白花丹素抑制腎小球系膜細(xì)胞增殖及促纖維化相關(guān)因子的表達(dá)

謝議鳳，王站旗，蘇佩玲

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院腎病科，廣西 柳州　545001)

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白花丹素抑制腎小球系膜細(xì)胞增殖及促纖維化相關(guān)因子的表達(dá)

謝議鳳，王站旗，蘇佩玲

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院腎病科，廣西 柳州545001)

目的探討白花丹素對(duì)人腎小球系膜細(xì)胞株HMC細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)、纖維連接蛋白(FN)表達(dá)的影響。 方法1～10 μmol·L-1白花丹素分別處理HMC細(xì)胞后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性；RT-PCR和細(xì)胞免疫熒光法分別檢測(cè)TGF-β1、CTGF、FN mRNA和蛋白的表達(dá)。結(jié)果1～10 μmol·L-1白花丹素作用后，HMC細(xì)胞呈時(shí)間、濃度依賴性生長(zhǎng)抑制，TGF-β1、CTGF、FN mRNA和蛋白的表達(dá)下降。結(jié)論白花丹素通過(guò)降低HMC細(xì)胞TGF-β1、CTGF、FN的表達(dá)，抑制HMC細(xì)胞增殖。

白花丹;轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1;結(jié)締組織生長(zhǎng)因子;連接蛋白類

白花丹素(plumbagin,PL)是我國(guó)廣西、云南等地出產(chǎn)的常見(jiàn)草藥白花丹的主要活性成分，具有抗真菌、抗腫瘤、抗細(xì)菌、抗凝等多種藥理作用[1]。近來(lái)有文獻(xiàn)報(bào)道白花丹提取物具有抗小鼠肝纖維化的作用[2]，但是白花丹素是否是其抗纖維化的主要活性物質(zhì)，其對(duì)腎纖維化的影響仍未見(jiàn)報(bào)道。本研究擬通過(guò)探討白花丹素對(duì)人腎小球系膜株HMC細(xì)胞的作用，為臨床防治腎臟纖維化提供新的思路。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1細(xì)胞株HMC細(xì)胞是正常人腎小球細(xì)胞細(xì)胞株，為T-SV40及H-ras原癌基因轉(zhuǎn)染的永生系,它保持正常人腎系膜細(xì)胞基本的形態(tài)學(xué)和生物學(xué)特征，由南京中大醫(yī)院腎內(nèi)科劉必成教授、江蘇省中醫(yī)院腎內(nèi)科王鋼教授惠贈(zèng)。

1.1.2試劑白花丹素以二甲基亞砜(DMSO)配制成0.1 mol·L-1存儲(chǔ)液備用，使用時(shí)以1640培養(yǎng)液(Gibco)稀釋至相應(yīng)濃度。DMSO實(shí)驗(yàn)終質(zhì)量濃度小于0.1%，經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)對(duì)HMC細(xì)胞無(wú)影響。胎牛血清購(gòu)于武漢三利生物公司。二甲基亞砜(DMSO)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)均購(gòu)自Sigma公司。兔抗人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)多克隆抗體(Santa Cruz)、兔抗人結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)多克隆抗體(Santa Cruz)、兔抗人纖維連接蛋白(FN)多克隆抗人抗體(Santa Cruz)均購(gòu)于北京中杉金橋生物公司。SABC免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒、FITC標(biāo)記羊抗兔IgG(Pierce)購(gòu)于武漢博士德生物有限公司。Trizol試劑(Invitrogen)購(gòu)于武漢凌飛生物有限公司。逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增試劑盒(Fermentas)購(gòu)于武漢興華生物公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組人腎小球系膜細(xì)胞株HMC在含有10%胎牛血清、青霉素100 U·mL-1及鏈霉素100 mg·L-1的1640培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。1～2 d換液一次，3～4 d傳代一次。設(shè)置空白對(duì)照組(不加藥組)、DMSO對(duì)照組(溶劑對(duì)照組)；不同濃度(1.0、2.5、5.0、7.5、10.0 μmol·L-1)白花丹素藥物作用組。

1.2.2細(xì)胞體外增殖活性檢測(cè)采用MTT比色法。 取3×104·mL-1人腎小球系膜細(xì)胞株HMC接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，每組6個(gè)復(fù)孔。待各藥物分別作用于HMC細(xì)胞24、48、72 h后，每孔加入0.5% MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清，加DMSO 每孔100 μL，振蕩至結(jié)晶溶解，酶標(biāo)儀490 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A值。

1.3RT-PCR檢測(cè)TGF-β1、CTGF、FN的表達(dá)將接種于6孔板內(nèi)經(jīng)不同濃度白花丹素或溶劑作用24 h后的HMC細(xì)胞棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS漂洗后用Trizol試劑盒提取RNA，DNA/RNA測(cè)量?jī)x測(cè)得RNA濃度，用RT-PCR擴(kuò)增TGF-β1、CTGF、FN，1.5%瓊脂糖凝膠電泳、凝膠圖像分析儀(Gene Genius)紫外光下采集圖像并分析。以GAPDH做為內(nèi)參照，以目的基因與同一標(biāo)本的GAPDH的RT-PCR產(chǎn)物條帶的吸光度比值來(lái)表示其相對(duì)含量。見(jiàn)表1。

