清肝祛濕活血方對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠Srebp-1c表達(dá)的影響*

張玉香，王一強(qiáng)，姜德民，史曉偉，王俊喹甘肅省中醫(yī)學(xué)校，甘肅 蘭州 70050；2甘肅省中醫(yī)院；西和縣中醫(yī)醫(yī)院

清肝祛濕活血方對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠Srebp-1c表達(dá)的影響*

張玉香1，王一強(qiáng)1，姜德民1，史曉偉2△，王俊喹3
1甘肅省中醫(yī)學(xué)校，甘肅 蘭州 730050；2甘肅省中醫(yī)院；3西和縣中醫(yī)醫(yī)院

目的：探討清肝祛濕活血方對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠肝臟固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c（Srebp-1c）表達(dá)的影響。方法：將雄性SD大鼠隨機(jī)分為空白組，模型組，多烯磷脂酰膽堿組，清肝祛濕活血方低、中、高劑量組6組。常規(guī)飼養(yǎng)7天后，空白組給予普通飼料喂養(yǎng)；其余各組給予高脂飼料喂養(yǎng)+腹腔注射四環(huán)素制備非酒精性脂肪肝大鼠模型，共4周。造模成功后清肝祛濕活血方各劑量組用清肝祛濕活血方治療，多烯磷脂酰膽堿組予易善復(fù)治療，模型組和空白組給予等量蒸餾水。給藥4周后觀(guān)察大鼠血脂、肝組織病理學(xué)改變及Western Blot法測(cè)定肝臟Srebp-1c表達(dá)。結(jié)果：與模型組比較，清肝祛濕活血方低、中、高劑量組TG和TC明顯降低（P＜0.05）；肝脂肪變性明顯減輕；肝臟Srebp-1c表達(dá)均明顯下降（P＜0.01）。結(jié)論：清肝祛濕活血方能下調(diào)大鼠肝臟Srebp-1c表達(dá)，對(duì)非酒精性脂肪肝有較好的治療作用。

非酒精性脂肪肝；清肝；祛濕；活血；Srebp-1c

非酒精性脂肪肝(non alcohol ic fatty l iver disease，NAFLD)是以肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞脂肪變性和脂肪堆積為主要病理特征，但無(wú)過(guò)量飲酒史的一種肝病綜合征［1］。目前已成為僅次于病毒性肝炎的第二大肝?。?］，被公認(rèn)為隱蔽性肝硬化的常見(jiàn)原因。研究表明［3-4］固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c (Srebp-1c)主要參與調(diào)節(jié)肝臟中脂肪酸和甘油三酯的合成，并參與非酒精性脂肪肝的發(fā)生發(fā)展［5］。但是目前尚缺少減少脂肪堆積的藥物，前期臨床觀(guān)察發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)孛t(yī)王俊喹自擬清肝祛濕活血方對(duì)ANFLD有較好的治療作用，但作用機(jī)制不明確。本研究采用清肝祛濕活血方干預(yù)高脂飲食誘發(fā)NAFLD大鼠模型，觀(guān)察大鼠肝臟組織SREBP-1c表達(dá)、血脂及病理改變，探討清肝祛濕活血方對(duì)NAFLD保護(hù)機(jī)制。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物選取同批雄性SD大鼠90只，清潔級(jí)，體質(zhì)量(150±20)g，購(gòu)自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXKG桂2009-0002。實(shí)驗(yàn)前將動(dòng)物置于室內(nèi)適應(yīng)環(huán)境1周，室溫18～20℃，標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食，飲用自來(lái)水。1.2藥物清肝祛濕活血方中藥煎劑(夏枯草10 g，密蒙花10g，青葙子10 g，茵陳10 g，垂盆草10 g，丹參15 g，郁金10 g)由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室制備。多烯磷脂酰膽堿(易善復(fù)，北京安萬(wàn)特制藥有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字J20050028，規(guī)格228mg/粒)。

1.3試劑大鼠固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1C (Srebp-1c，批號(hào)：201508）、總膽固醇(TC，批號(hào)：201509)、甘油三酯(TG，批號(hào)：201509)檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.4儀器TOSHIBATBA－120FR全自動(dòng)生化分析儀(日本東芝公司)；OHAUS1/1000型電子天平(美國(guó)BECKANCOULTER公司)；IX71-22FL/PH倒置熒光顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；HH-S型數(shù)顯恒溫水浴箱(江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠(chǎng))；LKB-Ⅲ型超薄切片機(jī)切片(瑞典LKB公司)；5417R低溫高速離心機(jī)(德國(guó)EPPENDORF公司)；TC-120智能程控生物組織自動(dòng)脫水機(jī) (湖北省孝感市泰維電子設(shè)備有限公司生產(chǎn))。

