三七多糖對2型糖尿病大鼠高同型半胱氨酸信號通路的影響*

朱　雙，胡鳳霞黃石市中心醫(yī)院，湖北 黃石435000

三七多糖對2型糖尿病大鼠高同型半胱氨酸信號通路的影響*

朱雙，胡鳳霞△
黃石市中心醫(yī)院，湖北 黃石435000

目的：探討三七多糖對2型糖尿病大鼠肝臟高同型半胱氨酸代謝信號通路3個關(guān)鍵分子亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）、胱硫醚β-合酶（CBS）、5-甲基四氫葉酸高半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶（MTR）表達(dá)的影響。方法：將60只雄性SD大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組以及三七多糖治療組，每組20只，模型組以及三七多糖治療組給予高脂高糖飲食6個月建立2型糖尿病模型，模型建立成功后三七多糖治療組給予三七多糖57mg/（kg·d）灌胃治療，模型組給予同體積生理鹽水灌胃，分別在治療4周和8周后處死大鼠各半，收集血清和肝臟進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測。結(jié)果：治療4周后大鼠血糖以及胰島素抵抗指數(shù)三七多糖治療組較模型組降低（P＜0.05），8周后進(jìn)一步降低，胰島素水平治療4周后三七多糖治療組較模型組降低（P＜0.05），8周后較4周無進(jìn)一步改善；三七多糖治療后，大鼠葉酸較模型組有一定升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），維生素B12在治療4周后較模型組明顯升高（P＜0.05），治療8周后進(jìn)一步升高；同型半胱氨酸在治療4周后明顯降低（P＜0.05），但在8周后無進(jìn)一步改善；治療4周后，與模型對照組比較，三七多糖治療組MTHFR、MTR以及CBSmRNA及蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），治療8周后進(jìn)一步升高，但未達(dá)到空白組水平。結(jié)論：三七多糖可顯著降低模型大鼠血清中同型半胱氨酸含量，其可能是通過調(diào)控高同型半胱氨酸信號通路相關(guān)蛋白MTHFR、CBS、MTR的表達(dá)來實現(xiàn)。

2型糖尿??；亞甲基四氫葉酸還原酶；胱硫醚β-合酶；5-甲基四氫葉酸高半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶；三七多糖

2型糖尿病是多種心腦血管病特別是冠狀動脈粥樣硬化、老年性癡呆、中風(fēng)、靜脈栓塞等心腦血管疾病的危險因素之一，而同型半胱氨酸是參與這一進(jìn)程的關(guān)鍵因子，2型糖尿病患者多數(shù)伴有高同型半胱氨酸血癥［1］。高同型半胱氨酸血癥臨床中是指患者血清中游離的以及和蛋白結(jié)合的同型半胱氨酸含量增高，而增高的關(guān)鍵是甲硫氨酸代謝異常。但是截止目前引起2型糖尿病血清同型半胱氨酸水平升高的原因尚不完全清楚，這可能與維生素B12及葉酸缺乏有關(guān)［2］。三七的作用在《本草求真》中曾描述為：專入肝胃、兼入心、大腸，又名山漆，或云能合金瘡，如漆粘物也。三七多糖是從三七中提取的一類多糖類混合物，有文獻(xiàn)報道［3］三七多糖具有較強(qiáng)的抗氧化能力。本研究擬用三七多糖干預(yù)2型糖尿病模型大鼠，分析其對血清中高同型半胱氨酸是否有降低作用，并分析其可能的機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1動物來源及分組雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量120～140 g，由武漢生物制品研究所提供，實驗動物合格證號：SCXK(鄂)2010-0004，適應(yīng)性喂養(yǎng)10天后隨機(jī)分為3組各20只，空白組(只喂食普通飼料)，模型組(喂食高脂飼料+日常高脂飲食)，三七多糖組(喂食高脂飼料+日常高脂飲食)。

1.1.2藥品與試劑三七多糖(西安天瑞生物技術(shù)有限公司)；高脂飼料(北京博泰宏達(dá)生物技術(shù)有限公司)，豬油以及紅糖市場自購；葉酸、維生素B12以及葡萄糖試劑盒 (南京建成生物工程研究所)；胰島素以及同型半胱氨酸試劑盒(上海藍(lán)基生物科技有限公司)；瓊脂糖(北京恒奧生物科技有限公司)；引物［生工生物(上海)股份有限公司］總RNA提取試劑盒(天根公司)，多克隆抗體MTHFR、CBS以及MTR，ECL發(fā)光試劑盒(美國Santa Cruz公司)；相應(yīng)二抗(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2方法

