腹腔氫氣和飽和氫鹽水對(duì)家兔心肌缺血再灌注損傷及超微結(jié)構(gòu)的影響

牟春平，劉云寶，鄒永偉，王文凱，楊文文

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腹腔氫氣和飽和氫鹽水對(duì)家兔心肌缺血再灌注損傷及超微結(jié)構(gòu)的影響

牟春平1，劉云寶2，鄒永偉1，王文凱1，楊文文1

目的 探討腹腔氫氣和靜脈飽和氫鹽水對(duì)家兔心肌缺血/再灌注損傷及心肌超微結(jié)構(gòu)的影響。方法將40 只家兔麻醉開胸隨機(jī)分為假手術(shù)組(A組)、模型對(duì)照組(B組)、腹腔氫氣組(C組)和飽和氫鹽水組(B組)各10只。假手術(shù)組冠脈穿線不結(jié)扎，余3組冠脈結(jié)扎60 min后再灌注同時(shí)，B組5只腹腔氧氣10 mL/kg一次性注入，5只靜脈生理鹽水10 mL/kg10 min泵入，C組腹腔氫氣10 mL/kg10 min注入；D組靜脈飽和氫鹽水10 mL/kg泵入。B組、C組D組均再灌480 min。結(jié)果A組、C組、D組超氧化物歧化酶(SOD)明顯高于B組，但A組、C組、D組間兩兩比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；A組、C組、D組抑制羥自由基能力明顯大于B組。電鏡和Tunnul監(jiān)測(cè)顯示：A組、C組、D組細(xì)胞凋亡數(shù)明顯少于B組，心肌結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，線粒體細(xì)胞核損傷較小，僅見少量溶酶體無自噬體，而B組心肌組織破壞嚴(yán)重細(xì)胞膜線粒體脊融合斷裂較重，形成空泡部分溶酶體空泡形成，可見多個(gè)自噬體。結(jié)論兩種給氫方法均能保護(hù)缺血再灌注損傷，這種保護(hù)作用與H2清除自由基抗炎、抗凋亡有關(guān)。腹腔氫氣較靜脈氫鹽水應(yīng)用方便效果更佳。

心肌缺血再灌損傷；腹腔氫氣；飽和氫鹽水；自由基；氧反應(yīng)激；超微結(jié)構(gòu)

1　材料與方法

1．1動(dòng)物分組新西蘭白兔40只(浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供，許可證SCXK浙江2010-0047)，體重2.5 kg±0.5 kg，雌雄不限，隨機(jī)分為假手術(shù)組(A組)、模型對(duì)照組(B組)、腹腔氫氣組(C組)和飽和氫鹽水組(B組)各10只。

1.2心肌缺血/再灌注損傷(I/R)模型制備

1.2.1麻醉及動(dòng)物模型術(shù)前禁食不限水12 h，3%戊巴比妥鈉30 mg/kg，耳靜脈注入，并根據(jù)麻醉深淺適當(dāng)補(bǔ)充麻藥，應(yīng)用HX-10E動(dòng)物呼吸機(jī)(成都泰盟公司)氣管插管維持正常通氣，按文獻(xiàn)[1]報(bào)道方法開胸結(jié)扎冠脈前降支，成功60 min后松解再灌注480 min的方法復(fù)制I/R模型。

1.2.2干預(yù)方式A組開胸后冠脈穿線不結(jié)扎，其中5只腹腔氫氣10 mL/kg一次注入，5只耳靜脈生理鹽水10 mL/kg 10 min泵入；B組再灌注同時(shí)其中5只氫氣10 mL/kg腹腔注入，5只耳靜脈生理鹽水10 mL/kg 10 min泵入；C組10只再灌注同時(shí)立即10 mL/kg氫氣腹腔一次注入；D組10只，再灌注同時(shí)立即耳靜脈10 min泵入10 mL/kg飽和氫鹽水。

1.3高純氫和飽和氫鹽水制備應(yīng)用TM型氫氣發(fā)生器(濟(jì)南駿銘分析儀器有限公司提供)，電解超純水產(chǎn)生純度為99.999%，將500 mL高純氫氣無死腔注入含有300 mL生理鹽水的鋁鉑袋中，放入0.4 kPa高壓艙壓溶6 h制備飽和氫鹽水，H2濃度為0.77 mmol/L～0.80 mmol/L消毒備用。

1.4主要檢測(cè)指標(biāo)和實(shí)驗(yàn)儀器腫瘤壞死因子a(TNF-α)Elisa試劑盒，武漢福爾生物科技股份公司(批號(hào)L150519248)；總超氧化物歧化酶(TSOD)試劑盒，南京建成生物工程研究所(批號(hào)20150514)；羥自由基(·OH)試劑盒，南京建成生物工程研究所(批號(hào)20150517)；丙二醛(MDA)，南京建成生物工程研究所(批號(hào)20150530)；細(xì)胞凋亡，Tunle檢測(cè)；電鏡，TECNAI-10荷蘭菲公司利浦；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，Specrroplus 3840美國(guó)MD公司。以上所有測(cè)試組織和血液標(biāo)本采集后均-80 ℃保存，并嚴(yán)格按說明書操作并記錄測(cè)定數(shù)據(jù)。

