苦瓜水提物抗幽門(mén)螺桿菌作用及其浸提工藝研究

張孝林吳研祥陸　帆何培培

(1. 安徽科技學(xué)院食品藥品學(xué)院，安徽 鳳陽(yáng)　233100；2. 農(nóng)業(yè)部生物有機(jī)肥創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 蚌埠　233030)

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苦瓜水提物抗幽門(mén)螺桿菌作用及其浸提工藝研究

張孝林1,2吳研祥1陸帆1何培培1

(1. 安徽科技學(xué)院食品藥品學(xué)院，安徽 鳳陽(yáng)233100；2. 農(nóng)業(yè)部生物有機(jī)肥創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 蚌埠233030)

為研究苦瓜水提物對(duì)幽門(mén)螺桿菌的抑制作用，以紙片擴(kuò)散法的抑菌圈大小為指標(biāo)，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)優(yōu)化苦瓜水提物抗幽門(mén)螺桿菌活性的最佳浸提工藝，并進(jìn)一步探究苦瓜水提物的最小抑菌濃度(MIC)、最小殺菌濃度(MBC)和殺菌動(dòng)力學(xué)。結(jié)果表明：苦瓜水提物抗幽門(mén)螺桿菌的最佳浸提工藝為浸提溫度80 ℃、料液比1∶50(g/mL)、浸提時(shí)間1.5 h。MIC為32 mg/mL；MBC為128 mg/mL；在4倍MIC下殺菌動(dòng)力學(xué)時(shí)間為30 min。

苦瓜；水提物；幽門(mén)螺桿菌；抗菌

幽門(mén)螺桿菌(Helicobacterpylori, Hp)是一種廣泛定植于人胃中的微需氧革蘭氏陰性桿菌。世界上有50%以上的人被其感染,研究[1-2]證實(shí)幽門(mén)螺桿菌感染與慢性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍和胃癌的高發(fā)率密切相關(guān)。目前臨床上治療幽門(mén)螺桿菌主要方法有三聯(lián)或四聯(lián)療法即2種或3種抗生素結(jié)合1種質(zhì)子泵抑制劑或鉍劑。因胃環(huán)境的特殊性及胃的排空導(dǎo)致幽門(mén)螺桿菌治療用藥量大、療程長(zhǎng)、成本高、副作用大，致使病人依從性差，部分病人未達(dá)到完整的療程就停止服藥，另外，幽門(mén)螺桿菌對(duì)使用的抗生素易產(chǎn)生耐藥性，甚至出現(xiàn)了對(duì)6種抗生素的耐藥菌株[3]，幽門(mén)螺桿菌還容易重新感染。因此，根治幽門(mén)螺桿菌感染已成為醫(yī)學(xué)難題。中藥復(fù)方制劑治療幽門(mén)螺桿菌雖然具有很好的療效，但其成分不清、療程長(zhǎng)、服用不便且成本較西藥更高。

苦瓜(MomordicacharantiaL.)是一種藥食兩用植物，其提取物具有廣譜抗菌活性[4]，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性桿菌、球菌具有抑制作用，同時(shí)對(duì)革蘭氏陰性桿菌也具有較強(qiáng)的抑制效果。但目前還未見(jiàn)關(guān)于苦瓜提取物抗幽門(mén)螺桿菌的報(bào)道。