1.2.12型糖尿病模型的建立及給藥方法模型組以及三七多糖組，造模時間為6個月，造模成功后三七多糖組大鼠給予三七多糖52mg/(kg·d)灌胃，模型組給予同體積生理鹽水灌胃，空白組無干預(yù)，分別于治療4周和8周后處死大鼠各半，測定其相應(yīng)指標(biāo)。

1.2.2標(biāo)本采集用戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)注射麻醉大鼠，注射量為10mL/kg(體質(zhì)量)，麻醉后綁定，無菌操作暴露腹腔，心臟迅速取血，血液提取后立即用3 000 r/min低溫離心機(jī)離心10分鐘，之后取血清，血清收集后立即置于-40℃保存，同時取出肝臟置于-40℃冰箱，備用。

1.2.3相關(guān)指標(biāo)檢測方法CHOL、TG、HDL-c、LDL-c以及葡萄糖的測定方法為酶法，胰島素的檢測方法為El isa法，具體的實驗操作過程參照說明書進(jìn)行。

1.2.4RT-PCR檢測mRNA的表達(dá)隨即稱取肝臟組織30mg，立即用總RNA提取試劑盒提取總RNA，提取總RNA后立即取1μL進(jìn)行定量，之后調(diào)平總RNA濃度，每組各取2μg逆轉(zhuǎn)錄cDNA，然后用逆轉(zhuǎn)的cDNA為模板，PCR MasterMix試劑行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為：98℃預(yù)變性2分鐘，98℃變性10 s，48.6℃退火30 s，72℃延伸35 s，循環(huán)36次。將擴(kuò)增后的產(chǎn)物行瓊脂糖電泳，電泳完成后拍照采集圖像，計算各條帶的熒光強(qiáng)度值，以β-actin作為內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)對照。每組重復(fù)實驗3 次(引物設(shè)計參照文獻(xiàn)進(jìn)行［4］)。

MTHFR引物設(shè)計為：PrimerA：5′GAACGAGGCCAGAAGAAGT3′，

PrimerB：5′TTGAGCTGGCTGTGAACTTG3′，產(chǎn)物長度為571bps。

CBS引物設(shè)計為：PrimerA：5′AGTCTGGATCTCGCCTGATAC3′，

PrimerB：5′TGGTGGATAGGTGGTTCAAG3′，產(chǎn)物長度為412bps。

MTR引物設(shè)計為：PrimerA：5′CGCCTGCGGTAGGATTCT3′，

PrimerB：5′CTGACTATGGCCTCGAACAC3′，產(chǎn)物長度為460bps。

β-actin引物設(shè)計為：PrimerA：5′GTGACGGGCACCGCAAGAAGAG-3′，

PrimerB：5′ACGCACATTGCTGTGGAGAATTGGG-3′，產(chǎn)物長度為153bps。

1.2.5Western Blot檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)稱取肝臟組織100mg用勻漿機(jī)勻碎，勻碎后立即用BCA試劑盒對蛋白進(jìn)行定量，定量后每組各取樣本50μg行SDS-PAGE電泳，所有實驗過程全部按照標(biāo)準(zhǔn)的western blot法進(jìn)行，在曝光洗片后掃描圖像計算各條帶的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)對照。每組重復(fù)實驗3次。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計量資料以(±s)表示，組間多重比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1血糖、胰島素、胰島素抵抗指數(shù)三七多糖組干預(yù)4周時大鼠血糖、胰島素以及胰島素抵抗指數(shù)較模型組降低(P＜0.05)，8周時血糖和胰島素抵抗指數(shù)進(jìn)一步降低，但與治療4周時比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見表1。

2.2葉酸、維生素B12、同型半胱氨酸三七多糖組干預(yù)后大鼠葉酸較模型組有一定升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，維生素B12在治療4周后較模型組明顯升高(P＜0.05)，治療8周后進(jìn)一步升高；同型半胱氨酸在治療4周后降低(P＜0.05)，但在8周后無進(jìn)一步改善，見表2。

表1　干預(yù)后大鼠血糖、胰島素、胰島素抵抗指數(shù)變化情況χ±s）

表1　干預(yù)后大鼠血糖、胰島素、胰島素抵抗指數(shù)變化情況χ±s）

注：*表示與模型組比較，P＜0.05；#表示與空白組比較，P＜0.05。

組別　血糖/（mmol·L-1）　胰島素/（μIU·mL-1）　胰島素抵抗指數(shù)4周　8周　4周　8周　4周　8周空白組　5.32±1.13　5.84±1.07　2.70±1.26　3.05±1.32　0.64±0.09　0.79±0.13模型組　16.42±3.62#　16.49±4.08#　5.40±1.16#　5.62±1.24#　3.94±0.34#　4.11±0.17#三七多糖組　8.99±2.14*#　8.23±2.33*#　3.90±2.30*#　4.12±2.16*#　1.56±0.16*#　1.52±0.15*#

