不同糖對(duì)擬南芥種子萌發(fā)和sscd1突變體細(xì)胞死亡的影響

黃 弈， 支添添， 任春梅,2*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙 410128；2.作物基因工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙 410128)

?

不同糖對(duì)擬南芥種子萌發(fā)和sscd1突變體細(xì)胞死亡的影響

黃 弈1， 支添添1， 任春梅1,2*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙 410128；2.作物基因工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙 410128)

[目的]比較不同糖對(duì)擬南芥種子萌發(fā)以及sscd1突變體細(xì)胞死亡的影響。[方法]以擬南芥Col-0野生型和sscd1突變體為材料，在培養(yǎng)基中外源添加蔗糖、葡萄糖、果糖和麥芽糖，比較不同糖對(duì)擬南芥種子萌發(fā)和sscd1突變體細(xì)胞死亡的影響。[結(jié)果]在120 mmol/L濃度范圍內(nèi)，蔗糖、葡萄糖和果糖對(duì)擬南芥種子的萌發(fā)無顯著影響，而麥芽糖對(duì)種子萌發(fā)有延遲作用，且糖濃度越高延遲作用越顯著。120 mmol/L不同糖對(duì)sscd1突變體細(xì)胞死亡的抑制效果有顯著差異，抑制效果由高到低依次為麥芽糖、蔗糖、葡萄糖和果糖。[結(jié)論]該研究為深入研究糖代謝途徑調(diào)控酪氨酸降解途徑的機(jī)理提供理論依據(jù)。

糖；擬南芥；sscd1突變體；細(xì)胞死亡

筆者在前期研究中通過EMS誘導(dǎo)法分離了一種在短日照條件下(8 h光照/16 h黑暗)發(fā)生細(xì)胞死亡的擬南芥突變體sscd1(short-day sensitive cell death1)[1]。這種突變體在短日照條件下的MS培養(yǎng)基上萌芽，葉片會(huì)出現(xiàn)先萎蔫后白化的現(xiàn)象。采用臺(tái)盼藍(lán)染色的方法研究萎蔫及白化苗的死亡情況，結(jié)果證實(shí)，突變體sscd1萎蔫處發(fā)生細(xì)胞死亡[2]。通過基因定位和序列分析發(fā)現(xiàn)sscd1基因編碼酪氨酸降解途徑的最后一個(gè)酶——延胡索酰乙酰乙酸酶(fumarylacetoacetate hydrolase，F(xiàn)AH)。酪氨酸降解途徑在動(dòng)物中是必不可少的， FAH缺失會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物先天性致死。然而，酪氨酸降解途徑在植物中的作用仍有待闡明[3-6]。在培養(yǎng)基中外源添加糖之后，sscd1突變體細(xì)胞死亡的表型有所恢復(fù)[7]。糖類是植物體內(nèi)重要的碳源和能源，它不僅參與能量代謝，還調(diào)控植物的生長發(fā)育和生理過程，包括在種子萌發(fā)、幼苗生根、胚胎發(fā)育和衰老等發(fā)育過程中都起到了重要作用[8-9]。筆者嘗試添加同一濃度不同糖如蔗糖、葡萄糖、果糖和麥芽糖，觀察擬南芥種子的萌發(fā)以及sscd1突變體細(xì)胞死亡情況，比較不同糖對(duì)擬南芥種子萌發(fā)以及sscd1突變體細(xì)胞死亡的影響，為深入研究糖代謝途徑調(diào)控酪氨酸降解途徑的機(jī)理提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料擬南芥(Arabidopsisthaliana)野生型Col-0和sscd1突變體，由作物基因工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)課題組保存。

1.2試劑與儀器蔗糖、葡萄糖、果糖、麥芽糖和瓊脂粉購自國藥公司。智能人工氣候箱：PRX-450B。

1.3培養(yǎng)方法用消毒液(20% bleach+0.1% Triton100)將Col-0野生型和sscd1突變體種子浸泡8～10 min后，用無菌水清洗3～4次，分別鋪種在含有0、30、60、120 mmol/L蔗糖(Suc)、葡萄糖(Glc)、果糖(Fru)、麥芽糖(Mal)的MS固體培養(yǎng)基上，4 ℃下春化3 d后轉(zhuǎn)入8 h光照/16 h黑暗的人工氣候箱，培養(yǎng)溫度(23±2)℃，光照強(qiáng)度80～120 μmol/(m2·s)，相對(duì)濕度65%。

1.4測(cè)定指標(biāo)與方法①以種子露出白色胚芽為萌發(fā)標(biāo)志，對(duì)2、4、6 d的萌發(fā)情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。②以葉片完全白化為細(xì)胞死亡標(biāo)志，對(duì)12 d的細(xì)胞死亡情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2　結(jié)果與分析