1.5方法

1.5.1實(shí)驗(yàn)分組與造模將90只SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為6組：空白組，模型組，多烯磷脂酰膽堿組，清肝祛濕活血方低、中、高劑量組，(以下分別簡(jiǎn)稱(chēng)：空白組，模型組，易善復(fù)組，低劑量組，中劑量組，高劑量組)，每組15只。常規(guī)飼養(yǎng)7天后，空白組給予普通飼料喂養(yǎng)60天；其余各組按照聶文山等［5］的造模方法，予高脂飼料(84%基礎(chǔ)飼料+10%豬油+5%蛋黃粉+1%膽固醇)，并于制模后腹腔注射四環(huán)素150mg/kg，以后每6天腹腔注射1次四環(huán)素100mg/kg，共計(jì)6次，并于實(shí)驗(yàn)前(0d）和制模后第6、12、18、24、30天測(cè)量大鼠體質(zhì)量，并根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整給藥量，第30天造模成功(已經(jīng)通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)，病理切片顯示此造模方法成功)。

1.5.2給藥方法造模結(jié)束后，即第31天開(kāi)始，參照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》中［6］人與大鼠劑量的換算方法計(jì)算出大鼠用藥量是成人劑量的9倍。算出大鼠的對(duì)應(yīng)給藥量。即清肝祛濕活血方低劑量組給予5.63g生藥/kg、中劑量組給予11.25 g生藥/kg、高劑量組給予22.5 g生藥/kg，易善復(fù)組參照文獻(xiàn)［7］給予550mg/(kg·d)。使用時(shí)，按照大鼠灌藥容積20mL/kg計(jì)算，用蒸餾水將清肝祛濕活血方煎劑配成小劑量組0.28 g/mL、中劑量組0.56 g/mL、大劑量組1.13 g/mL，造模成功后大鼠平均體質(zhì)量按200 g/只計(jì)算，各組大鼠每次每只灌胃4mL，1次/d。空白組與模型組給予蒸餾水代替，灌胃量4mL/d，1次/d。各組連續(xù)給藥30天。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中觀(guān)察比較各組大鼠的一般情況。

1.6指標(biāo)采集與檢測(cè)

1.6.1大鼠固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c（Srebp-1c）檢測(cè)取100mg肝臟組織，提取肝臟組織總蛋白，每個(gè)樣品取等量蛋白50μg，將12%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜。5%BSA室溫下封閉2小時(shí)，加入小鼠抗大鼠SPEBP-1c(稀釋比例1∶500）、小鼠抗大鼠β-actin(稀釋比例∶1000)一抗，4℃孵育過(guò)夜。洗膜后辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗羊抗兔IgG或羊抗小鼠IgG(稀釋比例1∶5000)，室溫孵育2小時(shí)。TBST洗膜后加ECT試劑，顯影成像。用美國(guó)UVP公司Lab Works 4.5軟件對(duì)Western blot條帶進(jìn)行定量分析。

1.6.2血清生化指標(biāo)的檢測(cè)沿大鼠腹中線(xiàn)迅速剪開(kāi)腹腔，用10mL注射器無(wú)菌采取腹主動(dòng)脈血8mL，常規(guī)分離血清，-20℃凍存?zhèn)錅y(cè)，用于測(cè)定TC、TG。

1.6.3肝臟組織學(xué)觀(guān)察各組大鼠15只，留取肝左葉同一部位新鮮肝組織，清洗后置于10%中性甲醛固定，HE染色，送病理檢查作組織切片。病理改變?cè)u(píng)分參考文獻(xiàn)［8］：脂肪變性評(píng)分：0(無(wú))，1(肝細(xì)胞含脂滴小于25%)，2(肝細(xì)胞含脂滴26%～50%)，3(肝細(xì)胞含脂滴51%～75%)，4(肝細(xì)胞含脂滴大于75%)。根據(jù)匯管區(qū)、肝葉內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度評(píng)分炎癥：0(無(wú))，1(輕微)，2(輕度)，3(中度)，4(重度)。壞死評(píng)分：0(無(wú))，1(輕微)，2(輕度)，3(中度)，4(重度)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行處理，計(jì)量資料以(χ±s)表示，采用單因素方差分析和Newman-Keuls檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

