山楂葉HPLC指紋圖譜研究*

李曉亮，牛海軍，葛德助，丁連峰，張言鵬

(1 安徽九方藥物研究院有限公司，安徽　合肥　230088；2 安徽濟(jì)人藥業(yè)有限公司，安徽　亳州　236800)

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分析測試

山楂葉HPLC指紋圖譜研究*

李曉亮1，牛海軍1，葛德助2，丁連峰2，張言鵬2

(1 安徽九方藥物研究院有限公司，安徽合肥230088；2 安徽濟(jì)人藥業(yè)有限公司，安徽亳州236800)

為了研究并建立山楂葉指紋圖譜測定方法，以不同產(chǎn)地及不同采集時(shí)間的山楂葉進(jìn)行試驗(yàn)，采用RP-HPLC法以乙腈和0.5%磷酸溶液(70:30)進(jìn)行二元梯度洗脫，流速為1.0 mL·min-1，檢測波長320 nm，測定樣品的指紋圖譜。結(jié)果表明，不同產(chǎn)地山楂葉成分差異較大，以山西晉城山楂葉色譜峰較多，并確定本方法操作簡便，重現(xiàn)性和精密度較好，且各峰分離度較好，確定共有峰11個(gè)。建立的山楂葉HPLC指紋圖譜為其質(zhì)量控制提供依據(jù)。

山楂葉；RP-HPLC法；指紋圖譜

山楂葉為薔薇科植物山里紅CrataeguspinnatifidaBge.var.major N.E.Br.或山楂GrataeguspinnatifidaBge.的干燥葉。薔薇科(Rosaceae)山楂屬(CrataegusL.)植物是分布在北溫帶的種類豐富的小喬木或灌木群[1]，大約在北緯30°～50°之間[2]?，F(xiàn)在普遍認(rèn)為約有250種[3-4]。我國分布有16種其中以山里紅(CrataeguspinnatifidaBge.var.major N.E.Br.)、山楂(CrataeguspinnatifidaBge.)和野山楂(CrataeguscuneataSieb. &Zucc. )最為多見。近年來，研究發(fā)現(xiàn)山楂葉中主要化學(xué)成分黃酮類可治療心血管疾病，有降壓、增加冠脈血流量、降低血脂、耐缺氧、強(qiáng)心、改善血液流變、抗心肌缺血、抗心律失常等[5-7]。據(jù)報(bào)道，歐洲7個(gè)國家的120個(gè)調(diào)查中心對2300例患有充血性心力衰竭和紐約心臟協(xié)會分類的Ⅰ級、Ⅱ級和Ⅲ級{New York Heart Association (NY2HA) classⅠ、Ⅱ and Ⅲ}心衰的病人進(jìn)行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)山楂葉提取物(WS 1442，主要成分為黃酮和聚合黃烷類)對這些疾病有良好的效果[8-10]。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[11-12]，山楂葉中含黃酮類化合物：金絲桃苷、牡荊素、牡荊素葡萄糖苷及牡荊素異鼠李糖苷等，選擇以上成分作為指標(biāo)性成分進(jìn)行分析利用HPLC指紋圖譜對山楂葉藥材的整體質(zhì)量評價(jià)進(jìn)行了研究。

1　儀器與試劑

島津 LC-10AT 液相色譜儀，包括 LC-10AT色譜泵、SPD-M10Avp DAD檢測器、SIL-10A自動進(jìn)樣器、Lcsolution色譜工作站。

甲醇和乙腈均為色譜純，美國天地公司；其他試劑均為分析純。牡荊素葡萄糖苷對照品：成都普瑞法科技開發(fā)有限公司(批號：G091210，含量為98.90%)；山楂葉：產(chǎn)地山西、合肥、北京、臨沂、承德、韶關(guān)、南寧、玉林、梧州、桂林、賀州，經(jīng)安徽九方藥物研究院有限公司邵旭鑒定為薔薇科植物山楂葉。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(4.6 mm×250 mm，5 μm)；以乙腈為流動相A，0.5%磷酸溶液為流動相B，按下表1中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；流速為1.0 mL·min-1；檢測波長為320 nm；理論板數(shù)按牡荊素葡萄糖苷峰計(jì)算應(yīng)不低于5000。

表1　梯度洗脫條件Table 1　The gradient elution conditions

2.2供試品溶液的制備

取本品細(xì)粉1 g，加50%乙醇30 mL加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状既芙庵?0 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3參照物溶液的制備

取牡荊素葡萄糖苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含100 μg的溶液。

2.4指紋圖譜的建立

2.4.1測定方法

分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，測定，即得。按中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)，供試品指紋圖譜與對照指紋圖譜經(jīng)相似度計(jì)算。

2.4.2方法學(xué)考察

(1)穩(wěn)定性

取上述供試品溶液，分別在0 h、1 h、4 h、6 h、12 h、24 h注入液相色譜儀，考察山楂葉指紋圖譜方法的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，山楂葉樣品供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2　溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)Table 2　The test of solution stability

(2)重復(fù)性

取同一批山楂葉藥材樣品粉末6份，按上述供試品溶液制備方法制成供試品溶液，分別進(jìn)樣，測定，計(jì)算相似度，結(jié)果見圖1及表3。

圖1　重復(fù)性實(shí)驗(yàn)供試品色譜圖Fig.1　The HPLC chromatogram of repetitive experimenta sample 表3　重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表 Table 3　The results of repetitive experimental

編號相似度(對照圖譜)11.00021.00031.00041.00051.00061.000

2.4.3指紋圖譜及技術(shù)參數(shù)

2.4.3.1系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)

