抑制α-葡萄糖苷酶活性的啤酒糟多肽的合成與表征

房郁雯 吳金鴻 王正武 甘　李 何家俊 陳珊珊 馬鴻承 史海明

(上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院食品科學(xué)與工程系，上?！?00240)

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抑制α-葡萄糖苷酶活性的啤酒糟多肽的合成與表征

房郁雯 吳金鴻 王正武 甘李 何家俊 陳珊珊 馬鴻承 史海明

(上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院食品科學(xué)與工程系，上海200240)

采用以Fmoc為保護(hù)基團(tuán)的固相合成法來合成啤酒糟多肽SS-5(序列：Ser-Pro-Asp-Arg-Ser)，以高效液相色譜(HPLC)技術(shù)對合成肽粗品進(jìn)行純化脫鹽，得到純度95%以上的樣品。合成肽SS-55對α-葡萄糖苷酶的抑制作用檢測結(jié)果表明，合成肽SS-5的活性受所含鹽離子濃度的影響，低濃度時抑制率較高。而圓二色譜和熒光猝滅試驗結(jié)果表明，合成肽SS-5與α-葡萄糖苷酶之間存在相互作用。說明可以通過固相合成法快速大量獲得對α-糖苷酶具有一定抑制作用的啤酒糟多肽SS-5。

固相合成；α-葡萄糖苷酶抑制劑；合成肽SS-5；相互作用；啤酒糖多肽

糖尿病是一種慢性代謝紊亂的疾病，分為1型糖尿病和2型糖尿病，主要表現(xiàn)為體內(nèi)糖代謝異常[1]。如果缺乏正確且及時的治療，糖尿病會引起很多并發(fā)癥，包括高血糖癥、糖尿病性酸中毒和糖尿病高滲性昏迷。嚴(yán)重的慢性并發(fā)癥還有心血管疾病、慢性腎衰竭和腎損傷[2]。因此，必須要有適當(dāng)、有效、及時的治療。比如，每天服用阿卡波糖、二甲雙胍等治療藥物來抑制餐后血糖的過度升高；適當(dāng)調(diào)整飲食、生活習(xí)慣和加強鍛煉，并通過控制血糖、保持健康體重和戒煙來達(dá)到這些目標(biāo)[1]。另外，通過食用含有α-葡萄糖苷酶抑制劑功效成分的功能性食品來抑制餐后高血糖也是重要的一種預(yù)防和治療的方式。α-葡萄糖苷酶抑制劑，是以延緩腸道碳水化合物吸收而達(dá)到治療糖尿病目的的一類口服降糖藥物[3]。其作用機制為：抑制劑抑制腸道的α-葡萄糖苷酶，減慢淀粉類分解為葡萄糖的速度，減緩葡萄糖的吸收，從而降低餐后高血糖[4]。α-葡萄糖苷酶抑制劑會降低餐后胰島素水平，但不會刺激β細(xì)胞使其分泌胰島素，這說明這種抑制劑可增加胰島素的敏感性。因此，α-葡萄糖苷酶抑制劑的應(yīng)用是治療糖尿病的可替代的選擇[5]。

目前在臨床上應(yīng)用的α-葡萄糖苷酶抑制劑主要是人工合成的化合物，例如阿卡波糖、伏格列波糖等，雖然有良好的降低餐后血糖的作用，但價格較高，且對腸胃有一定的副作用，比如腸胃氣脹(78%的病患)和腹瀉(14%的病患)。從天然產(chǎn)物中篩選出具有治療潛力的先導(dǎo)化合物的抑制劑，近年來成為了國內(nèi)外研究的熱點。新的研究發(fā)現(xiàn)α-葡萄糖苷酶抑制劑可來源于一些天然物質(zhì)，例如番石榴葉[6]、高粱[7]、發(fā)酵豆[8]等。多肽類生物活性物質(zhì)近年來也被發(fā)現(xiàn)有抑制作用。例如，Yu Zhi-peng等[9]證明了雞蛋白蛋白中提取分離得到的多肽可以抑制α-葡萄糖苷酶的活性；林鴻佳[10]16-28發(fā)現(xiàn)酶解后得到的啤酒糟多肽具有抑制α-葡萄糖苷酶作用。崔潔等[11]對山杏整仁進(jìn)行酶解的得率為26.43%，之后進(jìn)行超濾、凝膠層析等步驟獲得了具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的多肽，產(chǎn)物最高抑制率為11.52%。這種通過酶解方法從天然產(chǎn)物中得到生物活性肽的提取分離步驟繁瑣，活性成分得率和純度低，難以實現(xiàn)工業(yè)化推廣應(yīng)用。而通過生物或化學(xué)合成方法制備的生物活性肽易于純化，可實現(xiàn)自動化生產(chǎn)，是提高生物活性肽產(chǎn)率和擴(kuò)寬其應(yīng)用價值的有效新方法。目前合成肽在生物制劑上的應(yīng)用非常廣泛，比如口蹄疫合成肽疫苗[12]、急性心肌梗塞診斷[13]、乙型肝炎抗體制備[14]等中的應(yīng)用。