表2　干預(yù)后大鼠葉酸、維生素B12以及同型半胱氨酸變化情況χ±s）

表2　干預(yù)后大鼠葉酸、維生素B12以及同型半胱氨酸變化情況χ±s）

注：*表示與模型組比較，P＜0.05；#表示與空白組比較，P＜0.05。

組別　葉酸/（ng·mL-1）　維生素B12（pg·mL-1）　同型半胱氨酸/（μmol·mL-1）4周　8周　4周　8周　4周　8周空白組　5.99±0.45　6.23±0.64　678.4±100.8　667.5±121.4　5.41±0.36　5.43±0.27模型組　5.13±1.29#5.36±1.07#　477.6±121.4#　468.7±142.3#　16.58±4.11#　17.08±4.09#三七多糖組　5.47±1.03　5.89±0.78　553.2±99.6*#　589.4±125.6*#　8.43±1.36*#　8.51±2.15*#

2.3MTHFR、CBS、MTR的mRNA表達(dá)干預(yù)4周后，與模型組比較，三七多糖組MTHFR、MTR以及CBSmRNA表達(dá)明顯升高(P＜0.05)，治療8周后進(jìn)一步升高，但未達(dá)到空白組的水平，見圖1—2。

圖1　干預(yù)4周后大鼠肝臟提取液MTHFR、CBS和MTRmRNA表達(dá)

圖2　干預(yù)8周后大鼠肝臟提取液MTHFR、CBS和MTR蛋白表達(dá)

2.4 MTHFR、CBS、MTR三種酶的蛋白表達(dá)干預(yù)4周后，與模型組比較，三七多糖組MTHFR、MTR以及CBS蛋白表達(dá)明顯升高(P＜0.05)，治療8周后進(jìn)一步升高，但仍未達(dá)到空白組的水平，見圖3—4。

圖3　干預(yù)4周后大鼠肝臟提取液MTHFR、CBS和MTRmRNA表達(dá)

圖4　干預(yù)8周后大鼠肝臟提取液MTHFR、CBS和MTR蛋白表達(dá)

3　討論

近年來隨著人們生活水平的提高，2型糖尿病(Type 2 Diabetes Mel l itus，T2DM)的發(fā)生率越來越高［5］。有研究顯示［6］，當(dāng)前我國已經(jīng)成為糖尿病大國，而其中95%為2型糖尿病，T2DM嚴(yán)重威脅著人們健康，特別相關(guān)并發(fā)癥危險更甚，而血清中同型半胱氨酸含量增加是導(dǎo)致心腦血管病的危險因素。因此，有學(xué)者提出，控制2型糖尿病，目前最為關(guān)鍵的可能是控制血清中的同型半胱氨酸含量，而當(dāng)前控制同型半胱氨酸升高的主要藥物為維生素B12和葉酸，但維生素B12和葉酸并沒有降糖作用，關(guān)于其他多糖類既有降糖作用也能降低同型半胱氨酸水平的研究偶有報道［6］。三七多糖為中藥三七的提取物，本研究采用三七多糖干預(yù)2型糖尿病模型大鼠，觀察大鼠血糖以及血清中同型半胱氨酸的變化，以期為臨床藥物治療2型糖尿病提供幫助。

同型半胱氨酸信號通路主要由MTHFR、CBS以及MTR三個酶蛋白構(gòu)成，這三個酶蛋白構(gòu)成了同型半胱氨酸轉(zhuǎn)化的2條途徑，途徑一為在MTHFR的催化下，血清中的四氫葉酸可由在肝細(xì)胞中發(fā)生甲基化，生成N5-甲基四氫葉酸，此時，在MTR酶的催化下，N5-甲基四氫葉酸作為同型半胱氨酸供體提供給同型半胱氨酸甲基，最終促進(jìn)同型半胱氨酸合成蛋氨酸；第二條途徑為在CBS的催化下，同型半胱氨酸與血清中游離的絲氨酸發(fā)生反應(yīng)，進(jìn)而縮合生成胱硫醚，胱硫醚再進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為可經(jīng)尿排除的物質(zhì)排出體外［7-9］。近年來，2型糖尿病患者如何控制血清中的同型半胱氨酸受到越來越多學(xué)者的關(guān)注［10-12］。

