綠色甜菊糖制備工藝的研究及主要成分分析

王姣姣

(天津中德職業(yè)技術(shù)學(xué)院, 天津 300350)

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綠色甜菊糖制備工藝的研究及主要成分分析

王姣姣

(天津中德職業(yè)技術(shù)學(xué)院, 天津 300350)

目前對甜菊糖的研究很多，而且制備甜菊糖的過程復(fù)雜，既浪費能源又污染環(huán)境，本實驗?zāi)康氖侵苽湟环N粗制品綠色甜菊糖，以備后續(xù)制備復(fù)合甜味劑。采用比較簡單傳統(tǒng)的提取制備工藝，研究了提取溫度、提取時間、料液比對甜菊糖提取率的影響，通過單因素實驗確定提取甜菊糖的最優(yōu)工藝：提取溫度70℃，時間1h，料液比為20 ml/g，在此條件下甜菊糖苷的提取率可達(dá)到88%且保持較好的品質(zhì)；功能成分分析結(jié)果：甜菊糖苷的含量為60.86%；最大吸收峰為370nm，比吸光度E=4.458；經(jīng)過液相色譜分析SS%為12.49%、RA%為10.46%、RC%為2.79%、DA%為1.55%。

甜菊糖；制備；成分；測定

甜菊糖是一種熱量低、甜度高的天然型甜味劑，市面上應(yīng)用范圍很廣，在飲料、糕點、啤酒、膨化食品等方面都有，是除了甘蔗、甜菜糖之外，第三種有開發(fā)價值的甜味劑就是甜菊糖這種天然可替代蔗糖的甜味劑了[1]。

甜菊糖的最大特點就是甜度高，甜味與木糖醇相似，甜菊糖雖然甜度高，但是其溶液具有明顯的苦澀后味，而且隨著甜菊糖溶液濃度的升高，苦澀后味越來越顯著[2]。國內(nèi)外的研究中主要從優(yōu)化生產(chǎn)工藝、酶法修飾[3]、環(huán)狀糊精包埋法等方式去除甜菊糖不良后苦味[4]。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料

甜菊葉。

1.1.2 實驗試劑和主要儀器設(shè)備

試劑：蔗糖、氫氧化鈉、鹽酸、氫氧化鈉、牛血清白蛋白、無水葡萄糖、磷酸、碳酸鈣、蒽酮、苯酚、硅藻土、海藻酸鈉、甲醛。

主要儀器設(shè)備：PHS-3C型、pH計、G10型醫(yī)用高速離心機(jī)、DZF-6020真空干燥箱、LHS-150SC恒溫恒濕箱、SP-2102UV型紫外可見分光光度計、FJ-200高速分散均質(zhì)機(jī)、冷凍干燥機(jī)、循環(huán)水真空泵、4000 MS氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、全波長掃描紫外分光光度計、ESJ205-4型電子天平、TG328A分析天平、HYG-IIa 回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜、K9840自動凱氏定氮儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 綠色甜菊糖的制備

采用乙醇法一步提取甜菊糖，與傳統(tǒng)的提取精致甜菊糖苷的方法相比既可以減少提取過程中添加的有毒有害物質(zhì)[5]，還可以減輕經(jīng)濟(jì)與環(huán)保壓力，而且甜菊糖糖的粗提物中還會包含一些對人體有益的維生素、葉綠素等。據(jù)文獻(xiàn)報道，傳統(tǒng)的提取方法主要采用70%的乙醇80℃水浴加熱的方法，本實驗選擇磁力攪拌水浴加熱的方法，分析料液比、水浴加熱溫度、提取時間對甜菊糖提取率的影響。

1.2.1.1 甜菊糖苷的測定

提取液中的甜菊糖苷的測定方法參考GB8270-1999中容量法。

甜菊糖苷的提取率可用下式計算：

1.2.1.2 水浴加熱溫度對甜菊糖苷提取率的影響

在電子天平上稱取6份10g經(jīng)過粉碎的新鮮甜菊葉分別放入250ml的錐形瓶中，倒入150ml濃度為70%的乙醇，放入磁力攪拌水浴鍋中，水浴溫度分別為50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃，1h之后將殘渣倒出，測定甜菊糖苷的含量，計算提取率。

1.2.1.3 料液比對甜菊糖苷提取率的影響

稱取6份10g粉碎后的甜菊葉分別放入合適的燒杯中，分別倒入100ml、150ml、200ml、250ml、300ml、350ml的濃度為70%的乙醇，放入磁力攪拌水浴鍋中，水浴溫度為80℃，1h之后將殘渣倒出，測定甜菊糖苷的含量，計算提取率。

