養(yǎng)基（含體積分數(shù)10%肽牛血清）沖洗骨髓腔至其發(fā)白，細胞篩過濾，得到分散單個核細胞，37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱里培養(yǎng)，隔日換液，培養(yǎng)得到貼壁細胞。流式細胞法鑒定提取細胞為骨髓間充質干細胞。取第4代細胞用于實驗。

1.2.4 細胞在支架材料上的黏附 材料經過60Coγ射線滅菌法滅菌后，無菌環(huán)境下，將空白材料和加藥材料各取一塊，放入培養(yǎng)皿中，加入4 mL 0.01mol/L PBS浸泡，37℃ CO2培養(yǎng)箱過夜。取第4代BMSCs，待生長至80%融合，棄原液，用0.01 mol/L PBS洗2遍，0.25%的胰酶消化30 s左右，完全培養(yǎng)基終止消化，用槍輕輕吹打，混合均勻，調整細胞密度為2×109個/L，每塊材料接種2 mL，置于37℃ CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 h，補加完全培養(yǎng)基至4 mL，37℃ CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，隔日換液。

細胞與材料共培養(yǎng)3 d后將材料取出，2.5%戊二醛固定。材料固定24 h后，棄戊二醛，0.01 mol/L PBS洗2遍，10 min/次，丙酮-醋酸異戊酯（1∶1）作用10 min，棄丙酮-醋酸異戊酯后，醋酸異戊酯作用30 min，無水乙醇洗3次，30 min/次。將材料置于-20℃冰箱冷凍過夜，冷凍干燥機凍干48 h，制樣，噴金，掃描電鏡進行觀察。

1.2.5 CCK-8法測細胞在材料上的增殖 材料經過60Coγ射線滅菌法滅菌后，無菌環(huán)境下剪成3 mm×3 mm×1 mm的長方體狀，放入96孔板，分成8組。第1組為空白材料+完全培養(yǎng)基，第2組為加藥材料+完全培養(yǎng)基，第3組為空白材料+完全培養(yǎng)基+紅景天苷（藥物終濃度為100 μg/mL），第4組為完全培養(yǎng)基，第5-8組為第1-4組對應的加細胞組，每組25孔。加細胞組每孔接BMSCs約2×104個，置37℃ CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，隔日換液。細胞與材料共培養(yǎng)24 h，每組取5個孔，將待測孔的材料轉移到新孔，加100 μL完全培養(yǎng)基，無細胞組原液吸去，加100 μL完全培養(yǎng)基，各待測孔加入CCK-8 10 μL，37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱孵育3 h，將各孔的液體轉移至另一96孔板中，酶標儀測450 nm處的吸光值。細胞與材料共培養(yǎng)48 h，72 h，5 d，7 d，同樣的方法，每組取5個孔測450 nm處的吸光值。

1.2.6 細胞-支架材料復合培養(yǎng) 材料經過60Coγ射線滅菌法滅菌后，無菌環(huán)境下將材料裁成長方體狀（13 mm×5 mm×2 mm），放入12孔板，分為3組：（1）空白材料組+完全培養(yǎng)基；（2）加藥材料組+完全培養(yǎng)基；（3）空白材料+完全培養(yǎng)基+紅景天苷（藥物終濃度為100 μg/mL）。每組接種大鼠BMSCs約2×105個，置于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

細胞與材料共培養(yǎng)7 d及14 d時，3組材料各取出一個，10%福爾馬林固定。固定7 d后，將材料取出，用自動脫水機進行脫水，常規(guī)石蠟包埋并切片，進行HE染色、S100免疫熒光化學染色。

1.2.7 免疫熒光化學染色 石蠟切片經常規(guī)脫蠟，0.01% tritonX-100作用10 min，0.02 mol/L PBS 洗3次，每次3 min；3% H2O2作用10 min，0.02 mol/L PBS 洗3次，每次3 min；5% BSA封閉20 min，棄多余封閉液，滴加S100（1∶200稀釋）一抗，濕盒4℃過夜，0.02mol/L PBS 洗，每次5 min；加入FITC標記的羊抗兔二抗（1∶1 000稀釋），37℃濕盒避光作用30 min，0.02 mol/L PBS洗3次，5 μg/mL DAPI室溫避光染核10 min，0.02 mol/L PBS洗3次，每次5 min，50%甘油磷酸緩沖液封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計分析