苦瓜的提取物抗菌活性與提取溶劑相關(guān)，張雅靜等[5]研究苦瓜不同溶劑提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草桿菌和大腸桿菌的抑菌效果時(shí)發(fā)現(xiàn)，苦瓜水提物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果最強(qiáng)，70%乙醇的提取物對(duì)枯草桿菌的抑菌效果最強(qiáng)，乙酸乙酯的提取物對(duì)大腸桿菌的抑菌效果最強(qiáng)。其他研究證實(shí)苦瓜含有多種抑菌物質(zhì)，包括苦瓜黃酮[6]、苦瓜皂苷[7-8]、苦瓜多糖[8-9]、苦瓜多酚[10]、苦瓜精油[11]和苦瓜蛋白[12-13]等活性成分。本研究采用水作為提取溶劑探究苦瓜提取物抗幽門(mén)螺桿菌活性。研究[14]證實(shí)苦瓜水提物的抗菌活性與浸提溫度、浸提時(shí)間和料液比有一定關(guān)系。本研究擬采用正交試驗(yàn)，以紙片法抑菌圈大小為指標(biāo)，研究苦瓜水提物抗幽門(mén)螺桿菌活性的最佳浸提工藝，以倍比稀釋法確定苦瓜水提物的最小抑菌濃度(MIC)和殺菌濃度(MBC)，以4倍MIC濃度的苦瓜水提物濃度檢測(cè)苦瓜水提物抗幽門(mén)螺桿菌的殺菌動(dòng)力學(xué)，旨在將苦瓜開(kāi)發(fā)為抗幽門(mén)螺桿菌同時(shí)具有保健功能的食品或飲品提供理論依據(jù)和技術(shù)方法。

1　材料與方法

1.1材料和試劑

苦瓜：鳳陽(yáng)華佗大藥房(經(jīng)安徽科技學(xué)院藥學(xué)系時(shí)維靜教授鑒定為正品)，在50 ℃烘箱干燥12 h后，用粉碎機(jī)粉碎后，過(guò)40目篩，4 ℃干燥保存?zhèn)溆茫?/p>

幽門(mén)螺桿菌液體培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基、培養(yǎng)劑(復(fù)合抗生素)：青島海博生物技術(shù)公司；

胎牛血清：上海生物工程有限公司；

無(wú)纖維綿羊血：鄭州九龍生物技術(shù)公司；

微需氧產(chǎn)氣袋(日本三菱瓦斯MGC)：上海寶曼生物科技有限公司。

1.2儀器

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE-3000型，上海亞榮生化儀器廠；

真空冷凍干燥機(jī)：ALPHA1-2 LD plus型，德國(guó)Martin Christ公司；

高壓蒸汽滅菌鍋：LDZX-30KBS型，三強(qiáng)醫(yī)療器械有限公司；

培養(yǎng)箱：SPX-8OB型，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；

恒溫水浴鍋：DK-8D型，上海一恒儀器有限公司；

超凈工作臺(tái)：SW-CJ-2FD型，蘇州凈化設(shè)備廠；

恒溫振蕩器：ZWYR-D2402型，上海志誠(chéng)儀器有限公司。

1.3供試菌種

幽門(mén)螺桿菌臨床株：安徽科技學(xué)院細(xì)胞與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中心保存。

1.4試驗(yàn)方法

1.4.1幽門(mén)螺桿菌培養(yǎng)及藥物抑菌試驗(yàn)培養(yǎng)基的配制按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。供試菌種接種于幽門(mén)螺桿菌液體培養(yǎng)基試管內(nèi)，在放有微需氧產(chǎn)氣袋的密閉培養(yǎng)罐中37 ℃震蕩培養(yǎng)36 h，將各菌種轉(zhuǎn)移至幽門(mén)螺桿菌固體培養(yǎng)基進(jìn)一步活化，用刮鏟刮下菌苔用生理鹽水制成0.5麥?zhǔn)瞎芗?xì)菌懸濁液，相當(dāng)于菌的濃度為108CFU/mL，在超凈工作臺(tái)上用無(wú)菌移液槍吸取100 μL菌液均勻涂到固體培養(yǎng)皿制成平板。同時(shí)把浸泡在藥液中的紙片小心貼在培養(yǎng)皿的適當(dāng)位置。在微需氧條件下37 ℃培養(yǎng)48 h，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈大小，每個(gè)抑菌圈從不同角度測(cè)量3次求平均值，單位為mm。