本次研究采用三七多糖干預(yù)2型糖尿病大鼠，結(jié)果顯示干預(yù)4周后大鼠血糖以及胰島素抵抗指數(shù)三七多糖組較模型組降低(P＜0.05)，8周后進(jìn)一步降低，胰島素水平治療4周后三七多糖組較模型組降低(P＜0.05)，8周后較4周進(jìn)一步改善；提示三七多糖可明顯降低血糖和胰島素抵抗指數(shù)，但對胰島素改善效果較差。三七多糖干預(yù)后大鼠葉酸較模型組有一定升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，維生素B12在干預(yù)4周后較模型組升高(P＜0.05)，治療8周后進(jìn)一步升高；同型半胱氨酸在干預(yù)4周后降低(P＜0.05)，但在8周后未進(jìn)一步改善；提示三七多糖可短時間內(nèi)改善并長時間維持血清中同型半胱氨酸含量；干預(yù)4周后與模型組比較，三七多糖組MTHFR、MTR、CBSmRNA及蛋白表達(dá)升高(P＜0.05)，治療8周后進(jìn)一步升高，但仍然未達(dá)到空白組水平。三七多糖可調(diào)節(jié)同型半胱氨酸代謝的3個關(guān)鍵酶MTHFR、CBS以及MTR mRNA和蛋白的表達(dá)。

綜上所述，三七多糖可顯著降低血清中同型半胱氨酸含量，其可能是通過調(diào)控高同型半胱氨酸信號通路相關(guān)蛋白MTHFR、CBS、MTR的表達(dá)來實現(xiàn)。

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The EffectsofPanax Polysaccharide on Hom ocysteine Signaling Pathway of the Ratsw ith Type Two D iabetesMellitus

ZHU Shuang，HU Fengxia△
HuangshiMunicipality Central Hospital，Huangshi435000，China

Objective：To explore the influence of panax polysaccharide on the expressions of three key molecules MTHFR，CBS，MTR of homocysteine signaling pathway of the rats w ith type two diabetesmellitus （T2DM）.Methods：Sixty rats were randomized into the blank group，themodel group and the treatment group of panax polysaccharide，20 rats each group，themodel group and the treatment group of panax polysaccharidewere given high fatand high sugar diet for six months to establish T2DM ratmodels，after successfully establishing the models，the treatmentgroup of panax polysaccharide accepted intragastric administration of panax polysaccharide in the concentrations of 57mg/（kg·d），themodelgroup received physiologicalsaline in the same volume，the ratswere sacrificed after treating in fourweeksand eightweeks respectively，the related indexeswere detected after collecting the serum and liver.Results：Blood glucose and insulin resistance index of the treatment group of panax polysaccharide decreased obviously compared w ith themodel group after treating in fourweeks（P＜0.05），these indexes lowered after treating in eightweeks，insulin level decreased after treating in fourweekswhen the treatment group of panax polysaccharidewas compared w ith themodelgroup notably（P＜0.05），therewasno improvements after treating in eightweeks compared with these in fourweeks；after treatingw ith panax polysaccharide，the levels of folic acid of the rats rose compared w ith themodel group，but there was no statisticalmeaning（P＞0.05），the levelsof vitamin B12improved comparedwith themodelgroup after treating in fourweeks（P＜0.05），they improved furtheraftertreatingineightweeks；the levelofhemocysteinedecreasedobviouslyaftertreating in fourweeks（P＜0.05），while therewasno improvements after treating in eightweeks；compared w ith themodelgroup after treating in four weeks，mRNA and protein expressions of MTHFR，MTR and CBS rose evidently in the treatment group of panax polysaccharide（P＜0.05），theseexpressions improved after treating in eightweeks，but they didn’t reach the levelof the blank group.Conclusion：Panax polysaccharide could notably decrease the contents of homocysteine in the rat model apparently，whichmight be realized by regulating the expressions of MTHFR，MTR and CBS in homocysteine signaling pathway.

type two diabetesmellitus；MTHFR；CBS；MTR；panax polysaccharide

R587

A

1004-6852（2016）07-0015-04

2015-10-15

湖北省科技廳資助項目（編號2012FFA016）。

朱雙（1776—），女，主管護(hù)師。研究方向：糖尿病的護(hù)理。

胡鳳霞（1972—），女，副主任護(hù)師。研究方向：慢性腎臟病及血透、糖尿病的護(hù)理。