土荊芥揮發(fā)性化感物質(zhì)對蠶豆葉表皮保衛(wèi)細胞的影響

周　健， 馬丹煒， 陳永甜， 袁立娜， 黃雪婷， 瞿歡歡

( 四川師范大學 生命科學學院， 成都 610101 )

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土荊芥揮發(fā)性化感物質(zhì)對蠶豆葉表皮保衛(wèi)細胞的影響

周健， 馬丹煒*， 陳永甜， 袁立娜， 黃雪婷， 瞿歡歡

( 四川師范大學 生命科學學院， 成都 610101 )

化感作用是外來植物土荊芥(Chenopodiumambrosioides)成功入侵的機制之一。為了探討土荊芥揮發(fā)油的化感作用機制，該文以蠶豆(Viciafaba)葉的下表皮為材料，將表皮條孵育在分別含土荊芥揮發(fā)油、α-萜品烯和對傘花素的MES [2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid]緩沖液中，25 ℃下光照培養(yǎng)30 min，采用吖啶橙/溴乙錠(AO/EB)雙熒光染色法和Feulgen染色法，研究土荊芥揮發(fā)油、α-萜品烯和對傘花素對保衛(wèi)細胞活性和細胞核形態(tài)的影響。結果表明：在土荊芥揮發(fā)油、α-萜品烯和對傘花素的作用下，蠶豆氣孔保衛(wèi)細胞活性降低，細胞核出現(xiàn)固縮、畸形或降解等細胞凋亡特征。隨著處理劑量增加，保衛(wèi)細胞活性顯著下降，核異常率顯著增加，表明土荊芥揮發(fā)油、α-萜品烯和對傘花素均對蠶豆保衛(wèi)細胞具有細胞毒性，其中，揮發(fā)油毒性最大，α-萜品烯的毒性次之，對傘花素的毒性最??；Caspase抑制劑Z-VAD-FMK可緩解揮發(fā)油、α-萜品烯和對傘花素對保衛(wèi)細胞的毒性，提高細胞活性，這種緩解效應隨著抑制劑濃度的增加而增大。由此可見，土荊芥揮發(fā)油、α-萜品烯和對傘花素誘導蠶豆保衛(wèi)細胞發(fā)生了Caspase依賴性的細胞凋亡。

土荊芥, 化感脅迫, 揮發(fā)油, 保衛(wèi)細胞， 細胞凋亡

氣孔對光合作用CO2的吸收和蒸騰作用水分的喪失具有調(diào)節(jié)功能，因此，任何改變氣孔功能的因素均會影響光合作用和水分之間的關系，進而影響植物的產(chǎn)量(McAinsh et al，1996)。氣孔保衛(wèi)細胞也是植物對外界刺激作出響應的最直接門戶，可對多種刺激做出反應(魏愛麗等，2014)，如SO2(魏愛麗等，2014；Wei et al，2013)、鋁(王毅等，2013)、砷(薛美昭等，2014)等外界環(huán)境脅迫均會誘導氣孔保衛(wèi)細胞發(fā)生死亡，氣體甲醛脅迫增加了蠶豆(Viciafaba)保衛(wèi)細胞中H2O2的積累，顯著降低蠶豆的氣孔導度和開度(孫慧群等，2015)。這些研究表明，氣孔保衛(wèi)細胞對環(huán)境變化反應靈敏是研究環(huán)境脅迫機制的良好材料。

土荊芥(Chenopodiumambrosioides)為藜科藜屬一年或多年生芳香性草本植物，原產(chǎn)熱帶美洲，是我國危害極嚴重的外來入侵植物之一(徐海根等，2004)。外來植物在入侵過程中，向外界釋放化感物質(zhì)抑制周圍植物生長，是其成功入侵的機制之一(Cipollini et al，2012)，而細胞毒性是許多化感物質(zhì)的一個重要特性(Cipollini et al，2012)。土荊芥具有較強的化感作用(Jimenez et al，1996)，在其化感脅迫下，受體植物的根邊緣細胞數(shù)量減少，存活率下降(李安奇等，2012)；根尖分生區(qū)細胞有絲分裂指數(shù)下降，微核率和畸變率增加(胡琬君等，2011)，膜脂過氧化程度加劇，抗氧化酶活性受到抑制，細胞出現(xiàn)氧化損傷和細胞凋亡現(xiàn)象(胡琬君等，2012)。這些研究結果表明，土荊芥通過揮發(fā)途徑釋放的化感物質(zhì)對周圍植物的影響很大。植物釋放的揮發(fā)性化感物質(zhì)除了一部分通過淋溶進入土壤影響受體植物根系外(王朋等，2008)，大部分會釋放到空氣中作用于受體植物的地上器官，尤其是葉片。大氣中的物質(zhì)主要通過葉片上的氣孔進入植物體，而目前有關土荊芥對氣孔的影響報道較少。本研究以在土荊芥入侵地廣泛種植，并且用于觀察保衛(wèi)細胞氣孔活動的模式植物蠶豆(Viciafaba)(孫慧群等，2015)為材料，采用表皮分析法研究土荊芥揮發(fā)油及其兩種主要成分α-萜品烯和對傘花素對保衛(wèi)細胞的影響，為揭示土荊芥揮發(fā)性物質(zhì)化感作用機制提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1 材料