1.2.1.4 提取時間對甜菊糖苷提取率的影響

稱取6份10g粉碎后的甜菊葉分別放入250ml的燒杯中，倒入150ml濃度為70%的乙醇，放入磁力攪拌水浴鍋中，水浴溫度為80℃，分別于30min、60min、90min、120min、150min、180min之后將殘渣倒出，測定甜菊糖苷的含量，計算提取率。

1.2.2 綠色甜菊糖的分析

1.2.2.1 綠色甜菊糖中功能成分的分析

(1)總苷含量的測定

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。精密稱取干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品1.2g，置于100mL容量瓶中，乙醇定容至刻度，配成12mg/mL的儲備液。

蒽酮溶液的配制。稱取0.1g蒽酮溶于50ml濃度為70%的硫酸中，配制2mg/ml的硫酸蒽酮溶液。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。分別吸取0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml、0.6ml的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，各以乙醇補(bǔ)至1.0mL，然后加入2mg/ml的硫酸蒽酮溶液5.0mL，充分搖勻，沸水加熱10 min以后于445nm測光密度，乙醇作為空白對照。橫坐標(biāo)為葡萄糖濃度(mg/mL)，縱坐標(biāo)為光密度，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1。

測定樣品。取一定量的測試樣品0.1g～0.5g，其他操作同上，使其測定值在標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線范圍內(nèi)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得相應(yīng)葡萄糖含量，計算樣品中總苷含量。計算公式：

(2)比吸光度的測定

精確稱取樣品1.0g于燒杯中，加少量水溶解。移入50mL容量瓶中稀釋至刻度。

用全波長掃描紫外分光光度計于200nm～800nm范圍進(jìn)行全波長掃描，確定最大吸收峰。用分光光度計在最大吸收波長下測定比吸光度。比吸光度計算公式：

式中： H— 液層高度，單位：cm;

a—測得的吸光度;

c— 每100ml溶液中含有樣品的質(zhì)量，單位：g。

(3)薄層色譜法定性分析主要成分

稱取5mg綠色甜菊糖粉末導(dǎo)入的安道管中，然后精確加入1ml濃度為70%乙醇，充分溶解以備分析使用。分別配制標(biāo)品甜菊糖苷(SS)、萊鮑迪苷A(RA)，濃度為1‰。

高效薄層硅膠鋁板長寬為1cm×2cm，展開劑為氯仿：甲醇：水=3：1.5：0.4，點樣點距離底板約有1.5cm，點樣斑點直徑應(yīng)小于3mm，待展開劑前沿距板頂2cm時，立即取出，自然晾干，用5%的硫酸均勻噴至板上，置于120-110℃的烘箱內(nèi)加熱8min～10min，使其顯色。

(4)高效液相色譜定量分析主要成分

標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備。將標(biāo)準(zhǔn)樣品甜菊糖苷(ss)置于105℃干燥箱中，烘2h，分別稱取120mg，90mg，60mg，30mg4份樣品，均用80：20的乙腈/水溶液溶解，并稀釋至25ml[6]。

樣品溶液的配制。稱取經(jīng)105℃干燥2h的樣品120mg，用80：20的乙腈/水溶液溶解，并稀釋至25ml,搖勻。

液相色譜儀的條件。色譜柱為-NH2基柱，流動相為乙腈：水=80：20，流速為1.2ml/min,檢測器為紫外檢測器，波長210nm，進(jìn)樣量為15ul。

首先測定四個甜菊糖苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(峰面積A-濃度C曲線)，測定甜菊糖苷樣品液，記錄萊鮑迪苷A(RA)、萊鮑迪苷C(RC)、甜菊糖苷(SS)、杜克苷A(DA)和甜菊雙糖苷的面積Aa、Ac、As、Ad、Ab。將Aa、Ac、As、Ad、Ab分別乘以1.20、1.18、1.00、0.98和0.80得到A′a、A′c、A′s、A′d、A′b。以標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率k=A/C分別計算出上述五個組分的含量Pi(%)。計算公式：

式 中: i —— a,c,s,d,b;

m —— 樣品的質(zhì)量，單位：g。

2.結(jié)果與討論

2.1 甜菊糖苷最適提取溫度的確定

如圖2所示，在提取為溫度為40℃～80℃范圍內(nèi)隨著水浴溫度逐漸升高，甜菊糖的提取率跟著升高，當(dāng)溫度接近70℃左右時甜菊糖提取率基本不再變化，而且70℃之后隨著加熱溫度的升高甜菊糖的提取率也不再有較大變化[7]。使用磁力攪拌水浴加熱的方法最適提取溫度比采用普通的水浴加熱方法的最適提取溫度低10℃左右，這是因為使用磁力攪拌的方法使甜菊葉與提取液可以更加充分的接觸，通過增大與溶液的接觸面積，利于甜菊糖苷的提取，同時從節(jié)約能源考慮，最適溫度選取70℃。

