通脈對(duì)治療血瘀證的抗血小板聚集和體外血栓作用的研究

張小梅，李炎坤

(1.荊州市第一人民醫(yī)院心內(nèi)科，湖北 荊州　434000；2.湖北科技學(xué)院藥學(xué)院，湖北 咸寧　437100)

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通脈對(duì)治療血瘀證的抗血小板聚集和體外血栓作用的研究

張小梅1，李炎坤2

(1.荊州市第一人民醫(yī)院心內(nèi)科，湖北 荊州434000；2.湖北科技學(xué)院藥學(xué)院，湖北 咸寧437100)

目的研究通脈不同部位抗血小板聚集和抗體外血栓作用。方法采用二磷酸腺苷(ADP)誘導(dǎo)家兔血小板聚集,測(cè)定通脈不同部位對(duì)血小板聚集的抑制率；采用體外血栓法、全血血塊法,觀察通脈不同部位的抗血栓作用。結(jié)果通脈石油醚部位和正丁醇部位有顯著的抑制血小板聚集和抗血栓作用，高劑量石油醚部位和正丁醇部位對(duì)血小板聚集抑制率及體外血栓溶解率均>50% ，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，高劑量正丁醇部位48 h全血凝塊溶解率>65%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論通脈石油醚部位和正丁醇部位具有較強(qiáng)的抗血小板聚集和抗血栓作用。

川芎;葛根;丹參;血小板聚集抑制劑;血栓形成;催化域;兔

通脈方由川芎、葛根、丹參3味中藥材組成，具有活血通脈的功效，川芎活血祛瘀行氣開郁祛風(fēng)止痛，葛根解肌退熱，透疹，生津止渴，升陽(yáng)止瀉。丹參活血祛瘀，通經(jīng)止痛，清心除煩，涼血消癰。三味藥組成通脈方，在臨床上用于缺血性心腦血管疾病、動(dòng)脈硬化、冠心病等的治療?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，中醫(yī)血瘀證與循環(huán)障礙密切相關(guān)，循環(huán)障礙是血瘀證實(shí)質(zhì)的重要組成部分[1]。其中血小板在血液循環(huán)及微循環(huán)障礙的各個(gè)環(huán)節(jié)中起重要作用，活化的血小板能促進(jìn)血小板聚集和血栓形成，因此血小板活化是血瘀證產(chǎn)生的重要病理生理基礎(chǔ)[2]。為進(jìn)一步對(duì)通脈活性部位進(jìn)行研究，本文從抗血小板聚集和抗體外血栓兩個(gè)方面對(duì)通脈方治療血瘀證活性進(jìn)行考察，對(duì)其不同部位活性進(jìn)行了探討。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物家兔8只，雄性，體質(zhì)量1.5～2.0 kg，購(gòu)自武漢生物制品研究所，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(鄂) 2008-0003。 血小板聚集抑制實(shí)驗(yàn)、通脈對(duì)血栓溶解作用這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中各使用了3只家兔，通脈對(duì)全血凝塊的溶解作用研究中使用2只家兔。

1.2試藥ADP，4 5'-腺甘二磷酸二鈉鹽(Sigma公司，批號(hào)A22754)；凝血酶凍干粉(長(zhǎng)春遠(yuǎn)大國(guó)奧制藥有限公司，批號(hào)20140801)；纖維蛋白原(江西博雅生物制藥股份有限公司，批號(hào)20140304)；枸櫞酸鈉(國(guó)藥集團(tuán)試劑有限公司，批號(hào)120413)；川芎、葛根、丹參(湖北天濟(jì)中藥飲片有限公司，批號(hào)分別為20140713、20141102、20150108)；阿司匹林(廣東九明制藥有限公司，批號(hào)140701)。

1.3供試品制備干燥的川芎、葛根、丹參各200 g，粉碎后用95%乙醇冷浸提取3次，每次7 d，提取液減壓濃縮成浸膏120 g，將其用熱水混懸，依次用極性遞增溶劑石油醚、氯仿、正丁醇萃取并減壓濃縮各萃取液，得各萃取部位，其中石油醚部位25 g，氯仿部位30 g，正丁醇部位35 g。