供體植物土荊芥于2014年9月下旬采于四川省成都市錦江區(qū)包江橋附近的荒地。采用改進后的水蒸氣蒸餾法(Singh et al，2009)提取土荊芥揮發(fā)油，用無水Na2SO4除去水分，得到淡黃色具有強烈芳香味的揮發(fā)油，測得密度為843 mg·mL-1。4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)文獻(魏輝等，2010；熊秀芳等，1999)報道，α-萜品烯和對傘花素為土荊芥揮發(fā)油的主要成分。經(jīng)四川大學測試中心分析鑒定，供試土荊芥揮發(fā)油中，α-萜品烯和對傘花素的含量分別為151和156 mg·mL-1。α-萜品烯和對傘花素的標準品及Caspase抑制劑Z-VAD-FMK均購自成都市銳可思生化試劑公司。

受體植物蠶豆種子(成胡14#)購于成都市五塊石種子市場。

1.2 方法

1.2.1 材料培養(yǎng)挑選大小均一、飽滿的蠶豆種子，用0.5% KMnO4浸泡15 min，蒸餾水浸種24 h，無光照25 ℃催芽2～3 d，待露白后播種于盛有石英砂的小花盆(直徑10 cm，高度6 cm)中。置于25 ℃、光暗周期14 h/10 h的條件下培養(yǎng)。幼苗生長期花盆內(nèi)Hoagland營養(yǎng)液(CaNO3·4H2O 945 mg·mL-1，KNO3506 mg·mL-1，NH4NO380 mg·mL-1，KH2PO4136 mg·mL-1，MgSO4·7H2O 493 mg·mL-1，鐵鹽溶液 2.5 mL，微量元素液5 mL，pH 6.0)保持在0.2%。

圖 1　土荊芥揮發(fā)油、α-萜品烯和對傘花素處理后蠶豆保衛(wèi)細胞活性變化　a. 對照組; b. 氣孔單保衛(wèi)細胞活性喪失; c. 雙保衛(wèi)細胞活性喪失; d. 核裂解。Fig. 1　Viability changes in the guard cells of Vicia faba exposed to volatile oil from Chenopodium ambrosioides, α-terpinene and cymene　a. Control group; b. Lossing of the stoma single guard cell viability; c. Lossing of the stoma double guard cell viability; d. Nuclear degradation.

圖 2　土荊芥揮發(fā)油、α-萜品烯和對傘花素對蠶豆保衛(wèi)細胞活性的影響　Fig. 2　Effects of volatile oil from Chenopodium ambrosioides, cymene and α- terpinene on guard cell viabilities in Vicia faba

待蠶豆長至4周左右時取頂端完全展開的葉片，用鑷子撕取1 cm × 0.5 cm的下表皮用于脅迫處理試驗。

1.2.2 脅迫處理用二甲基亞砜(DMSO)配制揮發(fā)油、α-萜品烯和對傘花素處理母液。將10 μL揮發(fā)油用DMSO稀釋至100 μL得到0.1 μL·μL-1的揮發(fā)油處理母液。根據(jù)10 μL揮發(fā)油中α-萜品烯和對傘花素的含量，配制二者的處理母液，其終濃度分別為0.016 9和0.018 6 μL·μL-1。

取10 mL的EP管若干，分別加入5 mL表皮緩沖液[50 mmol·L-1KCl，0.1 mmol·L-1CaCl2，0.1 mol·L-1Tris，10 mmol·L-12-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES)，pH7.0]。試驗共設置三個處理組，即揮發(fā)油處理組、α-萜品烯處理組和對傘花素處理組，每組再分為甲、乙兩組：甲組為處理組。取配置好的處理母液2，4，6，8，10 μL(分別記為梯度1、梯度2、梯度3、梯度4、梯度5)，用DMSO補充處理液至10 μL后，再分別加入盛有MES緩沖液的EP管中。每個EP管放入6個表皮條，蓋上蓋子；乙組為緩解組。分別取10 μmol·L-1和40 μmol·L-1的10 μL Caspase抑制劑Z-VAD-FMK加入盛有MES緩沖液的EP管中，每個EP管放入6個表皮條。5 min后分別加入8 μL處理液；甲、乙均設置2個對照，甲組以緩沖液和DMSO溶劑為對照，乙組以緩沖液和8 μL處理母液為對照，甲、乙兩組的EP管均置于25 ℃下光照培養(yǎng)30 min。每處理重復3次。