各組大鼠進(jìn)食、進(jìn)水良好，精神度好，清肝祛濕活血方各組灌胃反應(yīng)較強(qiáng)烈，經(jīng)解剖觀(guān)察食管破裂及肺部感染導(dǎo)致8只死亡(其中低劑量組和中劑量組各2只，高劑量組4只)；易善復(fù)組1只死亡，經(jīng)解剖發(fā)現(xiàn)為尿路梗阻。最終81只大鼠采集到實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2.1各組大鼠肝臟組織病理形態(tài)變化與評(píng)分變化空白組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞索清楚，細(xì)胞核位于細(xì)胞中央,胞質(zhì)豐富，肝竇排列規(guī)則，匯管區(qū)清晰，見(jiàn)圖1A。模型組肝小葉結(jié)構(gòu)明顯紊亂，肝細(xì)胞索消失，肝竇消失，出現(xiàn)彌漫性肝細(xì)胞空泡樣變性,肝細(xì)胞變大，胞質(zhì)內(nèi)充滿(mǎn)脂滴，小葉內(nèi)見(jiàn)局灶性肝細(xì)胞壞死，有明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，見(jiàn)圖1B。易善復(fù)組、低劑量組和中劑量組脂變程度較模型組減輕，空泡樣變肝細(xì)胞較模型組數(shù)目明顯減少，胞漿內(nèi)僅見(jiàn)少量脂肪滴，小葉內(nèi)局灶性肝細(xì)胞壞死，少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，見(jiàn)圖1C、1D、1E。高劑量組脂變程度較模型組明顯減輕，肝小葉結(jié)構(gòu)基本完整，肝索排列清楚，空泡樣變肝細(xì)胞明顯消失，胞漿內(nèi)脂肪滴明顯減少，小葉內(nèi)極少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，見(jiàn)圖1F。病理改變?cè)u(píng)分見(jiàn)表1。

圖1　各組大鼠肝組織病理切片（HE×400）

表1　各組大鼠肝臟組織病理改變?cè)u(píng)分

2.2各組大鼠TG、TC及Srebp-1c變化與空白組比較，非酒精性脂肪肝大鼠TG、TC、Srebp-1c提高(P＜0.01)；與模型組比較，清肝祛濕活血方各劑量組TG、TC、Srebp-1c降低(P＜0.05)，高劑量組降低最顯著(P＜0.01)，見(jiàn)表2。

表2　各組大鼠TG、TC和Srebp-1c變化比較

3　討論

NAFLD主要是由于肥胖、糖尿病、高脂血癥、胰島素抵抗等臨床病癥累及肝臟引起病理學(xué)改變而造成［9］。其中關(guān)鍵影響因素之一是血漿游離脂肪酸(f ree fat ty acid，F(xiàn)FA)及甘油三酯(t riglyceride，TG)合成顯著增加。SREBP-1c屬于固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(sterol regulatory element binding proteins，SREBPs)的一個(gè)亞型，主要參與脂肪酸代謝和糖代謝，是脂肪合成基因的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。高脂飲食引起sREBP-1c表達(dá)增強(qiáng)，最初是一種適應(yīng)性反應(yīng)，隨著Srebp-1c表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)，導(dǎo)致脂肪酸代謝失衡，TG合成增多，與NAFLD的發(fā)生關(guān)系密切［9-10］。本研究顯示模型組SD大鼠通過(guò)高脂飼料喂養(yǎng)，腹腔注射四環(huán)素后Srebp-1c、TG、TC較空白組明顯升高；其肝臟病理切片可見(jiàn)肝小葉結(jié)構(gòu)明顯紊亂，肝細(xì)胞索消失，肝竇消失，出現(xiàn)彌漫性肝細(xì)胞空泡樣變性，肝細(xì)胞變大，胞質(zhì)內(nèi)充滿(mǎn)脂滴，小葉內(nèi)見(jiàn)局灶性肝細(xì)胞壞死，有明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。證實(shí)上述實(shí)驗(yàn)造模成功。

Srebp-1c主要參與糖脂代謝，其高表達(dá)導(dǎo)致肝臟脂代謝異常，形成“初次打擊”［11］；脂肪組織炎癥是NAFLD發(fā)展的因素和病理表現(xiàn)［12-13］，且最終導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生［14］，形成“二次打擊”［11］。本研究結(jié)果表明，與模型組比較，清肝祛濕活血方各劑量組均能夠明顯降低NAFLD大鼠Srebp-1c、TG、TC水平，減輕脂肪組織炎癥，從而減少胞質(zhì)內(nèi)脂肪滴沉積，減少細(xì)胞變性，達(dá)到保護(hù)肝細(xì)胞、治療NAFLD的效果。