1.4.2單因素試驗(yàn)參照文獻(xiàn)[15]的方法分別從料液比、浸提溫度和浸提時(shí)間3個(gè)因素考察苦瓜浸提物的最佳單因素條件。

(1) 料液比考察：稱(chēng)取5份5 g苦瓜的粉碎物，分別以料液比1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60(g/mL)，在60 ℃水浴回流提取2次，每次2 h，將提取液合并后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，用真空冷凍干燥機(jī)冷凍干燥，稱(chēng)取適量水提物配制成100 mg/mL水溶液，分別用紙片法測(cè)抑菌圈大小，確定最佳料液比。

(2) 浸提溫度考察：稱(chēng)取5份5 g苦瓜的粉碎物，以料液比1∶40(g/mL)，分別在50，60，70，80，90 ℃水浴回流提取2次，每次2 h，按1.4.2(1)操作，分別用紙片法測(cè)抑菌圈大小，確定最佳提取溫度。

(3) 浸提時(shí)間考察：稱(chēng)取5份5 g苦瓜的粉碎物，分別以料液比1∶40(g/mL)，浸提溫度80 ℃，在1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h水浴回流提取2次，按1.4.2(1)操作，分別用紙片法測(cè)抑菌圈大小，確定最佳提取時(shí)間。

1.4.3正交試驗(yàn)優(yōu)化在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以水提物對(duì)幽門(mén)螺桿菌的抑菌圈大小為指標(biāo)，做料液比、浸提溫度和浸提時(shí)間的3因素3水平的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，并對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析驗(yàn)證，最終得出苦瓜水提物抗幽門(mén)螺桿菌活性的最佳浸提工藝條件。

1.4.4最小抑菌濃度和最小殺菌濃度試驗(yàn)取24支無(wú)菌的試管向每個(gè)試管加滅菌的幽門(mén)螺桿菌液體培養(yǎng)基1 mL，分成3組，每組8支試管，用倍比稀釋法，將苦瓜浸提物依次稀釋為最終藥液濃度分別為256，128，64，32，16，8，4，2 mg/mL。向每支1 mL含不同藥液濃度試管中加入108CFU/mL的幽門(mén)螺桿菌菌液10 μL保證每支試管含幽門(mén)螺桿菌數(shù)為106CFU/mL，按照1.4.1幽門(mén)螺桿菌的培養(yǎng)方法培養(yǎng)36 h，觀察試管渾濁狀態(tài)，出現(xiàn)渾濁前的試管中苦瓜浸提物的濃度即為最小抑菌濃度(MIC)。將取5 μL澄清試管中的培養(yǎng)物接種于固體培養(yǎng)基，在微需氧37 ℃培養(yǎng)36 h，無(wú)菌落出現(xiàn)前一試管中的苦瓜浸提物的濃度即為最小殺菌濃度(MBC)。

1.4.5殺菌動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)在4倍MIC濃度的苦瓜浸提物液體培養(yǎng)基中，加入幽門(mén)螺桿菌至菌數(shù)為106CFU/mL，充分混合后，采用在微需氧條件下，37 ℃，200 r/min震蕩培養(yǎng)，分別在5，20，30，45，60，90 min時(shí)取5 μL混合物(每個(gè)取3份)，至固體培養(yǎng)基在微需氧條件，37 ℃培養(yǎng)36 h，觀察和計(jì)算菌落生長(zhǎng)狀況。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1料液比對(duì)苦瓜水提物抗幽門(mén)螺桿菌活性的影響由圖1可知，起初，隨著溶劑量的增加，苦瓜水提物的抗幽門(mén)螺桿菌活性先增加，當(dāng)料液比達(dá)到1∶40(g/mL)后，苦瓜水提物抗幽門(mén)螺桿菌活性不再增加，考慮水提物的濃縮和干燥，溶劑量大會(huì)增加成本，因此，選擇料液比1∶40(g/mL)作為苦瓜最佳提取水平。

