Wnt/β—Catenin在骨髓基質(zhì)干細(xì)胞

姚宏波+廉潔+郎尉雅+孫麗慧+張海燕+李林

[摘要]目的探討B(tài)MSCs移植對(duì)AD模型大鼠的治療作用。方法將大鼠隨機(jī)分成5組，正常組、模型組、模型對(duì)照組、治療組、治療對(duì)照組，每組10只。雙側(cè)海馬區(qū)注射Aβ建立AD大鼠模型后，治療組進(jìn)行BMSCs的移植治療。治療對(duì)照組用氫溴酸加蘭他敏進(jìn)行灌胃治療。結(jié)果行為學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組大鼠平均逃避潛伏期及首次跨越原平臺(tái)時(shí)間，模型組與正常組比較（P<0.01），治療組與治療對(duì)照組與模型組比較（P<0.01），與正常組比較（P<0.05），均有顯著性差異；形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)HE染色顯示模型組顆粒細(xì)胞及錐體細(xì)胞有破壞現(xiàn)象，治療組和治療對(duì)照組明顯恢復(fù)。免疫組化檢測(cè)顯示正常組和模型對(duì)照組可見(jiàn)海馬區(qū)陽(yáng)性蛋白表達(dá)較多而模型組陽(yáng)性表達(dá)明顯減少，治療組和治療對(duì)照組陽(yáng)性表達(dá)較模型組明顯增多。結(jié)論BMSCs移植治療AD的作用機(jī)制可能與通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，影響了學(xué)習(xí)記憶相關(guān)酶及蛋白在海馬區(qū)的表達(dá)而發(fā)揮作用有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]Wnt/β-Catenin；骨髓基質(zhì)干細(xì)胞；阿爾茨海默病

阿爾茨海默病（alzheimers disease，AD）是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其神經(jīng)組織無(wú)法自然恢復(fù)。因此，體外誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化進(jìn)行細(xì)胞移植來(lái)修復(fù)受損的神經(jīng)組織已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)之一。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，Wnt信號(hào)通路控制著體內(nèi)多種程序，例如細(xì)胞的增殖、自我更新、細(xì)胞分化、細(xì)胞極性、細(xì)胞死亡等過(guò)程。Wnt信號(hào)通路與AD的病理過(guò)程存在著十分密切的關(guān)系，同時(shí)在神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、分化以及遷移等方面也起著重要的作用。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchvmalstem cells，BMSCs）在中樞神經(jīng)組織移植中有明顯優(yōu)勢(shì)，是一種良好的細(xì)胞替代治療的靶細(xì)胞。因此本研究希望通過(guò)觀察Wnt通路相關(guān)蛋白β-Catenin的變化，探討B(tài)MSCs移植對(duì)AD模型大鼠的治療作用。

1材料與方法

1.1材料

清潔級(jí)健康Wistar雄性大鼠50只，體重180～220g，由吉林大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供；Moriss水迷宮；大鼠腦立體定位儀；Aβ美國(guó)Biosource公司；氫溴酸加蘭他敏，陜西森弗生物技術(shù)有限公司；β-Catenin測(cè)試盒購(gòu)自武漢眾一生物試劑經(jīng)營(yíng)部。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

健康Wistar大鼠雄性50只隨機(jī)分成5組，正常組、模型組、模型對(duì)照組、治療組、治療對(duì)照組，每組10只。

1.3方法

正常組：常規(guī)飼養(yǎng)，不進(jìn)行任何處理。模型組：稱重，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腦立體定位儀固定，暴露頂骨，根據(jù)大鼠腦立體定位儀圖譜，選擇大鼠海馬區(qū)進(jìn)行注射雙側(cè)海馬區(qū)注射Aβ每側(cè)10μL，5min內(nèi)注完，注射后留針5min，術(shù)后用牙托粉封固骨孔，縫合皮膚，三日內(nèi)每日肌注青霉素G10萬(wàn)單位。造模后7天，利用Moriss水迷宮進(jìn)行試驗(yàn)，檢測(cè)造模是否成功，成功后不進(jìn)行任何治療。模型對(duì)照組，注射生理鹽水代替Aβ方法同模型組。治療組：建立AD大鼠模型后，進(jìn)行BMSCs的移植治療，將培養(yǎng)好的BMSCs向AD模型大鼠雙側(cè)海馬內(nèi)注射，注射部位為原Aβ的注射部位，術(shù)后處理同模型組。治療對(duì)照組：建立AD大鼠模型后，用氫溴酸加蘭他敏，以每日每千克體重0.6mg灌胃，治療30d。