中醫(yī)認(rèn)為NAFLD屬于“痰證”“濁毒”“積證”“脅痛”“肥氣”等范疇?；静C(jī)為肝熱脾虛，痰濕瘀結(jié)［14-15］。其病位主要在肝，當(dāng)?shù)孛t(yī)王俊喹四診合參，并結(jié)合現(xiàn)代人群飲食習(xí)慣，認(rèn)為NAFLD主要為肝經(jīng)濕熱瘀阻所致，今人工作、生活壓力大導(dǎo)致肝氣郁結(jié)，久郁化熱，又兼嗜食肥甘厚膩而少動(dòng)致脾虛濕盛，中焦氣機(jī)失調(diào)，濕與熱結(jié)，郁于肝經(jīng)，經(jīng)絡(luò)不通化為瘀血，發(fā)為NAFLD，故治療當(dāng)清肝祛濕，活血通絡(luò)，依法自擬清肝祛濕活血方。方中夏枯草清肝涼血、垂盆草清利肝膽濕熱、郁金疏肝活血，共為君藥；密蒙花、青葙子助夏枯草清肝涼血；茵陳助垂盆草清肝膽濕熱；丹參助郁金涼血活血、且養(yǎng)心安神，共為臣藥；干姜溫中散寒、燥濕化痰，防寒涼傷胃，為佐藥。諸藥合用共奏清利肝膽濕熱，活血化瘀散結(jié)，溫中燥濕化痰之功?，F(xiàn)代藥理研究表明［16］夏枯草含有三萜類(lèi)、甾醇類(lèi)等成分，有降血壓、降血脂、降血糖、抗氧化、抗自由基等作用，另外夏枯草還有調(diào)節(jié)內(nèi)分泌的功能；垂盆草［17］具有保肝、免疫調(diào)節(jié)等作用；郁金［18］具有抗氧化、抗炎、抗血小板聚集的作用。

本研究表明清肝祛濕活血通過(guò)減少NAFLD大鼠肝臟組織Srebp-1c蛋白表達(dá)，降低TG、TC，改善血脂代謝，同時(shí)此方還能夠減輕脂肪組織炎癥，減少胞質(zhì)內(nèi)脂肪滴沉積，減少細(xì)胞變性，對(duì)NAFLD有較好的治療作用。有研究表明［10］非酒精性脂肪肝大鼠Srebp-1c的mRNA表達(dá)變化先于肝臟組織學(xué)改變，本方是否通過(guò)減少肝臟組織Srebp-1c蛋白的表達(dá)改善肝臟組織學(xué)改變有待進(jìn)一步研究。

［1］ 陳少東，李紅山，馮琴，等.脂肪肝中醫(yī)證型分類(lèi)的文獻(xiàn)分析［J］.中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志，2006，16（4）：255-257.

［2］ 王吉耀.脂肪肝臨床流行病學(xué)［J］.中華肝臟病雜志，2000，8（2）：115-117.

［3］ Yamamoto T，Watanabe K，Inoue N，et al.Protein kinase Cbeta mediates hepatic induction of sterol-regulatoryelement binding protein-1cbyinsul in［J］.J Lipid Res，2010，51（7）：1859-1870.

［4］ Yahgi N，Shimano H，Hasty AH，et al.A crucial role of sterol regulatory element-binding protein-1 in the regulation of lipogenic gene expression by polyunsaturated fatty acids［J］.J Biol Chem，1999，274（50）：25840-35844.

［5］ 聶山文，趙文霞，石艷芬，等.高脂飼料聯(lián)合四環(huán)素腹腔注射復(fù)制非酒精性脂肪肝大鼠模型的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合急救雜志，2013，20（6）：374-375.

［6］ 徐叔云，卞如濂.藥物實(shí)驗(yàn)方法學(xué)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2005：1349.

［7］ 江慶瀾，徐邦軍，楊輝，等.多烯磷脂酰膽堿對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠的干預(yù)效果［J］.廣州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，33（4）：4-6.

［8］ 俞澤元，趙榮榮，蓋大偉，等.SREBP-1C、GRP-94在非酒精性脂肪肝中的表達(dá)及意義［J］.中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2014，24（17）：23-27.