2.1不同糖對(duì)擬南芥種子萌發(fā)的影響以MS培養(yǎng)基為對(duì)照，分別在外源添加0、30、60和120 mmol/L的蔗糖、葡萄糖、果糖和麥芽糖的培養(yǎng)基上鋪種擬南芥Col-0野生型和sscd1突變體，轉(zhuǎn)入短日照條件下生長，分別對(duì)2、4、6 d的種子萌發(fā)率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見圖1。由圖1可知，在外源添加蔗糖、葡萄糖和果糖的培養(yǎng)基中，擬南芥Col-0野生型和sscd1突變體種子在第2天幾乎完全萌發(fā)，且在120 mmol/L糖濃度范圍內(nèi)的萌發(fā)率差別不大；而在30 mmol/L麥芽糖作用下，相對(duì)于其他3種糖，2 d時(shí)種子的萌發(fā)率有一定程度的降低，且在120 mmol/L濃度范圍內(nèi)，麥芽糖濃度越高，萌發(fā)率越低，但生長6 d后，種子幾乎完全萌發(fā)。這表明在120 mmol/L濃度范圍內(nèi)，蔗糖、葡萄糖和果糖對(duì)擬南芥種子的萌發(fā)并無顯著影響；而麥芽糖對(duì)擬南芥Col-0野生型和sscd1突變體種子的萌發(fā)均有延遲作用，且隨著麥芽糖濃度的升高，這種延遲作用更加顯著。

圖1　外源添加不同糖的擬南芥種子萌發(fā)情況Fig.1　Germination situation of Arabidopsis seedlings with different sugars

2.2不同糖對(duì)sscd1突變體細(xì)胞死亡的影響在前期研究中發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中外源添加糖后，擬南芥sscd1突變體細(xì)胞死亡的表型有所恢復(fù)[7]。為了分析不同糖對(duì)擬南芥sscd1突變體細(xì)胞死亡的影響，分別在含有30和120 mmol/L蔗糖、葡萄糖、果糖和麥芽糖的培養(yǎng)基上鋪種擬南芥Col-0野生型和sscd1突變體，轉(zhuǎn)入短日照條件下生長12 d后對(duì)細(xì)胞死亡表型進(jìn)行觀察，結(jié)果見圖2。由圖2可知，添加30 mmol/L不同糖的培養(yǎng)基上，擬南芥sscd1突變體幼苗大部分仍出現(xiàn)細(xì)胞死亡的表型；而在添加120 mmol/L不同糖的培養(yǎng)基上，擬南芥sscd1突變體的細(xì)胞死亡表型有不同程度的恢復(fù)。

注：C.Col-0野生型；S.sscd1突變體。Note:C.Col-0 wild type; S.sscd1 mutant.圖2　外源添加不同糖的擬南芥幼苗細(xì)胞死亡表型Fig.2　Cell death phenotype in Arabidopsis seedlings with different sugars

為了比較不同糖抑制擬南芥sscd1突變體細(xì)胞死亡的差異，進(jìn)一步對(duì)不同濃度糖作用下擬南芥sscd1突變體的細(xì)胞死亡率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見圖3。由圖3可知，外源添加30 mmol/L葡萄糖和果糖的培養(yǎng)基上，sscd1突變體的細(xì)胞死亡率約為91%，與無糖對(duì)照相比無明顯差別；外源添加30 mmol/L的蔗糖和麥芽糖的培養(yǎng)基上，sscd1突變體細(xì)胞死亡率約為83%，與葡萄糖和果糖相比有一定程度的降低，但不顯著。在外源添加120 mmol/L糖的培養(yǎng)基上，相對(duì)于無糖以及添加30 mmol/L糖的培養(yǎng)基，sscd1突變體的細(xì)胞死亡率均顯著降低，且不同糖對(duì)sscd1突變體細(xì)胞死亡的抑制效果有明顯差異，其中，麥芽糖的抑制效果最好，其次是蔗糖、葡萄糖和果糖。這表明30 mmol/L不同糖對(duì)sscd1突變體的細(xì)胞死亡有一定程度的抑制，但抑制效果無明顯差別。120 mmol/L糖對(duì)擬南芥sscd1突變體細(xì)胞死亡的抑制效果顯著，且不同糖對(duì)sscd1突變體細(xì)胞死亡的抑制效果有明顯差異，抑制效果由高到低依次為麥芽糖、蔗糖、葡萄糖和果糖。

圖3　外源添加不同糖的擬南芥sscd1突變體細(xì)胞死亡率Fig.3　Morality rate of Arabidopsis sscd1 mutant cells with adding different sugars

3　結(jié)論與討論

該試驗(yàn)通過觀察外源添加不同糖的培養(yǎng)基中擬南芥Col-0野生型和sscd1突變體的萌發(fā)和sscd1突變體細(xì)胞死亡情況，比較不同糖對(duì)擬南芥種子萌發(fā)以及sscd1突變體細(xì)胞死亡的影響。結(jié)果表明，在120 mmol/L濃度范圍內(nèi)，蔗糖、葡萄糖和果糖對(duì)擬南芥種子萌發(fā)無顯著影響，而麥芽糖對(duì)Col-0野生型以及sscd1突變體種子的萌發(fā)均有延遲作用，且糖濃度越高，延遲作用越顯著。其次，在培養(yǎng)基中外源添加120 mmol/L 糖時(shí)，不同糖對(duì)擬南芥sscd1突變體細(xì)胞死亡的抑制效果有顯著差異，其中，麥芽糖的抑制效果最好，其次是蔗糖、葡萄糖和果糖。