1.2.3 指標檢測細胞活性檢測：脅迫處理結束后，采用馬丹煒等(2011)的方法略有改進。將表皮條用MES緩沖液清洗3次后，取出表皮條平鋪在載玻片上，吸干緩沖液后滴加少許AO/EB染液，避光染色5 min，用LEICA DM300熒光顯微鏡觀察保衛(wèi)細胞并拍照。具有綠色熒光的為活細胞，具有橘紅色熒光的為死細胞。每個處理觀察1 000 個細胞，統(tǒng)計保衛(wèi)細胞的存活率。

細胞核異常率檢測：脅迫處理結束后，采用Feulgen染色法染色(王金發(fā)等，2004)。MES緩沖液清洗1次后，用卡諾氏固定液(冰醋酸∶無水乙醇 = 1∶3)固定2 h，然后放入稀鹽酸中60 ℃下解離8 min，蒸餾水清洗 3 次，每次10 min。吸干水分，Schiff試劑避光染色30 min，洗掉染液，LEICA DFC450C光學顯微鏡觀察并拍照。每個處理組觀察1 000 個細胞，統(tǒng)計保衛(wèi)細胞的核異常率。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS17.0對數(shù)據(jù)進行處理，Duncan法對各處理組細胞存活率和細胞核形態(tài)異常率進行比較分析，Microsoft Excel 2007 作圖。

圖 3　土荊芥揮發(fā)油、α-萜品烯和對傘花素作用下蠶豆保衛(wèi)細胞核形態(tài)的變化a. 對照組； b. 核固縮和錯位； c. 核拉長和固縮； d. 核畸形； e. 核降解； f. 核消失。Fig. 3　Changes in the nucleus morphology of guard cells in Vicia faba exposed to volatile oil from Chenopodium ambrosioides, cymene and α-terpinene　a. Control group; b. Nuclear pyknosis and malposition; c. Nuclear elongation and pyknosis; d. Nuclear malformation; f. Nuclear disappearance.

2　結果與分析

2.1 土荊芥揮發(fā)油及其兩種主要成分對保衛(wèi)細胞活性的影響

經(jīng)AO/EB染色后在熒光顯微鏡下觀察表皮條發(fā)現(xiàn)，對照組中大部分保衛(wèi)細胞的細胞核發(fā)亮綠色熒光(圖1：a)，具有較高的活性，而處理組則隨著處理劑量增加，發(fā)出橘紅色熒光(圖1：b-c)細胞核的數(shù)目隨之增加，即喪失活性的細胞數(shù)目在增加，并且出現(xiàn)細胞核降解紅色熒光消失(圖1：d)的情況，說明土荊芥揮發(fā)油、α-萜品烯和對傘花素均可以誘導保衛(wèi)細胞死亡。

從圖2 可以看出，與對照相比，溶劑DMSO對保衛(wèi)細胞活性沒有顯著影響。土荊芥揮發(fā)油、α-萜品烯和對傘花素均導致保衛(wèi)細胞活性降低。在揮發(fā)油處理組中，細胞活性隨著揮發(fā)油處理劑量增加而顯著下降(P<0.05)；α-萜品烯處理組中，處理梯度1～3，隨處理劑量的增加保衛(wèi)細胞活性顯著下降趨勢(P<0.05)，但隨著處理劑量進一步增加細胞，存活率趨于穩(wěn)定；對傘花素處理組中，除了處理梯度1的細胞存活率與對照組無顯著差異，其余處理均隨著處理劑量增加細胞活性逐漸下降(P<0.05)；比較3個處理組發(fā)現(xiàn)，處理梯度5的細胞存活率為揮發(fā)油(5.0%)<α-萜品烯(18.0%)<對傘花素(34.8%)，由此可見，土荊芥揮發(fā)油對蠶豆保衛(wèi)細胞的毒性最大，α-萜品烯次之，對傘花素的毒性最小。