2　結(jié)　果

2.1各組觀察指標(biāo)比較A組、C組、D組TSOD、MDA與B組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05～P<0.001)，但A組、C組、D組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。A組、C組、D組TNF-α與B組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05～P<0.001)；C組與D組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明在對(duì)抗TNF-α的作用方面，腹腔氫氣優(yōu)于靜脈飽和氫鹽水。對(duì)羥自由基抑制作用：C組和D組對(duì)抗羥自由基作用最強(qiáng)，與B組相比，A組、C組、D組抑制羥自由基能力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05～P<0.001)，A組、C組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而A組與D組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。A組、C組、D組心肌凋亡與B組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05～P<0.001)；C組、D組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

表1　各組觀察指標(biāo)比較(±s)

2.2電鏡A組心肌細(xì)胞膜、線粒體和染色體結(jié)構(gòu)完整，未見溶酶體和自噬體，B組心肌細(xì)胞局部溶解、斷裂、線粒體嵴融合斷裂較重，形成空泡，核皺縮，溶酶體部分空泡化，數(shù)個(gè)自噬體形成；C組心肌細(xì)胞排列有序正常，線粒體結(jié)構(gòu)也較正常，細(xì)胞凋亡不明顯，也無自噬體形成，僅少量肌絲斷裂和線粒體破壞；D組肌絲和線粒體改變也較B組明顯減輕，也無明顯細(xì)胞凋亡和自噬體形成。

3　討　論

研究表明：缺血再灌注損傷可導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷炎性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，心肌微循環(huán)障礙及心功能障礙等嚴(yán)重后果，其發(fā)生發(fā)展與氧化應(yīng)激產(chǎn)生的活性氧自由基(reactive oxygen species)羥自由基、超氧化氮(ONOO)等活性最強(qiáng)的自由基密切相關(guān)。

近幾年來，眾多學(xué)者對(duì)氫的醫(yī)學(xué)研究涉及多學(xué)科和領(lǐng)域，提出氫的抗炎、抗過敏和抗凋亡作用，有研究報(bào)道不同給氫方式或量可產(chǎn)生不同的組織器官保護(hù)作用[2-5]，也有報(bào)道能產(chǎn)生相似保護(hù)作用?？傊?，氫醫(yī)學(xué)有益作用研究的結(jié)論差異可能有多種原因：作為萬能還原劑，氫可以改變大多數(shù)物質(zhì)結(jié)構(gòu)清除自由基，這種作用可能與劑量和失效相關(guān)[6-8]；給氫的途徑、劑量、時(shí)機(jī)和生物利用度，也是影響氫療效原因[9]。

本研究也從以下幾個(gè)方面證明了氫的清除自由基、抗炎和抗凋亡作用：①無論腹腔氫氣和靜脈飽和氫鹽水均能提高心肌超氧化物歧化酶(SOD)水平，這可能與氫直接中和或清除自由基減少SOD消耗相關(guān)，也是其抗炎、抗凋亡的主要原因；②H2對(duì)·OH自由基抑制作用和抗過氧化物作用也表明腹腔H2作用最強(qiáng)，飽和氫鹽水次之，這是由于氫直接清除自由基減少氧化應(yīng)激的直接證據(jù)；③TNF-α是炎癥指標(biāo)之一[10]，本研究測(cè)定數(shù)值也顯示腹腔氫氣和靜脈飽和氫鹽水明顯低于模型對(duì)照組，而且腹腔氫氣的值更低；④細(xì)胞凋亡和電鏡檢查結(jié)果也顯示氫氣具有減少細(xì)胞凋亡，保護(hù)心肌超微結(jié)構(gòu)的作用，這種抗凋亡和保護(hù)心肌作用與氫氣清除自由基、減少SOD消耗劑抗炎密切相關(guān)。

本研究證明：①腹腔氫氣和靜脈飽和氫鹽水均能發(fā)揮對(duì)抗自由基和抗凋亡等保護(hù)心肌作用，而且由于腹腔氫氣給予氫氣量相對(duì)多于靜脈法，其作用好于靜脈應(yīng)用；②腹腔氫氣方式方便可靠，與靜脈法相對(duì)比，對(duì)心血管血流動(dòng)力學(xué)影響較小，而且氫分子為質(zhì)量最輕很容易穿透細(xì)胞膜，擴(kuò)散到周圍的組織，不完全依賴血管系統(tǒng)，無論靜脈輸入、口服由于腹腔氫氣均能發(fā)揮抗自由基、抗炎和抗凋亡作用；③迄今為止，尚不清楚哪種給氫方式更好，因而探討對(duì)具體疾病或疾病模型的最佳給氫方式或劑量和作用機(jī)制是今后研究的主要方向。

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(本文編輯郭懷印)

1.海南省第二人民醫(yī)院(海南三亞 572200)；2.清華大學(xué)第一附屬醫(yī)院

劉云寶，E-mail：13701186952@sina.com

R542.2R256.2

A

10．3969/j．issn．1672-1349．2016．16．011

1672-1349(2016)16-1862-02

2016-05-13)