鑒此，本試驗依據(jù)林鴻佳[10]43-44報道的具有抑制α-葡萄糖苷酶作用的啤酒糟多肽的序列：Ser-Pro-Asp-Arg-Ser，應(yīng)用Fmoc固相合成法來合成啤酒糟多肽SS-5，并測定其α-葡萄糖苷酶抑制作用，探討將食源性具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的生物活性肽作為一種膳食補充劑或者生物制劑進(jìn)行開發(fā)的可行性和存在的問題，為其開發(fā)應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1試驗試劑

α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.20)：19.3 U/mg，來源釀酒酵母，美國Sigma-Aldrich 公司；

對硝基苯-α-D-葡萄吡喃糖苷(pNPG)：美國Sigma-Aldrich 公司；

其它試劑：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2主要儀器設(shè)備

離子色譜儀：883 Basic IC plus型，瑞士Metrohm公司；

元素分析儀：Vario MICRO cube型，德國Elementar公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：R-205型，瑞士Buchi公司；

冷凍干燥機：FreeZone型，美國Labconco公司；

紫外分光光度計：UV-2802S型，上海尤尼科公司；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH-S型，江蘇金壇市岸頭國瑞實驗儀器廠；

冰箱：BCD-189JB-S型，上海夏普公司；

旋渦混勻器：MS3基本型，上海川翔生物科技有限公司；

pH計：Delta320型，METTLER-TOLEDO儀器(上海)有限公司；

電子分析天平：ME104E型，METTLER-TOLEDO儀器(上海)有限公司；

熒光分光光度計：QM/TM/IM型，美國PTI公司；

圓二色光譜儀：JASCO J-815型，日本分光株式會社。

1.2方法

1.2.1啤酒糟多肽SS-5的合成多肽的固相合成是一個從C端(羧基端)向N端(氨基端)重復(fù)添加氨基酸的過程。為了防止副反應(yīng)的發(fā)生，參加反應(yīng)的氨基酸的側(cè)鏈都是被9-芴甲氧羰基(Fmoc)保護(hù)的，F(xiàn)moc在堿性條件下10 min即可完全脫除；而游離的C端在反應(yīng)之前必須活化[15]。啤酒糟多肽SS-5固相合成的簡單過程：首先在固相載體(氯甲基聚苯乙烯樹脂)上共價連接一個氨基被封閉基團(tuán)(Fmoc)保護(hù)的氨基酸，在三氟乙酸(TFA)的作用下脫掉α-氨基的保護(hù)基Fmoc，這樣第一個氨基酸就連接到固相載體上了；然后用N,N’-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC，Dicyclohexylcarbodiimide)來活化第二個氨基酸的羧基，第二個氨基酸的羧基再與第一個氨基酸的氨基反應(yīng)形成肽鍵，從而在固相載體上形成了一個二肽；不斷重復(fù)上述形成肽鍵的反應(yīng)，使得肽鏈從羧基端向氨基端增長，直至達(dá)到的肽鏈長度符合要求；最后脫去保護(hù)基Fmoc，并用氫氟酸(HF)來水解固相載體和肽鏈之間的酯鍵，最終得到合成肽SS-5[16]。