2.2 土荊芥揮發(fā)油及其兩種主要成分對保衛(wèi)細胞核形態(tài)的影響

土荊芥揮發(fā)油及其兩種主要成分α-萜品烯和對傘花素對保衛(wèi)細胞核形態(tài)具有顯著的影響。經(jīng)Schiff試劑染色后，光學顯微鏡鏡檢發(fā)現(xiàn)，對照組保衛(wèi)細胞的核位于細胞中間，形態(tài)規(guī)則(圖3：a)；而經(jīng)揮發(fā)油、α-萜品烯和對傘花素處理后，保衛(wèi)細胞的核形態(tài)不規(guī)則，并出現(xiàn)明顯的細胞程序性死亡特征如核錯位、固縮、拉長或降解(圖3：b-f)。

圖 4　土荊芥揮發(fā)油、α-萜品烯和對傘花素對蠶豆保衛(wèi)細胞核形態(tài)的影響Fig. 4　Effects of volatile oil from Chenopodium ambrosioides, cymene and α-terpinene on nucleus morphology of Vicia faba guard cells

圖 5　Caspase抑制劑對土荊芥揮發(fā)油、α-萜品烯和對傘花素細胞毒性的緩解效應Fig. 5　Alleviated effects of Caspase inhibitor on the cytotoxicity of volatile oil from Chenopodium ambrosioides, α-terpinene and cymene

在土荊芥揮發(fā)油及其主要成分作用下，保衛(wèi)細胞核異常率的變化如圖4所示。從圖4可見，較低處理劑量(梯度1和梯度2)，各處理組細胞核的形態(tài)異常率與對照組、溶劑對照組均沒有顯著差異。但隨著處理劑量進一步增加(>梯度3)，細胞核異常率隨之增加，并與對照呈現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)。比較三個處理組的保衛(wèi)細胞異常率可見，揮發(fā)油處理過的保衛(wèi)細胞異常率最大，α-萜品烯次之，對傘花素最小。

綜上所述，土荊芥及其主要成分均誘導了保衛(wèi)細胞核出現(xiàn)異?，F(xiàn)象，可能導致了保衛(wèi)細胞發(fā)生程序性細胞死亡。

2.3 Caspase抑制劑對土荊芥化感脅迫的緩解效應

圖5顯示，當處理液中加入Caspase抑制劑后，保衛(wèi)細胞存活率增加，且抑制劑濃度越大，細胞活性越高。Caspase是與程序性細胞死亡密切相關的蛋白水解酶，加入Caspase抑制劑后，由土荊芥揮發(fā)油、α-萜品烯和對傘花素誘導的保衛(wèi)細胞死亡現(xiàn)象明顯減弱，由此可以證明，土荊芥及其主要成分誘導的保衛(wèi)細胞死亡屬于細胞凋亡。

3　討論

3.1 土荊芥揮發(fā)性化感物質(zhì)誘導保衛(wèi)細胞凋亡

細胞毒性是某些化感物質(zhì)的重要特性(Babula et al，2010)，如許多入侵植物會釋放胡桃醌、白花丹素等萘醌類化感物質(zhì)，這些物質(zhì)導致煙草(Nicotianatabacum)BY-2 細胞發(fā)生結構、功能以及酶的變化，細胞出現(xiàn)類凋亡特征(Babula et al，2009)。土荊芥揮發(fā)油導致蠶豆根尖細胞DNA發(fā)生特異性降解，形成DNA-Ladder，隨著揮發(fā)油劑量增大和作用時間延長，細胞凋亡過程加劇(胡琬君等，2011)。此外，化感物質(zhì)還具有明顯的遺傳毒性，導致受體細胞發(fā)生DNA損傷、基因突變、染色體畸變、有絲分裂受阻等(馬丹煒等，2015)。本研究結果表明，土荊芥揮發(fā)油及其兩種主要成分α-萜品烯和對傘花素對均具有明顯的細胞毒性，隨著三者處理劑量增加，蠶豆葉下表皮保衛(wèi)細胞活性下降甚至死亡，細胞核均出現(xiàn)了核畸形、固縮和降解等細胞凋亡的典型特征(Van Doorn et al，2011), 保衛(wèi)細胞的核異常率隨著處理劑量增加而增大。Caspase對底物的切割使細胞呈現(xiàn)出凋亡的一系列形態(tài)學和分子生物學特征(翟中和等，2011)，而Z-VAD-FMK是一種可以穿透細胞膜的泛Caspase抑制劑，能明顯抑制Caspase活性而減少細胞凋亡。本研究結果表明，當在處理液中加入10和40 μmol·L-1的Z-VAD-FMK溶液后，細胞存活率顯著提高，由此可見，土荊芥揮發(fā)油、α-萜品烯和對傘花素誘導蠶豆保衛(wèi)細胞發(fā)生了Caspase依賴性的細胞凋亡。