表1　PCR引物序列

1.4細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)TGF-β1、CTGF、FN 的表達(dá)將1×105每孔 HMC接種于24板上，待細(xì)胞生長(zhǎng)至60%左右加入不同濃度白花丹素或溶劑，24 h后棄去培養(yǎng)基，PBS漂洗，4%多聚甲醛固定，0.2%Triton X-100破膜，正常山羊血清封閉，一抗過(guò)夜，PBS漂洗后加入FITC標(biāo)記羊抗兔IgG，室溫孵育30 min后熒光顯微鏡下觀察結(jié)果并照相，以PBS作空白對(duì)照。結(jié)果用Imagepro-plus5.0生物圖像系統(tǒng)在顯微鏡下(200×)隨機(jī)觀察5個(gè)區(qū)域，進(jìn)行平均吸光度測(cè)定。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)及方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1白花丹素對(duì)體外培養(yǎng)HMC細(xì)胞增殖的影響如圖1所示，與空白對(duì)照組比較，經(jīng)各濃度白花丹素處理24、48、72 h后，HMC 細(xì)胞呈時(shí)間、濃度依賴性生長(zhǎng)抑制，不同濃度藥物與不同作用時(shí)間組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05) ；DMSO對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)活性未見(jiàn)明顯抑制 (P>0.05)。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；**P<0.01。

圖1不同白花丹素濃度和作用時(shí)間對(duì)HMC細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的影響

2.2白花丹素對(duì)HMC細(xì)胞TGF-β1、CTGF、FN mRNA的表達(dá)的影響如表2和圖2所示，不同濃度的白花丹素處理24 h后， TGF-β1、CTGF、FN mRNA的表達(dá)抑制，并呈一定的濃度依賴性(P<0.05)。

表2　白花丹素對(duì)HMC細(xì)胞TGF-β1、CTGF、FN mRNA的表達(dá)的影響

注：與對(duì)照組比較，aP<0.01,bP<0.05。

注：A：TGF-β1；B：CTGF；C：FN；D：GAPDH；A～D圖中1.對(duì)照組；2～6.白花丹素1.0、2.5、5.0、7.5、10.0 μmol·L-1組。

注：E.目的基因mRNA/GAPDH的柱狀圖。與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

圖2白花丹素對(duì)HMC細(xì)胞TGF-β1、CTGF、FN mRNA表達(dá)的影響

2.3白花丹素對(duì)HMC細(xì)胞TGF-β1、CTGF、FN 表達(dá)的影響如圖3和表3所示，不同濃度的白花丹素處理24 h后， HMC細(xì)胞免疫熒光顯示TGF-β1、CTGF、FN 的表達(dá)受抑制，并呈濃度依賴性，不同濃度藥物組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3　討論

腎小球系膜細(xì)胞是一種維持正常腎小球結(jié)構(gòu)和功能所必須的腎臟固有細(xì)胞。系膜細(xì)胞在分泌細(xì)胞因子、調(diào)節(jié)腎小球血流、維持基質(zhì)的正常代謝等方面發(fā)揮重要的生理作用。在病理情況下，損傷后的系膜細(xì)胞由靜止?fàn)顟B(tài)轉(zhuǎn)而表現(xiàn)為細(xì)胞增殖活躍，通過(guò)自分泌或旁分泌形式釋放多種細(xì)胞因子，使細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生增加，降解減少，系膜基質(zhì)聚集[3-4]。過(guò)量聚積的系膜基質(zhì)可以導(dǎo)致毛細(xì)血管被擠壓、閉塞、濾過(guò)面積減少，最終導(dǎo)致腎小球硬化的發(fā)生及腎功能衰退[4-5]。我們的實(shí)驗(yàn)證明首次白花丹素能夠抑制人腎小球細(xì)胞細(xì)胞株HMC增殖，其抑制增殖作用呈量效依賴關(guān)系。

注：1A.TGF-β1空白對(duì)照組；1B.5 μmol·L-1白花丹素干預(yù)組；1C.10 μmol·L-1白花丹素干預(yù)組 (100×)。2A.CTGF空白對(duì)照組；2B.5 μmol·L-1白花丹素干預(yù)組；2C.10 μmol·L-1白花丹素干預(yù)組 (100×)。3A.FN空白對(duì)照組；3B.5 μmol·L-1白花丹素干預(yù)組；3C.10 μmol·L-1白花丹素干預(yù)組 (200×)。