1.2.2合成肽SS-5的純化將合成的多肽SS-5用高效液相色譜法進(jìn)行分離純化。色譜柱為制備型反相C18柱(30 mm×250 mm)，配紫外檢測器；樣品濃度50 mg/mL，流速30 mL/min，紫外檢測波長220 nm；流動相：A為100%乙腈，B為100%超純水；梯度洗脫條件：0～20 min，14% A～39% A；20.0～20.1 min，39%～80% A；20.1～60.0 min，80% A。先用2%醋酸平衡，用進(jìn)樣閥進(jìn)收集的餾分，用純水平衡，然后2%醋酸銨平衡，再純水平衡，用醋酸沖20 min(30%～80%)，再收集餾分得粗肽樣品。

將粗肽樣品在HPLC上檢驗純度，色譜柱為Kromasil C18-5(4.6 mm×250 mm)；上樣量10 μL，流速1.0 mL/min，檢測波長220 nm；流動相：A為含0.01%三氟乙酸的乙腈溶液，B為含0.01%三氟乙酸的超純水溶液；梯度洗脫條件：0.01～25.00 min，1%～26% A；25.0～25.1 min，26%～100% A；25.1～30.0 min，100% A。純度合格的樣品進(jìn)行冷凍干燥。

1.2.3合成肽SS-5的離子色譜分析與元素分析合成離子分析參考JY/T 020—1996《離子色譜分析方法通則》，元素分析參考JY/T 017—1996《元素分析儀方法通則》，檢測目標(biāo)為醋酸根、三氟乙酸根、氮、碳及氫含量。

1.2.4合成肽SS-5體外α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定參考文獻(xiàn)[17]做部分修改，α-葡萄糖苷酶催化pNPG水解產(chǎn)生對硝基苯酚，并在405 nm處有特征吸收，因此用紫外分光光度計測定在405 nm 處的紫外吸收。

在37 ℃、pH 6.8的磷酸鹽(50 mmol/L)緩沖體系中，α-葡萄糖苷酶(0.175 U/mL)和不同濃度的啤酒糟多肽SS-5培養(yǎng)30 min，之后加入pNPG (10 mmol/L)作為底物反應(yīng)30 min，最后加入250 mmol/L的Na2CO3來終止反應(yīng)，在405 nm處測定吸光值。樣品對α-葡萄糖苷酶活性的抑制率按式(1)計算：

(1)

式中：

R——抑制率，%；

A對照——對照組的紫外吸光度值，

A樣品——不同濃度抑制劑組的紫外吸光度值。

1.2.5圓二色譜測定α-葡萄糖苷酶與啤酒糟多肽SS-5混合體系的圓二色譜在200～250 nm波長范圍內(nèi)測量?；旌?.4 U/mL的α-葡萄糖苷酶和5 mg/mL的多肽SS-5在37 ℃下進(jìn)行掃描，掃描速度50 nm/min，響應(yīng)時間1 s，狹縫寬度1 nm。每個光譜是3次連續(xù)掃描的平均值，試驗開始用2.5 mmol/L的PBS掃基線。

1.2.6合成肽SS-5對α-葡萄糖苷酶的熒光猝滅作用在熒光猝滅試驗中，50 mmol/L、pH 6.8 的PBS緩沖溶液作為空白對照。試驗組將1.4 mL 0.5 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液分別與0.7 mL濃度為1.786，0.893，0.446，0.179，0.089 mmol/L的樣品溶液混合后進(jìn)行熒光掃描。設(shè)置溫度37 ℃，電壓參數(shù)為400 V，狹縫寬度為5 nm，掃描速度為240 nm/min，以280 nm 為激發(fā)波長，記錄300～400 nm波長范圍內(nèi)的發(fā)射光譜。

2　結(jié)果與分析

2.1合成肽SS-5序列與性質(zhì)

對合成肽SS-5進(jìn)行序列及性質(zhì)分析的結(jié)果見表1和圖1。這是一個氨基酸序列為Ser-Pro-Asp-Arg-Ser的五肽，分子量為560.56，等電點pI為7.4。平均親水性為1.3，說明合成肽SS-5為疏水蛋白，而親水殘基的比例為80%。這些性質(zhì)都為之后的合成肽SS-5純化提供了依據(jù)。