［9］ 唐外姣.護(hù)肝清脂片治療非酒精性脂肪肝病的藥效學(xué)研究及機(jī)制探討［D］.廣州：南方醫(yī)科大學(xué)，2013.

［10］艾正琳，陳東風(fēng).SIEBP-1c在大鼠非酒精性脂肪性肝病中的表達(dá)及意義［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，28（10）：1063-1065.

［11］娜日蘇，包納日斯.非酒精性脂肪肝的發(fā)病機(jī)制與流行病學(xué)的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)醫(yī)藥指南，2016，14（3）：39-40.

［12］du Plessis J，van Pel t J，Kor f H，et al.Association of adipose tissue inf lammation with histologic severity of non alcoholic fat ty l iver disease［J］.Gastroenterology，2015，149（3）：635-648.

［13］Angulo P，Kleiner DE，Dam-Larsen S，et al.Liver f ibrosis，but no other histologic features，is associated with long-term outcomes of patients with nonalcohol ic fat ty liver disease［J］.Gast roenterology，2015，149（2）：389-397.

［14］張順貞，石安華，姚政，等.非酒精性脂肪肝中醫(yī)病因病機(jī)探討［J］.云南中醫(yī)中藥雜志，2015，36（1）：17-19.

［15］王玉衡，張海鷗.非酒精性脂肪肝的中醫(yī)藥治療進(jìn)展［J］.中醫(yī)藥通報(bào)，2014，13（4）：64-66.

［16］崔體圣，苗明三、夏枯草的化學(xué)、藥理及臨床應(yīng)用探討［J］.中醫(yī)研究，2014，29（13）：386-388.

［17］李慧娟，杜成林，王曉靜.垂盆草的研究進(jìn)展［J］.藥學(xué)研究，2015，34（11）：661-663.

［18］王穎，郭蘭萍，黃璐琦，等.姜黃、莪術(shù)、郁金的化學(xué)成分與藥理作用研究進(jìn)展［J］.中國(guó)藥房，2013，24（35）：3338-3342.

The Influenceof QingGan QuShi HuoXue Prescription on the Expressions of Srebp-1c of the Ratsw ith Non Alcoholic Fatty Liver D isease

ZHANG Yuxiang1，WANG Yiqiang1，JIANG Demin1，SHIXiaowei2△，WANG Junkui3
1 Gansu Provincial TCM School，Lanzhou 730050，China；2 Gansu Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine；3 Xihe County TCM Hospital

Objective：To explore the effectsof QingGan QuShi HuoXue prescription on the expressions of liver sterol regulatory elementbinding protein-1c（Srebp-1c）of the ratsw ith non alcoholic fatty liver disease（NAFLD）. Methods：A llSD ratswere random ized into the blank group，themodelgroup，phosphatidylcholine group，low，moderate and high doses groups of QingGan QuShi HuoXue prescription.A fter given conventional feed for seven days，the blank group accepted normal feed；other groups received high fatty feed and intraperitoneal injection of tetracycline to establish themodelsof NAFLD，for fourweeks，differentdosesgroups of QingGan QuShi HuoXue prescription were treated w ith QingGan QuShi HuoXue prescription，phosphatidylcholine group w ith rehabilitation therapy，themodel group and the blank group the same amountof distilled water after successfully establishing themodels. A ftermedicating for four weeks，pathological changes of liver tissue were observed，and the expressions of liver Srebp-1c were detected by Western Blotting method after detecting the blood lipid.Results：Compared w ith the model group，the levels of TG and TC decreased obviously in low，moderate and high doses groups of QingGan QuShiHuoXue prescription（P＜0.05）；liver fatty degeneration alleviated obviously；the expressions of liver Srebp-1c lowered notably（P＜0.01）.Conclusion：QingGan QuShi HuoXue prescription could down regulate the expressionsof liver Srebp-1c of the rats，which showsbettereffects in treating NAFLD.

non alcoholic fatty liverdisease；QingGan；QuShi；HuoXue；Srebp-1c

R575.5

A

1004-6852（2016）07-0019-04

2015-06-25

甘肅省中醫(yī)藥管理局項(xiàng)目（編號(hào)GZK-2015-7）。

張玉香（1982—），女，碩士學(xué)位，講師。研究方向：內(nèi)科疾病的中醫(yī)藥防治。

史曉偉（1983—），男，碩士學(xué)位，主治醫(yī)師。研究方向：糖尿病及其并發(fā)癥的中醫(yī)藥防治。