1.4血小板聚集抑制實(shí)驗(yàn)[3]家兔耳緣靜脈采血，全血按9∶1加入3.8%抗凝劑枸櫞酸鈉，混勻，800 r·min-1離心5min，取上清，即為富血小板血漿(PRP)，備用；剩余血液繼續(xù)3 000 r·min-1離心10 min，得貧血小板血漿(PPP)，備用。然后將實(shí)驗(yàn)分5組，分別為空白對(duì)照組、阿司匹林陽(yáng)性對(duì)照組和通脈石油醚部位組、氯仿部位組、正丁醇部位組(低、中、高劑量組即5、10、20 mg·L-1)，以0.5% 二甲基亞砜(DMSO)作為溶媒，每組6個(gè)平行樣。精密吸取15 μL溶媒、阿司匹林和不同濃度的通脈方石油醚部位、氯仿部位、正丁醇部位分別加入到270 μL PRP中，在37 ℃比濁杯內(nèi)孵育5 min，用PPP調(diào)零，再加入誘導(dǎo)劑二磷酸腺苷(ADP)溶液15 μL，按比濁法測(cè)定血小板聚集率，記錄5 min內(nèi)最大聚集率。

血小板聚集抑制率=(對(duì)照組聚集率-藥物組聚集率)/對(duì)照組聚集率× 100%

1.5體外抗血栓作用

1.5.1對(duì)血栓溶解作用[4]家兔耳緣靜脈采血置試管中，全血按9∶1加入3.8%抗凝劑枸櫞酸鈉，然后依次加入0.5%纖維蛋白原溶液20 μL，55.5 g·L-1CaCl2溶液10 μL，1×105U·L-1凝血酶溶液20 μL，混勻。將全血注入到內(nèi)徑為8 mm的聚乙烯管中，于37 ℃水浴20 min后取出血栓，切成1.5 cm的小段，放入各裝有2 mL不同濃度石油醚部位、氯仿部位、正丁醇部位的藥物溶液，阿司匹林溶液和生理鹽水溶液中，37 ℃溫育4 h后分別測(cè)定剩余血栓段的質(zhì)量，計(jì)算血栓溶解率。

血栓溶解率=(血栓初始質(zhì)量-藥物作用后血栓質(zhì)量)/血栓初始質(zhì)量× 100%

1.5.2對(duì)全血凝塊的溶解作用[5]家兔采血20 mL置于表面皿中，2 h后自然凝固后切成0.3 cm3的小塊，用生理鹽水淋洗3遍待用。將不同質(zhì)量濃度的石油醚部位、氯仿部位、正丁醇部位及生理鹽水各2 mL加入不同西林瓶中，每組6個(gè)平行樣，再向各瓶中隨機(jī)加入2個(gè)血塊，37 ℃水浴保溫，觀察血塊溶解情況，并分別于 0、12、24、48 h 測(cè)血塊的質(zhì)量，計(jì)算全血凝塊溶解率。

全血凝塊溶解率=(血凝塊初始質(zhì)量-藥物作用后血凝塊質(zhì)量)/血凝塊初始質(zhì)量× 100%

2　結(jié)果

2.1通脈不同部位對(duì)血小板聚集抑制作用通脈方的各提取部位對(duì)ADP誘導(dǎo)的血小板聚集均有抑制作用，石油醚部位和正丁醇部位作用最顯著，在濃度為20 mg·L-1時(shí)，石油醚部位抑制率為50.9%(P<0.01)，正丁醇部位抑制率高達(dá)56.1%(P<0.01)。各部位血小板抑制作用均與濃度呈正相關(guān)性。見表1。

表1　通脈不同提取部位對(duì)ADP誘導(dǎo)的血小板聚集抑制作用

注：與對(duì)照組比較aP<0.05，bP<0.01。

2.2通脈不同提取部位對(duì)體外血栓溶解作用將血栓置于不同溶液中4 h后,結(jié)果顯示通脈不同部位均有不同程度的溶解體外血栓作用，正丁醇部位對(duì)體外血栓的溶解作用尤其顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，即使在低濃度5 mg·L-1時(shí)其血栓溶解率也大于50%，并有明顯量效關(guān)系。見表2。