2.2合成肽的鑒定

粗肽樣品經(jīng)過進(jìn)一步純化，在洗脫時間10.313 min處出現(xiàn)一個色譜分離峰(見圖2)，由表1積分面積計算，相對含量達(dá)到98.4%，說明純度已達(dá)到95%以上。由圖3可知，啤酒糟多肽SS-5的分子離子峰為561.58，因此相對分子量為560.58，證實合成的多肽為啤酒糟多肽SS-5。收集該分離峰處合成肽SS-5純化樣品，冷凍干燥，置于冰箱內(nèi)保存。

2.3合成肽SS-5的離子色譜分析與元素分析

由圖4和表3可知，合成肽SS-5中含鹽量為12.3%。實際肽含量的確定是由檢測的N含量除以理論N含量得到。合成肽SS-5的分子式是C28H44N6O6，其分子量為560.70，則理論N含量為：14×6÷560.70=0.149 8，則肽含量為0.121 1÷0.149 8= 80.84%。

表1　合成肽SS-5序列與性質(zhì)

圖1　合成肽SS-5性質(zhì)

圖2　合成肽SS-5反相高效液相色譜圖

Figure 2Reversed-phase high-performance liquid chromatography of synthetic peptide SS-5

表2　合成肽SS-5反相高效液相色譜分析結(jié)果

圖3　合成肽SS-5質(zhì)譜分析結(jié)果

圖4　合成肽SS-5離子色譜圖

峰序列號保留時間/min面積/(μS·cm-1·min)高度/(μS·cm-1)濃度/(mg·L-1)組分名稱13.8270.23271.00712.092醋酸根 27.4250.10280.2672.373三氟乙酸根

表4　合成肽SS-5鹽及元素含量

2.4合成肽SS-5對α-糖苷酶活性抑制的分析結(jié)果

通過分光光度法測定的酶抑制劑活性分析結(jié)果見表5。由表5可知，合成肽的活性受含鹽離子濃度的影響，在低濃度時表現(xiàn)出一定的α-葡萄糖苷酶抑制活性。隨著樣品濃度降低，即鹽離子相對濃度降低，合成肽SS-5對α-葡萄糖苷酶抑制活性增強，當(dāng)合成肽SS-5濃度為0.5 mg/mL時抑制率達(dá)到8.43%。說明應(yīng)用分光光度法檢測合成肽抑制活性時需要對合成肽進(jìn)行進(jìn)一步脫鹽處理。

2.5圓二色譜(CD)檢測結(jié)果

蛋白質(zhì)主鏈的構(gòu)象信息可以通過遠(yuǎn)紫外區(qū)的圓二色光譜(CD)來反映，因此通過測定α-葡萄糖苷酶二級結(jié)構(gòu)的變化可以來定性分析其結(jié)構(gòu)變化。α-葡萄糖苷酶與合成肽SS-5相互作用前后的CD譜圖見圖5。由圖5可知，α-葡萄糖苷酶的CD光譜有兩個明顯的峰分別在209，222 nm處，這是蛋白質(zhì)α-螺旋結(jié)構(gòu)的特征峰[17-18]。而合成肽SS-5的加入，使得α-葡萄糖苷酶在209，222 nm處的CD光譜強度顯著降低(向零水平移動)，說明α-葡萄糖苷酶的α-螺旋結(jié)構(gòu)含量減少，合成肽SS-5與α-葡萄糖苷酶相互作用后改變了α-葡萄糖苷酶的空間結(jié)構(gòu)特征，從而對酶的活性產(chǎn)生抑制作用。