2. 2 甜菊糖苷最適提取時間的確定

如圖3所示，對甜菊糖苷的提取時間較短時，為30min左右，提取率較低，當(dāng)提取時間增加一倍達(dá)到1h左右時，提取率有較大的提高。1h之后隨著時間的延長，提取率雖然有小幅升高，但是提取液的氣味有一種苦味，而且隨著提取時間的延長提取液中的雜質(zhì)含量也在升高，綜上所述，甜菊糖苷的最適提取時間選為1h。

2.3 甜菊糖苷最適料液比的確定

如圖4所示，隨著料液比的增加，甜菊糖苷的提取率呈現(xiàn)上升趨勢，當(dāng)料液比達(dá)到20(ml/g)時,甜菊糖苷的提取率達(dá)到78%，且溶液中雜質(zhì)相對較少，隨著料液比的增加浸提液中雜質(zhì)量略有增加，但是幅度較小，但提取液過多既增加生產(chǎn)成本而且不利于后續(xù)的冷凍干燥，所以本實驗選擇料液比為20(ml/g)。

2.4 甜菊糖苷最優(yōu)條件的確定

綜上所述，甜菊糖苷的最優(yōu)提取條件為：提取溫度70℃，提取時間1h，料液比為20(ml/g)，在此條件下甜菊糖苷的提取率可達(dá)到88%且保持較好的品質(zhì)。

2.5 綠色甜菊糖功能成分分析結(jié)果

(1)甜菊糖總苷量的確定

以445nm為最大吸收波長，在紫外分光光度下，測定甜菊糖在酸性蔥酮中的吸光度，乘上一個校正系數(shù)后, 則可以測定出甜菊糖苷的含量為60.86%。

(2)甜菊糖比吸光度的確定

甜菊糖經(jīng)過全波長掃描后，該綠色甜菊糖粉末在370nm下有最大吸收峰，如圖5所示。測得比吸光度E=4.458。

(3)綠色甜菊糖中主要成分定性分析結(jié)果

甜菊糖中主要成分是Stevioside(SS) 和Rebaudioside A(RA)，如圖6所示，可通過薄層色譜法定性鑒定出這兩種物質(zhì)。

(4)綠色甜菊糖中各類糖味成分的含量

本實驗采用NH2柱，乙腈:水=80:20為流動相，線性關(guān)系良好的質(zhì)量濃度在1mg/ml～10 mg/ml 時，采用紫外檢測器，分析主要成分含量。SS為標(biāo)品所制作的工作曲線如圖7所示，甜菊糖樣品色譜圖如圖8所示，測得SS%=12.49%、RA%=10.46%、RC%=2.79%、DA%=1.55% 。

3.結(jié)論

(1)甜菊糖的最佳提取工藝的確定

通過單因素試驗確定了甜菊糖的最佳提取工藝為：提取溫度70℃，時間1h，料液比為20 ml/g，在此條件下甜菊糖苷的提取率可達(dá)到88%且保持較好的品質(zhì)。

(2)甜菊糖的成分分析的結(jié)果

① 基本成分分析結(jié)果：粗灰分為5.51%，水分為8.2%，粗纖維為9.8%，葉綠素a為1.144g/mg，葉綠素b為0.4427g/mg。

② 功能成分分析結(jié)果：甜菊糖苷的含量為60.86%；最大吸收峰為370nm，比吸光度E=4.458；經(jīng)過液相色譜分析SS%為12.49%、RA%為10.46%、RC%為2.79%、DA%為1.55%

[1] 楊遠(yuǎn)志，李發(fā)財.甜菊糖的應(yīng)用現(xiàn)狀及發(fā)展前景[J].發(fā)酵科技通訊，2011，30(1):40～41

[2] 郭雪霞，趙仁邦. 甜菊糖苷的保健功能及其在食品中的應(yīng)用[J]. 中國食物與營養(yǎng),2012， 18( 1): 32～35

[3] 史作清，朱伯儒.葡萄糖基-甜菊糖的酶促合成反映研究[J]. 高等學(xué)校化學(xué)報,1996，11(2):1800～1803

[4] 王貴民,董振紅,郝再彬.甜葉菊糖苷的應(yīng)用和安全性的研究進(jìn)展[J].中國食品添加劑,2007,21(6):65～69

[5] 趙永金，孫傳慶. 從甜葉菊中提取甜菊苷的工藝研究[J].西北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1994,27(2):80～82

[6] 趙永良，崔媛.高效液相色譜法測定甜菊糖苷中萊鮑迪苷A[J].食品科技,2009,34(9):293～294

[7] 舒世珍. 甜菊開發(fā)的進(jìn)展與展望[J].農(nóng)牧情報研究,1989,(3):17～24

[責(zé)任編校：張彩紅]

2015-11-15

王姣姣，女，天津人，中德職業(yè)技術(shù)學(xué)院助教。

TS201.56

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1009-5462(2016)01-0060-06