表2　通脈不同提取部位對(duì)體外血栓溶解作用

注：與對(duì)照組比較aP<0.05，bP<0.01。

2.3對(duì)全血凝塊的溶解作用石油醚部位高劑量組對(duì)血凝塊有顯著溶解作用(P<0.01)，正丁醇高劑量組(濃度20 mg·L-1)的血凝塊在12 h后體積縮小約20%，24 h 后體積縮小約40%，48 h后體積縮小約65%(P<0.01)，此時(shí)血栓呈分散狀態(tài)。中、低劑量實(shí)驗(yàn)組的血凝塊體積也明顯的縮小。但生理鹽水對(duì)照組血凝塊變化不大。石油醚高劑量組及正丁醇組全血凝塊溶解率的組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，顯示石油醚及正丁醇部位對(duì)全血凝塊有明顯的溶解作用，且呈濃度依賴性。見表3。

表3　不同部位對(duì)全血凝塊的溶解作用

注：與對(duì)照組比較aP<0.05，bP<0.01。

3　討論

血小板聚集在血栓形成過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，而血栓形成是許多疾病如心肌梗死、缺血性猝死、腦卒中、冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化等的直接原因，嚴(yán)重危害著人類的健康。

通脈方由丹參、川芎、葛根組方而成，具有活血通脈的功效。臨床上用于缺血性心腦血管疾病的治療，對(duì)動(dòng)脈硬化、腦血栓、腦缺血、冠心病、心絞痛等有較好的療效。通脈方中各藥材的化學(xué)研究及藥理研究表明，葛根素為代表的異黃酮類是葛根中的主要成分，具有多種心血管藥理活性[6-7]；酚酸類成分是丹參中的主要活性成分，具有抗血小板聚集和血管舒張作用[8-10]；阿魏酸、川芎嗪是川芎主要成分，具有抗血小板聚集、抗血栓及降血脂等多種心血管系統(tǒng)活性[11-12]，有研究表明通脈中葛根異黃酮類和丹參素是吸收入血的主要成分[13]。本研究通過不同極性溶劑將通脈中不同極性的成分聚集，希望了解通脈抗血小板聚集及體外溶栓作用的活性部位。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示通脈三個(gè)萃取部位均有不同程度的抗血小板聚集及體外溶栓作用，其中石油醚部位和正丁醇部位活性最為顯著。這可能是因?yàn)槭兔巡课粸榈蜆O性部位，丹參多酚酸類化合物及揮發(fā)油類成分集中在石油醚部位[14]；正丁醇部位極性較高，葛根素及黃酮類化合物主要存在正丁醇部位[15]，因而這兩個(gè)部位顯示出較好的活性。

通脈方是由丹參、川芎、葛根組成的中藥復(fù)方，對(duì)其活性部位的研究有助于了解其活性物質(zhì)基礎(chǔ)，下一步可在本研究的基礎(chǔ)上，對(duì)活性部位進(jìn)行分離得到的單體化合物，進(jìn)行相關(guān)活性篩選及機(jī)制的研究。

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Active site of Tongmai for antiplatelet aggregation and antithrombosis

ZHANG Xiaomei1,LI Yankun2

(1.DepartmentofCardiology,TheFirstPeople’sHospital,Jingzhou,Hubei434000,China;2.SchoolofPharmacy,HubeiUniversityofScienceandTechnology,Xianning,Hubei437100,China)

ObjectiveTo study the active site of Tongmai for antiplatelet aggregation and antithrombosis.MethodsThe inhibition rates of platelet aggregation of different parts were determined by ADP-induced platelet aggregation of rabbit.The antithrombosis of different fractions were observed by means of thrombus in vitro and whole blood gore.ResultsThe petroleum ether fraction and the n-butanol fraction have significant inhibition of platelet aggregation and thrombosis,the platelet agglutination inhibition rates and the thrombus dissolution rates of petroleum ether fraction and n-butanol fraction at high dosage were both superior to 50%(P<0.01).The whole blood gore dissolution rate of n-butanol fraction at high dosage was more than 65%(P<0.01).ConclusionsThe petroleum ether fraction and n-butanol fraction have significant inhibition of platelet aggregation and thrombosis.

Ligusticum chuanxiong;Pueraria lobata;Salvia miltiorrhiza;Platelet aggregation inhibitors;Thrombosis;Catalytic domain;Rabbits

湖北省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(2014CFB186)

李炎坤，男，博士，副教授，研究方向：心腦血管藥理學(xué)，E-mail：yxyliyk@163.com

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.08.009

2016-05-29，

2016-06-17)