圖1　料液比對(duì)水提物抑菌活性的影響

2.1.2提取溫度對(duì)苦瓜水提物抗幽門(mén)螺桿菌活性的影響由圖2可知，起初，隨著溫度的增加苦瓜水提物的抗菌活性增加，到80 ℃達(dá)到最大，抑菌圈為8.8 mm，之后抑菌活性有所減小。說(shuō)明溫度過(guò)高時(shí)，苦瓜水提物的抗菌活性成分被破壞，因此，選擇80 ℃作為苦瓜最佳提取水平。

圖2　溫度對(duì)水提物抑菌活性的影響

2.1.3提取時(shí)間對(duì)苦瓜水提物抗幽門(mén)螺桿菌活性的影響由圖3可知，起初，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，苦瓜水提物的抗菌活性增加，1.5 h時(shí)達(dá)到最大，抑菌圈為9.0 mm，之后抗菌活性逐漸減小，可能是提取物長(zhǎng)時(shí)間處在較高的溫度下，抗菌活性物質(zhì)受到破壞，進(jìn)一步說(shuō)明苦瓜抗菌活性物質(zhì)存在熱不穩(wěn)定性，因此，選擇1.5 h為苦瓜最佳提取水平。

2.2正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)的3因素和3水平正交試驗(yàn)見(jiàn)表1。

由表2可知：浸提物對(duì)幽門(mén)螺桿菌抑制作用的影響順序?yàn)锳>C>B；最佳浸提條件組合是A2B3C2，即提取溫度80 ℃，料液比1∶50(g/mL)，浸提時(shí)間1.5 h。但A2B3C2條件不在正交試驗(yàn)表中，因此，在A2B3C2條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，其提取物對(duì)幽門(mén)螺桿菌的抑菌圈大小平均值為9.5 mm，大于正交試驗(yàn)表中的最大值9.3 mm，故苦瓜最佳浸提條件為A2B3C2。

圖3　時(shí)間對(duì)水提物抑菌活性的影響

水平A浸提溫度/℃B料液比(g/mL)C浸提時(shí)間/h1701︰301.02801︰401.53901︰502.0

表2　抑菌作用正交試驗(yàn)結(jié)果

2.3苦瓜浸提物對(duì)幽門(mén)螺桿菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度

苦瓜浸提物的最小抑菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)第5支試管開(kāi)始出現(xiàn)渾濁，說(shuō)明第4試管的藥物濃度為苦瓜提取物的最小抑菌濃度(32 mg/mL)。將前4支試管培養(yǎng)液接種于瓊脂培養(yǎng)基在微需氧，37 ℃培養(yǎng)36 h后觀察菌落生長(zhǎng)狀況，發(fā)現(xiàn)第3和第4支試管接種的培養(yǎng)基有菌落生長(zhǎng)，第1和第2支試管的無(wú)，說(shuō)明第2支試管的藥物濃度為最小殺菌濃度(128 mg/mL)。試驗(yàn)證明：苦瓜提取物對(duì)幽門(mén)螺桿菌不但有抑制作用，同時(shí)有殺滅作用。

2.4苦瓜浸提物對(duì)幽門(mén)螺桿菌的殺菌動(dòng)力學(xué)

用4倍MIC濃度即128 mg/mL濃度的苦瓜浸提物進(jìn)行殺菌動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在5 min和20 min取得的混合物培養(yǎng)基均有細(xì)菌菌落生長(zhǎng)，30 min及之后的混合物培養(yǎng)基均無(wú)細(xì)菌菌落生長(zhǎng)，證明在4倍MIC濃度下苦瓜浸提物的最小殺菌時(shí)間為30 min。說(shuō)明苦瓜浸提物有較好的殺菌動(dòng)力學(xué)效果。