1.4測(cè)定方法

1.4.1行為學(xué)實(shí)驗(yàn)在造模后7d及治療30d后，進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)：定位航行實(shí)驗(yàn)用于測(cè)量大鼠對(duì)水迷宮學(xué)習(xí)和記憶的獲取能力。將大鼠進(jìn)行水迷宮學(xué)習(xí)訓(xùn)練3d。記錄其尋找到隱藏在水面下平臺(tái)的時(shí)間，即逃避潛伏期?？臻g探索實(shí)驗(yàn)用于測(cè)量大鼠學(xué)會(huì)尋找平臺(tái)后，對(duì)平臺(tái)空間位置記憶的保持能力。定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，即第4d開(kāi)始撤去平臺(tái)，將大鼠從同一個(gè)入水點(diǎn)放入水中，測(cè)驗(yàn)大鼠對(duì)原平臺(tái)的記憶。記錄其第一次到達(dá)原平臺(tái)位置的時(shí)間。

1.4.2形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)各組大鼠行為學(xué)檢測(cè)完畢，取腦組織海馬進(jìn)行石蠟切片制作并采用HE染色觀察海馬神經(jīng)元的形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變。

1.4.3免疫組化染色

采用PV二步法進(jìn)行免疫組化檢測(cè)各組AD大鼠海馬組織細(xì)胞中Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白β-Catenin的表達(dá)，其中陰性對(duì)照組應(yīng)用0.01MPB緩沖液代替一抗，顯微鏡觀察。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Image-Proplus5.0圖像分析軟件及SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，進(jìn)行t檢驗(yàn)，計(jì)量資料以（x±s）表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1行為學(xué)檢測(cè)

定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組大鼠平均逃避潛伏期及首次跨越原平臺(tái)時(shí)間。模型組大鼠逃避潛伏期及首次跨越平臺(tái)時(shí)間均比正常組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，治療對(duì)照組及治療組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力有明顯改善，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。

2.2形態(tài)學(xué)檢測(cè)

各組大鼠行為學(xué)檢測(cè)完畢，取腦組織海馬進(jìn)行石蠟切片制作并采用HE染色觀察海馬神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)改變。見(jiàn)圖1。

A和B兩圖可見(jiàn)海馬區(qū)顆粒細(xì)胞及錐體細(xì)胞呈多層規(guī)則排列，整齊而緊密。神經(jīng)元內(nèi)胞漿豐富，顆粒細(xì)胞核大而圓，染色質(zhì)較淺，核膜清楚，可見(jiàn)清晰嗜堿性核仁；錐體細(xì)胞樹(shù)突豐富，長(zhǎng)而整齊地向海馬伸展；c圖顆粒細(xì)胞及錐體細(xì)胞有破壞現(xiàn)象，細(xì)胞排列稀疏、紊亂，細(xì)胞體積縮小，間隙擴(kuò)大，出現(xiàn)胞漿濃縮深染和胞核固縮，錐體細(xì)胞樹(shù)突變短，稀疏；D和E圖海馬區(qū)顆粒細(xì)胞排列較規(guī)整，細(xì)胞清晰，核圓，核仁明顯，細(xì)胞數(shù)量減少。

2.3wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白β-Catenin的表達(dá)