圖3　白花丹素對(duì)HMC細(xì)胞TGF-β1、CTGF、FN 表達(dá)的影響

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05,bP<0.01。

TGF-β1是作用最強(qiáng)的致腎纖維化細(xì)胞因子,腎臟固有細(xì)胞及炎細(xì)胞均可分泌。TGF-β1是引起腎小球硬化主要介質(zhì),可能是通過(guò)促進(jìn)系膜細(xì)胞合成細(xì)胞外基質(zhì),并促進(jìn)其在系膜區(qū)沉積而起作用,是腎損害導(dǎo)致纖維化的最后的和共同的重要中介因子。CTGF是TGF-β1的下游蛋白因子,主要介導(dǎo)TGF-β1促細(xì)胞外基質(zhì)積聚,參與各種組織器官纖維化形成過(guò)程[6]。TGF-β1是一個(gè)有廣泛生物學(xué)活性的蛋白因子,而CTGF具有較特異的促纖維化效應(yīng)[7]。在增生性成纖維化腎臟病變中,毛細(xì)血管外系膜增生病損區(qū)、腎小球周圍纖維化區(qū)、腎間質(zhì)纖維化區(qū)均有CTGF的強(qiáng)烈表達(dá)。CTGF的表達(dá)量增加不僅是一種普遍現(xiàn)象,而且它與腎纖維化嚴(yán)重程度和進(jìn)展密切相關(guān)。研究表明CTGF可刺激體外培養(yǎng)的人腎小球系膜細(xì)胞增生及大量合成FN。FN是具有多種生物性作用重要的細(xì)胞外基質(zhì)成分,通常認(rèn)為組織/細(xì)胞FN表達(dá)量的增加與組織的纖維化有著密切的關(guān)系[8-9]。研究表明，傳統(tǒng)中藥在防治腎臟損害方面發(fā)揮重要作用[10]，探索傳統(tǒng)中藥保護(hù)腎臟功能的作用機(jī)制為中藥療法的臨床推廣提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明白花丹素可以下調(diào)TGF-β1、CTGF、FN水平的表達(dá)。

白花丹是我國(guó)西南地區(qū)的常見(jiàn)植物，為多民族藥材，民間應(yīng)用廣泛。廣西壯醫(yī)稱為“顛邦”或“裸端”；瑤醫(yī)稱為“猛老虎”或“三錢三”；云南傣醫(yī)稱為“比比篙”。民間已有將白花丹用于肝臟疾病的應(yīng)用[11]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明白花丹提取物具有抗四氯化碳所致小鼠肝纖維化的作用，但其抗纖維化機(jī)制及其有效成分仍不清楚[2]。白花丹素是白花丹主要有效成分，為一種相對(duì)分子量為188.18的小分子萘醌化合物。目前發(fā)現(xiàn)有抗腫瘤、抗細(xì)菌、真菌、螨蟲(chóng)等多種藥理作用[1,12-15]。白花丹素是否具有抗纖維化作用國(guó)內(nèi)外仍未見(jiàn)報(bào)道。通過(guò)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示白花丹素在體外能有效的抑制HMC細(xì)胞增殖，并抑制腎纖維化相關(guān)因子TGF-β1、CTGF、FN的表達(dá)，這一作用呈量效依賴關(guān)系。

本研究結(jié)果提示我們白花丹素可能在體內(nèi)也具有抑制HMC細(xì)胞增殖及TGF-β1、CTGF、FN的表達(dá)，減少細(xì)胞外基質(zhì)的積聚，從而發(fā)揮延緩腎臟纖維化、保護(hù)腎功能的作用。白花丹素在體內(nèi)對(duì)腎纖維化的作用需要我們下一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛠?lái)證明。

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Inhibition effect of plumbagin on proliferation of human glomerular mesangial cell and the mechanisms

XIE Yifeng，WANG Zhanqi，SU Peiling

(DepartmentofNephropathy,TheThirdAffiliatedHospitalofGuangxiUniversityofChineseTraditionalMedicine，Liuzhou,Guangxi545001,China)

ObjectiveTo investigate the effects of plumbagin (PL) on the proliferation of human mesangial cell (HMC) cultured in vitro and the expression of TGF-β1,CTGF,FN in mRNA and protein level.MethodsThe experiment subjects were randomized into control group and five PL groups with different concentrations (1.0,2.5,5.0,7.5,10.0 μmol·L-1),which were treated with DMSO and PL respectively.The proliferation activity of mesangial cells was observed by MTT assay after 24,48,72 hours.The expressions of TGF-β1,CTGF,FN mRNA and protein were detected by RT-PCR and immunofluorescence after 24 hours.ResultsAbsorbance recorded at 490 nm wavelength at different time in PL group was lower than that of control group(P<0.05).Electrophoresis strip density of PCR product and absorbance of immunofluorescence in PL group was significantly lower than that of control group(P<0.05),and a dose and time response relationship was shown in results.ConclusionsPlumbagin can inhibit the proliferation of glomerular mesangial cell by downregulating the expressions of TGF-β1,CTGF,FN in mRNA and protein level.

Plumbago zeylanica;Transforming growth factor beta1;Connective tissue growth factor;Connexins

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.08.007

2016-05-18，

2016-07-05)