采用統(tǒng)計軟件Spass17.0進行單因素方差分析，數(shù)據(jù)以±s表示，P ＜0.05具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 材料的表征

掃描電鏡結果（圖1）顯示，材料呈海綿多孔狀，相互連通，交織成網狀，孔隙約為50-150 μm。純膠原蛋白材料表面相對光滑，復合紅景天苷微球材料可見到嵌入于材料中的紅景天苷微球。

2.2 細胞在材料上的黏附性

材料與細胞共培養(yǎng)3 d后，掃描電鏡結果（圖2）顯示，細胞較均勻地貼附在材料表面，細胞核大小均一，細胞在材料上黏附并生長，材料與細胞具有良好的生物相容性。

2.3 細胞在材料上的增殖

CCK-8法測細胞增殖結果見表1。細胞接種到材料上，同種材料，隨著時間，材料上的細胞顯著增殖（P ＜0.05）。同一時間，接種到材料上的細胞增殖與單純的細胞增殖相比有顯著差異（P ＜0.05）。復合紅景天苷微球材料細胞的增殖與空白材料或在培養(yǎng)基里直接加入紅景天苷組無顯著差異（P ＞0.05）。

2.4 HE染色

細胞與材料共培養(yǎng)7 d，14 d HE染色結果見圖3，7 d時可見細胞在材料表面黏附，生長和增殖。細胞呈梭形，形態(tài)良好，大小均一。14 d與7 d相比較，材料上的細胞明顯增多。該結果提示細胞可以在材料上黏附、生長并增殖，材料與細胞具有良好的生物相容性。

圖 1 芯層材料的掃描電鏡

圖2 材料接種細胞3d后掃描電鏡

表1 細胞在不同材料上的增殖（±s）

表1 細胞在不同材料上的增殖（±s）

注：同一種材料a表示P ＜0.05 vs其他組，同一時間b表示P ＜0.05 vs其他組

類別24 h48 h72 h5 d7 d空白材料組0.37±0.010.47±0.02a0.901±0.03a1.28±0.03a1.95±0.05a復合紅景天苷微球組0.36±0.010.47±0.01a0.89±0.01a1.30±0.01a1.94±0.05a空白材料+紅景天苷組0.33±0.010.47±0.01a0.90±0.03a1.30±0.02a2.02±0.08a細胞組0.87±0.04b1.21±0.03ab2.15±0.05ab2.70±0.12ab3.23±0.06ab

2.5 S100免疫熒光化學染色

S100免疫熒光化學染色見圖4，結果顯示空白材料組S100表達為陰性，復合紅景天苷微球材料組與空白材料+紅景天苷組S100表達為均陽性。14 d與7 d相比較，材料上S100表達的陽性細胞明顯增多。該結果顯示，膠原蛋白復合紅景天苷微球能有效的誘導BMSCs向神經細胞轉化并增殖。

3 討論

作為細胞外基質的主要成分，膠原蛋白常常被用作組織工程支架材料。用膠原蛋白制作的支架材料呈海綿多孔狀，孔隙之間相互連通，交織成網狀，有利于細胞的黏附。但膠原蛋白力學性能差，易降解，本研究用1%的京尼平將材料進行交聯(lián)，改變了膠原蛋白的力學性能。姜東林等［12］發(fā)現(xiàn)經京尼平交聯(lián)后，膠原蛋白具有更好的力學性能、生物相容性及更低的生物降解速率，且不影響細胞在材料上的增殖。我們此前也進行過相關研究報道［13］。