3　結(jié)論

本研究證明苦瓜水提物具有抗幽門(mén)螺桿菌作用，但不同條件下的水提物對(duì)幽門(mén)螺桿菌的抑制活性存在差異。通過(guò)正交試驗(yàn)確定了苦瓜浸提物抗幽門(mén)螺桿菌活性的最佳浸提工藝為浸提溫度80 ℃，料液比1∶50(g/mL)，浸提時(shí)間1.5 h。本研究還發(fā)現(xiàn)苦瓜水提物的抗幽門(mén)螺桿菌活性與浸提溫度有較大關(guān)系，在80 ℃溫度下所得浸提物抗菌活性最強(qiáng)，浸提時(shí)間對(duì)浸提物的抗幽門(mén)螺桿菌活性也有一定的影響，高溫和浸提時(shí)間過(guò)長(zhǎng)對(duì)苦瓜抗菌活性成分都會(huì)造成破壞。

本研究還證明苦瓜在最佳浸提工藝條件下所得的苦瓜水提物對(duì)幽門(mén)螺桿菌具有抑制作用，最小抑菌濃度是32 mg/mL，這是一個(gè)比較低的抑菌濃度?？喙纤嵛镌诟邼舛葧r(shí)對(duì)幽門(mén)螺桿菌還具有殺滅作用，其殺菌濃度為128 mg/mL。同時(shí)在128 mg/mL濃度條件下進(jìn)行殺菌動(dòng)力學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)苦瓜水提物具有快速殺滅幽門(mén)螺桿菌作用，最小殺菌動(dòng)力學(xué)時(shí)間為30 min。這表明苦瓜水提物在胃中能快速殺滅幽門(mén)螺桿菌作用，因此，苦瓜水提物用于對(duì)幽門(mén)螺桿菌感染的防治具有重大的醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值。

本研究只研究了苦瓜的水提物抗幽門(mén)螺桿菌作用。不同的溶劑提取所得的苦瓜浸提物活性成分存在差異，其抑菌活性也存在差異性?？喙嫌貌煌娜軇┨崛r(shí)可以得到不同的抑菌成分，抑制幽門(mén)螺桿菌的活性會(huì)存在差異，用什么溶劑提取所得的提取物對(duì)幽門(mén)螺桿菌的抗菌活性最強(qiáng)有待進(jìn)一步研究。

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Anti-bacterial effects on helicobacter pylori of aqueous extracts from bitter melon and its ptimum extraction process

ZHANG Xiao-lin1WUYan-xiang1LUFan1HEPei-pei1

(1.CollegeofFoodandDrug,AnhuiScienceandTechnologyUniversity,Fengyang,Anhui233100,China;2.TheMinistryofAgricultureKeyLaboratoryofMicrobialOrganicFertilizer,Bengbu,Anhui233030,China)

In order to study the anti-Helicobacter pylori activities of aqueous extracts from bitter melon， the extraction processes were optimized by orthogonal array design with respect to inhibitory zone size of bacteria using paper disc diffusion method. The minimum inhibitory concentration (MIC), minimum bactericidal concentration (MBC) and bactericidal kinetics on aqueous extracts of bitter melon were further investigated. The results showed that the best anti-Helicobacter pylori effects of aqueous extracts from bitter melon were the water extraction condition with the temperature at 80 ℃，the ratio of material to liquid at 1∶50， for 1.5 h. Its MIC and MBC againstHelicobacterpyloriwere 32 mg/mL and 128 mg/mL, respectively. The kinetics of fourfold anti-bactericidal activity againstHelicobacterpylori was 30 min.

bitter melon; aqueous extracts;Helicobacterpylori; antibacterial

安徽省自然科學(xué)基金一般項(xiàng)目(編號(hào)：1308085MC43)；安徽省教育廳重點(diǎn)和重大項(xiàng)目(編號(hào)：KJ2013A078，KJ2016SD16)；安徽科技學(xué)院自然科學(xué)基金(編號(hào)：ZRC2014404)；安徽省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：AH201410879058)

張孝林(1968—)，安徽科技學(xué)院副教授，博士。

E-mail: zhangxiaolin8@126.com

2016—01—04

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.08.033