3.2 土荊芥揮發(fā)油及其兩種主要成分的化感脅迫

土荊芥釋放到周圍環(huán)境中的揮發(fā)性化感物質(zhì)除了少部分隨淋溶或土壤吸附進入土壤外，大部分會揮發(fā)到大氣中，作用于植物體的地上部分，尤其是葉片。根據(jù)上述分析可知，在土荊芥揮發(fā)油及其主要成分α-萜品烯和對傘花素作用下，蠶豆葉保衛(wèi)細胞發(fā)生了凋亡。從進化角度來看，細胞凋亡是植物在長期的逆境中獲得的一種適應性機制。受脅迫組織通過局部細胞死亡而主動形成一道死亡細胞屏障，避免對其他組織的進一步侵害，此外，死細胞的DNA可主動降解為核苷酸，以便植物重新利用或者用來修復逆境脅迫所帶來的傷害(肖軍等，2008)。氣孔保衛(wèi)細胞也是植物對外界刺激做出響應的最直接的門戶(魏愛麗等，2014)，當受到土荊芥揮發(fā)性化感物質(zhì)脅迫時，保衛(wèi)細胞通過凋亡以阻止這些化感物質(zhì)進一步傷害葉肉組織。最大處理劑量作用下，揮發(fā)油處理組、α-萜品烯處理組和對傘花素處理組的細胞存活率分別為5.0%、18.0%和34.8%，而核異常率分別為80.2%、51.4%和37.4%，三者的化感效應強度依次為揮發(fā)油>α-萜品烯>對傘花素。植物釋放的化感物質(zhì)不是單一的，化感物質(zhì)之間也存在著協(xié)同、拮抗或簡單的加合作用(孔垂華等，1998)。土荊芥揮發(fā)油是由多種物質(zhì)組成的混合物，本研究結果表明，與土荊芥揮發(fā)油主要成分α-萜品烯和對傘花素相比，揮發(fā)油的化感效應強度明顯較大，表明土荊芥通過揮發(fā)途徑釋放的包括α-萜品烯、對傘花素在內(nèi)的多種化感物質(zhì)之間可能存在著協(xié)同或加合作用。

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Effects of volatile allelochemicals fromChenopodiumambrosioideson the stoma guard cells in leaf epidermis ofViciafaba

ZHOU Jian, MA Dan-Wei*, CHEN Yong-Tian, YUAN Li-Na,HUANG Xue-Ting, QU Huan-Huan

(CollegeofLifeSciences,SichuanNormalUniversity, Chengdu 610101, China )

Chenopodiumambrosioides, an aromatic herbnative to tropical Central and South America, has become a major invasive plant in China. Allelopathy plays a crictical role in the successful invasion ofC.ambrosioides, and has an allelopathic stress on neighbor plants. To explore the allelopathy mechanism， the effects of volatile oil fromC.ambrosioides, α-terpinene and cymene on guard cell viabilities and nucleus morphology inViciafabaleaves were investigated using epidermal strips bioassay, AO/EB fluorescent staining and conventional Feulgen staining. Epidermal strips of leaves were incubated in 2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) buffer containing volatile oil, α-terpinene and cymene for 30 min at 25 ℃ in illumination incubator. The results showed that volatile oil, α-terpinene and cymene resulted in the decrease of viabilities and increase of abnormal nuclei rates in guard cell ofV.fabaleaves. The cytotoxicity on guard cells decreased successively from volatile oil to α- terpinene to cymene. The apoptosis features including nuclear pyknotic, malposition, stretch and degradation were observed in guard cell under the treatments of volatile oil, α-terpinene and cymene. However, the guard cell survival rates increased when strips were exposed to volatile oil, α-terpinene and cymene combined with different concentrations of a caspase inhibitor Z-VAD-FMK. These results suggested that the volatile allelochemicals fromChenopodiumambrosioidesinduced guard cell caspase-dependent apoptosis inViciafabaleaves.

Chenopodiumambrosioides, allelochemical stress, volatile oil, guard cells, apoptosis

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2015-04-27

2015-09-01

國家自然科學基金(31370549); 四川省教育廳項目(16ZA0056, 16ZB0058) [Supported by the National Natural Science Foundation of China (31370549); Deducation Office of Sichuan Province, China (16ZA0056, 16ZB0058)]。

周健(1990-),男，甘肅隴南人，碩士，主要從事細胞生物學的研究，(E-mail)1076387029@qq.com。

馬丹煒，博士，教授，主要從事植物化感作用等研究，(E-mail)danwei10ma@163.com。

Q946

A

1000-3142(2016)08-0963-06