BMSCs是存在于骨髓中的一種干細胞，在體外可以誘導分化為成骨細胞、脂肪細胞、肌肉細胞和軟骨細胞等中胚層來源的細胞，還可跨胚層分化為具有神經元或膠質細胞表型的細胞。BMSCs不僅取材方便，不存在倫理道德問題，而且在體外容易培養(yǎng)，增殖速度快，不會出現(xiàn)免疫排斥反應［14］。在膠原蛋白材料支架上三維培養(yǎng)細胞與二維培養(yǎng)細胞相比較，同一時間，細胞的增殖有顯著差異，說明支架材料對細胞的增殖有影響。但在膠原蛋白中復合紅景天苷微球材料組與膠原蛋白材料組相比，同一時間，細胞的增殖無顯著差異，紅景天苷不影響大鼠BMSCs在材料上的增殖。這與白海等［15］的報道紅景天苷可影響B(tài)MSCs增殖，一定濃度下的紅景天苷可促進BMSCs增殖不一致。范東艷等［16］研究發(fā)現(xiàn)，10 μg/mL紅景天苷可促進BMSCs增殖分化，又不影響細胞增殖分化等生物學特性。林海泓等［17］研究證明紅景天苷對hMSCs有明顯促進增殖的作用，對其的分化影響不明顯。但這些研究報道均是對細胞進行二維培養(yǎng)，本研究是對細胞進行材料支架上培養(yǎng)，且復合了紅景天苷微球，微球發(fā)揮了一個緩釋的效果。但不同的培養(yǎng)是否會對細胞的增殖產生影響有待進一步研究。

圖 3 不同材料接種細胞7 d及14 d HE染色

圖4 不同材料接種細胞7 d及14 d S100免疫熒光化學染色

傳統(tǒng)中藥丹參、川芎嗪、黃芩甙等傳統(tǒng)中藥制劑［18-20］可誘導 BMSCs 向神經樣細胞分化。S100免疫熒光化學染色結果顯示，復合紅景天苷微球材料組和空白材料+紅景天苷組中，神經標志性蛋白S100表達為陽性，該結果表明復合紅景天苷微球的膠原蛋白可有效誘導大鼠BMSCs向神經細胞分化。姜紅［21］，李云玲［22-24］等均對BMSCs向神經細胞分化作過研究報道。張維燁等［25］用紅景天苷藥物血清誘導從新生Wistar大鼠中獲得的神經干細胞，發(fā)現(xiàn)紅景天苷藥物血清可以促進神經干細胞向神經元方向分化，并促進神經元細胞生長發(fā)育。也有研究證明紅景天苷能夠抑制神經細胞凋亡，從而對損傷的神經細胞起到保護作用［26］。將紅景天苷用于神經修復，發(fā)展前景十分廣闊。

4 結論

復合紅景天苷微球的膠原蛋白支架材料具有良好的生物相容性。紅景天苷微球復合到膠原蛋白中，發(fā)揮了良好的緩釋作用且可有效誘導大鼠間充質干細胞向神經細胞分化。

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（責任編輯李楠）

The Effect of Scaffold Combined with Salidroside on Rat Bone Mesenchymal Stem Cells

WANG Jiu-na XIANG Da-wei TANG Jun-jie LI Gen ZHAO Ling QIN Wen ZHAO Hong-bin
（Institute of Orthopedics，Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Area，Lanzhou 730050）

The objective of this work is to investigate the effect of collagen scaffolds combined with salidroside microspheres on rat bone mesenchymal stem cells（rBMSCs）. The salidroside was made into microspheres that combined into the collagen. The surface character of material was observed by scanning electron microscopy（SEM）. The material was implanted with rBMSCs and observed for the cell adhesion on the material by SEM. The cell proliferation on the material was measured by CCK-8， and the cell proliferation and morphology on the material were detected by HE staining. S100 immunofluorescence was used to detect the differentiation of stem cells into nerve cells. Cells were seeded onto the scaffold， adhered and grew well on materials. While the time increased， the cells on the same material were significant proliferation（P＜ 0.05）. The expression of nerve cell marker protein S100 was positive. Conclusively， collagen combined with salidroside microspheres had good biocompatibility， salidroside microspheres did not affect cell proliferation on the material， and it could induce effectively rBMSCs into nerve cells.

salidroside；collagen；scaffold；bone marrow mesenchymal stem cells

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.033

2015-06-16

國家自然科學基金面上項目（81470087）

王九娜，女，碩士研究生，研究方向：組織工程；E-mail：ljty2012@163.com

趙紅斌，男，教授，研究方向：材料與組織工程；E-mail：zhao761032@163.com