前期研究中通過濃度梯度設(shè)計(jì)確定了1%和4%作為低濃度和高濃度的代表，該試驗(yàn)通過換算選取30和120 mmol/L作為試驗(yàn)濃度。該試驗(yàn)中麥芽糖對(duì)擬南芥種子萌發(fā)具有延遲作用，但生長一定時(shí)間后，大部分種子仍能萌發(fā)，但其對(duì)萌發(fā)后幼苗生長的影響還有待進(jìn)一步研究。不同糖對(duì)擬南芥sscd1突變體細(xì)胞死亡的抑制效果有所不同，可能是與不同糖類作為信號(hào)分子參與調(diào)控植物體內(nèi)不同的生理過程有關(guān)，而麥芽糖與蔗糖的抑制效果明顯優(yōu)于葡萄糖和果糖，推測(cè)可能是由于麥芽糖和蔗糖是二糖，其要水解成單糖才能參與調(diào)控植物的生長和發(fā)育，具體機(jī)制尚不明確。目前對(duì)于糖類的研究已取得了一定進(jìn)展，而關(guān)于糖抑制擬南芥sscd1突變體細(xì)胞死亡的分子機(jī)制以及糖代謝途徑與酪氨酸降解途徑的關(guān)系還有待于進(jìn)一步探討。

[1] 韓成云.擬南芥短日照依賴型模似病斑SDL1基因的分離和功能分析[D].長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[2] 支添添，周舟，韓成云，等.臺(tái)盼藍(lán)染色鑒定擬南芥sdl1突變體的細(xì)胞死亡[J].作物研究，2013，27(3):217-218.

[3] APONTE J L, SEGA G A, HAUSER L J, et al.Point mutations in the murine fumarylacetoacetate hydrolase gene:Animal models for the human genetic disorder hereditary tyrosinemia type 1[J].Proc Natl Acad Sci USA，2001, 98:641-645.

[4] DIXON D P，EDWARDS R.Enzymes of tyrosine catabolism inArabidopsisthaliana[J].Plant Sci, 2006, 171:360-366.

[5] GROMPE M, AL-DHALIMY M, FINEGOLD M, et al.Loss of fumarylacetoacetate hydrolase is responsible for the neonatal hepatic dysfunction phenotype of lethal albino mice[J].Genes Dev, 1993, 7:2298-2307.

[6] HAN C Y, REN C M, ZHI T T, et al.Disruption of fumarylacetoacetate hydrolase causes spontaneous cell death under short-day conditions inArabidopsis[J].Plant physiology, 2013, 162(4):1956-1964.

[7] 支添添.擬南芥sscd1突變體細(xì)胞死亡機(jī)理的研究[D].長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

[8] LEON P,SHEEN J.Sugar hormone connection[J].Plant Sci, 2003, 8(3):110-116.

[9] ROLLAND F, BAENA-GONZALEZ E J, SHEEN J.Sugar sensing and signaling in plants:Conserved and novel mechanisms[J].Plant Biol, 2006, 57:675-709.

Effects of Different Sugars onArabidopsisSeed Germination andsscd1 Mutant Cell Death

HUANG Yi1, ZHI Tian-tian1, REN Chun-mei1,2*

(1.College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha, Hunan 410128; 2.Key Laboratory of Crop Gene Engineering of Hunan Province, Changsha, Hunan 410128)

[Objective] To compare the effects of different sugars onArabidopsisseed germination andsscd1 mutant cell death.[Method] With wide type (Col-0) and the mutantsscd1 as research materials, effects of different sugars onArabidopsisseed germination andsscd1 cell death were compared by adding sucrose, glucose, fructose and maltose in the culture medium.[Result] At the 120 mol/L concentration range, sucrose, glucose and fructose had no significant effects onArabidopsisseed germination, but maltose delayed seed germination.And high sugar concentration had more significant delaying effects.Different sugars at 120 mol/L concentration showed significant differences in the inhibitory effects on sscd1 cell death, and the effects from high to low were in the order of maltose, sucrose, glucose and fructose.[Conclusion] This research provides important foundation for the in-depth mechanism research on regulating of tyrosine degradation pathway by glucose metabolic pathway.

Sugar;Arabidopsis;sscd1 mutant; Cell death

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30671121)。

黃弈(1990- )，男，湖南株洲人，碩士研究生，研究方向：植物分子遺傳學(xué)。*通訊作者，教授，博士，博士生導(dǎo)師，從事植物分子遺傳學(xué)研究。

2016-06-23

S 188;Q 94

A

0517-6611(2016)23-093-03