表5合成肽SS-5對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

Table 5The inhibition activity of synthetic peptide SS-5 onα-glucosidase

SS-5濃度/(mg·mL-1)吸光度平均值抑制率/%5.03.921±0.04902.52.887±0.00801.02.692±0.0123.270.52.554±0.0638.21對照組2.783±0.021—

a. α-糖苷酶+合成肽SS-5　b. α-糖苷酶

Figure 5CD spectra ofα-glucosidase with or without synthetic peptide SS-5

2.6合成肽SS-5對α-葡萄糖苷酶的熒光猝滅作用

酶蛋白內(nèi)源性熒光產(chǎn)生的主要原因是酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸這3種氨基酸殘基[19]。在激發(fā)波長280 nm，掃描波長范圍300～400 nm的條件下，得到酪氨酸和色氨酸共同的熒光發(fā)射光譜，可以通過分析探討熒光光譜的強度及峰位等來推測酶蛋白與其他分子相互作用后的構(gòu)象變化[10]49。合成肽SS-5與α-葡萄糖苷酶相互作用的熒光光譜圖見圖6。由圖6可知，加入合成肽SS-5后α-葡萄糖苷酶的內(nèi)源性熒光發(fā)生猝滅。隨著合成肽SS-5的濃度增加，α-葡萄糖苷酶在334 nm處的熒光強度逐漸下降，表明兩者之間存在相互作用。而且，其熒光發(fā)射峰沒有發(fā)生明顯的紅移或藍(lán)移現(xiàn)象，保持位置一致，說明合成肽SS-5沒有改變α-葡萄糖苷酶中酪氨酸和色氨酸所處微環(huán)境的極性。

3　結(jié)論

采用Fmoc固相合成法來合成啤酒糟多肽SS-5，并采用高效液相色譜法對合成的多肽SS-5進(jìn)行純化，并最終得到純度達(dá)到95%以上的多肽。在應(yīng)用分光光度法進(jìn)行合成肽SS-5對α-葡萄糖苷酶活性抑制活性的分析試驗中發(fā)現(xiàn)0.5 mg/mL的合成肽SS-5對α-糖苷酶的抑制率達(dá)到8.43%，隨著濃度提高，活性反而降低。經(jīng)過離子色譜和元素分析，合成肽SS-5中含有12.3%鹽，可能是造成合成肽檢測出的抑制率不高的原因之一。圓二色譜和熒光光譜分析結(jié)果證明，α-葡萄糖苷酶與合成肽SS-5之間存在著相互作用，證實通過合成方法可以制備得到具有α-葡萄糖苷酶活性抑制的生物活性肽。但進(jìn)一步研究還需要對合成肽進(jìn)行脫鹽或轉(zhuǎn)鹽(磷酸鹽)處理，以增強其抑制活性，提高其應(yīng)用價值。

a～e. 濃度分別為0.00，0.05，0.10，0.50，1.00 mg/mL的合成肽SS-5

Figure 6Interaction between SS-5 with various concentrations andα-glucosidase investigated by fluore-scence spectra

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Synthesis and characterization of brewer’s grains peptide with α-glucosidase inhibitory activity

FANG Yu-wenWUJin-hongWANGZheng-wuGANLiHEJia-junCHENShan-shanMAHong-chengSHIHai-ming

(FoodScienceandEngineering,SchoolofAgricultureandBiology,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200240,China)

Brewer’s grains peptide SS-5(sequence: Ser-Pro-Asp-Arg-Ser) was synthesized by solid-phase synthesis with Fmoc protect group. Then the crude synthetic peptide was purified and desalted by HPLC, and as a result the purity was over 95%. The inhibitory activity of synthetic peptide SS-5 toα-glucosidase was detected, and the results showed that it was influenced by salt ionic concentration and the lower concentration presented higher inhibility. Furthermore, the interaction between synthetic peptide SS-5 andα-glucosidase was confirmed by circular dichroism spectrum(CD) and fluorescence quenching assays.. Therefore, a fast method of obtaining brewer’s grains peptide SS-5 withα-glucosidase inhibitory activity in quantity was proposed in this paper.

solid-phase synthesis; alpha-glucosidase inhibitor; synthetic peptide SS-5; interaction

國家863計劃課題(編號：2013AA102207)；國家自然科學(xué)基金項目(編號：31471623，21276154)；國家重點研發(fā)計劃專項課題(編號：2016YFD0400206)

房郁雯，女，上海交通大學(xué)在讀碩士研究生。

王正武(1961—)，男，上海交通大學(xué)教授，博士。

E-mail: zhengwuwang@sjtu.edu.cn

2016-05-09

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.08.001

吳金鴻(1978—)，女，上海交通大學(xué)副研究員，博士。

E-mail: wujinhong@sjtu.edu.cn