(1)理論板數(shù)(n)的測定

取牡荊素葡萄糖苷對照品溶液注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定，牡荊素葡萄糖苷峰理論板數(shù)為12278。考慮到不同色譜柱之間的差異，將理論板數(shù)暫訂為以牡荊素葡萄糖苷峰計(jì)不得少于5000。

(2)分離度

取供試品溶液注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定，牡荊素葡萄糖苷峰與相鄰峰的分離度分別為5.2和3.1。

2.4.3.2樣品測定及對照圖譜的建立

(1)不同產(chǎn)地山楂葉藥材的測定

分別取采集于安徽合肥、山西晉城及北京等11個(gè)產(chǎn)地的山楂葉藥材，按上述供試品溶液制備方法制成供試品溶液，按上述確定的色譜條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同產(chǎn)地山楂葉藥材之間存在較大差異。其中采集于山西的山楂葉藥材，按上述方法實(shí)驗(yàn)得到的色譜圖中，色譜峰較多，色譜信息較豐富，考慮選擇該產(chǎn)地不同采集時(shí)間的山楂葉藥材進(jìn)行研究。

(2)同一產(chǎn)地山楂葉藥材的測定

取不同時(shí)間采集于山西晉城的20批山楂葉對照藥材粉末1 g，分別按上述供試品溶液制備方法制成供試品溶液，再取上述對照品溶液，注入液相色譜儀，測定，20批藥材測定所得色譜圖，輸入中藥指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)A中，分析處理，生成對照圖譜，見圖2。

圖2　20批樣品匹配圖譜Fig.2　Match mapping 20 batches of samples

試驗(yàn)結(jié)果表明，指紋圖譜是控制藥材整體質(zhì)量的重要指標(biāo)，按上述方法測定20批不同時(shí)間采集于山西晉城的山楂葉藥材樣品，通過相似度軟件計(jì)算，相似度均在0.90以上，相似度較高，經(jīng)過方法學(xué)考察，供試品溶液較穩(wěn)定，重復(fù)性較好。

3　討　論

3.1供試品制備

我們采用50%乙醇、三氯甲烷、甲醇等溶劑回流提取，結(jié)果以50%乙醇回流提取，除上述對照品色譜峰外，較其它方法出現(xiàn)的色譜峰多，信息量大，更能全面反應(yīng)出樣品中各指標(biāo)性成分。因而選擇50%乙醇作為供試品溶液提取溶劑，并對提取時(shí)間和方法做了研究，最終確定最佳制備方法。

3.2色譜條件的篩選

試驗(yàn)中初始采用四氫呋喃-甲醇-乙腈-乙酸-水(38:3:3:4:125)為流動相進(jìn)行等梯度洗脫，但總體上看，色譜峰較少，信息量小，難以作為山楂葉指紋圖譜色譜條件；參照有關(guān)文獻(xiàn)[13-18]，乙腈-水系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫，結(jié)果各成分色譜峰未能達(dá)到較好分離；試驗(yàn)中我們又把水改為0.05%磷酸水溶液，結(jié)果各色譜峰分離度有所改善，且峰形較好，理論塔板數(shù)較高。供試品色譜中，色譜峰較多，信息量大，分析時(shí)間短，色譜分離好。

3.3檢測波長的確定

用DAD檢測器進(jìn)行全波段掃描，提取DAD掃描圖譜，比較分析。結(jié)果顯示：牡荊素、牡荊素葡萄糖苷及牡荊素異鼠李糖苷對照品均在(340±2) nm波長處有最大吸收，金絲桃苷對照品在358 nm波長處有最大吸收，供試品色譜中在320 nm波長處色譜峰較多，色譜分離較好，信息相對較充分，考慮到供試品色譜中其它物質(zhì)色譜峰的檢出，因此選擇320 nm作為測定波長。

4　結(jié)　論

以山西晉城產(chǎn)山楂葉藥材指紋圖譜顯示色譜峰較多，色譜信息較豐富，并確定山楂葉藥材指紋圖譜測定方法。該方法操作簡便，重現(xiàn)性和精密度較好，且各峰分離度較好，確定共有峰11個(gè)。按中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)，供試品指紋圖譜與對照指紋圖譜經(jīng)相似度計(jì)算，相似度應(yīng)不得低于0.90。

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Study on HPLC Fingerprint of Crataegi Folium*

LIXiao-liang1,NIUHai-jun1,GEDe-zhu2,DIANLian-feng2,ZHANGYan-peng2

(1 Jiufang Pharmacy Research Institute of Anhui Co., Ltd., Anhui Hefei 230088;2Anhui Jiren Pharmaceutical Co., Ltd., Anhui Bozhou 236800, China)

In order to study and establish the Crataegi Folium fingerprint determination method, in different regions and different collecting time of Crataeg iFolium, the mobile phase consisted of acetonitrile and 0.5% phosphoric acid solution (70:30) was used as gradient elution for separation with RP-HPLC, flow rate of 1.0 mL·min-1, detection wavelength of 320 nm, the fingerprints of sample was detected. Results showed that the contents of Crataegi Folium had more difference from different regions, Shanxi Jincheng Crataegi Folium had more chromatographic peak. This method was simple and had good reproducibility and precision, and the peak had good separating degree, 11 peaks were confirmed. HPLC fingerprint spectrum of Crataegi Folium was established in order to provide reference for its quality control.

Crataegi Folium; RP-HPLC; fingerprint

安徽省重大專項(xiàng)資金(項(xiàng)目編號：15CZZ04082)。

李曉亮(1979-)，男，主管藥師，研究方向：中藥新劑型開發(fā)及質(zhì)量控制。

R284.1

A

1001-9677(2016)017-0127-03