A和B兩圖可見(jiàn)海馬區(qū)陽(yáng)性蛋白表達(dá)較多，可見(jiàn)較多棕黃色顆粒主要位于胞漿內(nèi)；C圖陽(yáng)性表達(dá)明顯減少；D和E圖海馬區(qū)陽(yáng)性表達(dá)與C圖比較明顯增多，接近于A圖和B圖。見(jiàn)圖2。

3討論

AD是中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶能力損害，是老年癡呆最常見(jiàn)的一種。腦內(nèi)老年斑形成、含有tau蛋白的神經(jīng)纖維纏結(jié)以及神經(jīng)元缺失變性是其三大病理學(xué)特征。Wnt信號(hào)通路的激活能夠阻止β-淀粉樣蛋白引起的神經(jīng)毒性對(duì)神經(jīng)元的損害。此外，突觸丟失誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡也是AD發(fā)病的危險(xiǎn)因素之一。如果突觸組裝與去組裝行為發(fā)生失衡，那么便可能會(huì)引起神經(jīng)退行性病變，激活Wnt信號(hào)通路能夠通過(guò)促進(jìn)突觸發(fā)生而保護(hù)神經(jīng)元。大量研究表明，Wnt信號(hào)通路參與了有功能的完整的神經(jīng)元產(chǎn)生的大部分過(guò)程，故Wnt信號(hào)通路在AD的發(fā)生中起著重要的作用。Wnt蛋白通過(guò)自分泌或旁分泌作用與位于細(xì)胞膜上的受體相結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，在胚胎的發(fā)育過(guò)程中對(duì)細(xì)胞的增殖、分化、遷移、極性化和凋亡均起到重要的作用。神經(jīng)元死亡是神經(jīng)退行性疾病如AD、帕金森病以及腦中風(fēng)、腦外傷等最為重要的病理特征。研究發(fā)現(xiàn)，精神分裂癥患者腦內(nèi)Wnt信號(hào)通路失調(diào)，通路中的胞內(nèi)β-Catenin含量明顯減少。β-Catenin基因位于3p21，編碼蛋白分子量約92kD，是Wnt信號(hào)通路中的重要一員，是正向調(diào)節(jié)因素。Wnt信號(hào)的傳遞取決于胞漿內(nèi)游離β-catenin的水平。Wnt/β-Catenin信號(hào)途徑對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化都有著重要的作用，細(xì)胞內(nèi)游離β-Catenin的水平能夠影響-神經(jīng)元樹(shù)突的形態(tài)發(fā)生，同時(shí)，高水平的β-Catenin還可促進(jìn)神經(jīng)元樹(shù)突的分枝。

BMSCs是存在于骨髓腔內(nèi)的多能干細(xì)胞，具有獨(dú)特的免疫學(xué)特征，是理想的組織工程種子細(xì)胞。因其來(lái)源廣泛，取材方便，增殖能力強(qiáng)，并且具有多向分化能力，在特定的條件下能被誘導(dǎo)分化為骨、軟骨、脂肪等中胚層細(xì)胞，所以被廣泛應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)行列，在一些神經(jīng)系統(tǒng)疾病如神經(jīng)退行性疾病的治療中發(fā)揮作用。Lee等發(fā)現(xiàn)，將BMSCs移植到AD大鼠海馬的齒狀回附近，細(xì)胞移植組的β-淀粉樣蛋白水平下降，并且β-淀粉樣蛋白沉積的減少伴隨著小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，小膠質(zhì)細(xì)胞常常出現(xiàn)在β-淀粉樣蛋白沉積的附近，因此BMSCs具有清除β-淀粉樣蛋白沉積和/或阻斷β-淀粉樣蛋白沉積形成的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs移植治療后，在AD模型大鼠的行為學(xué)、形態(tài)學(xué)以及免疫組化等檢測(cè)方面，均有明顯改變，符合上述研究發(fā)現(xiàn)。因此，深入闡明Wnt信號(hào)在干細(xì)胞中的精確功能，在干細(xì)胞增殖分化中的具體機(jī)制及其與AD的關(guān)系，對(duì)將來(lái)臨床BMSCs治療AD等神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病方面具有非常重要的意義。