壬基酚分子印跡聚合物的制備及其識別特性的研究

孟 磊，蘇 惠，韋 朋，袁志華, 趙仲麟,馬斌強, 袁 超

(1.河南農業(yè)大學理學院, 河南 鄭州 450002； 2. 河南農業(yè)大學機電工程學院；河南 鄭州 450002)

壬基酚分子印跡聚合物的制備及其識別特性的研究

孟 磊1，蘇 惠1，韋 朋1，袁志華2, 趙仲麟1,馬斌強1, 袁 超1

(1.河南農業(yè)大學理學院, 河南 鄭州 450002； 2. 河南農業(yè)大學機電工程學院；河南 鄭州 450002)

為了分離測定環(huán)境雌激素壬基酚，本研究以壬基酚為模板分子，α-甲基丙烯酸為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯劑，偶氮二異丁腈為引發(fā)劑制備了壬基酚印跡聚合物。采用動態(tài)和靜態(tài)兩種方法研究了該印跡材料對壬基酚的結合性能與分子識別特性。結果表明，印跡材料對模板分子壬基酚具有良好的特異性識別作用，經過Scatchard模型分析，壬基酚印跡聚合物上有兩類不同性質的結合位點，2種結合位點的解離常數分別為1.99、32.05 mL·g-1，對壬基酚的最大表觀吸附量分別為29.72、240.38 μmol·g-1。將該聚合物應用于固相萃取中，以鯉魚～為樣品的加標回收實驗表明，此印跡聚合物可以對痕量壬基酚進行富集分離測定，且可重復使用。

分子印跡聚合物；壬基酚；固相萃取

壬基酚(Nonylphenol ，NP)作為非離子表面活性劑，廣泛應用于造紙、紡織，橡膠塑料，洗衣粉和洗滌劑等行業(yè)，與人們的日常生活關系密切；同時壬基酚又是一種重要的環(huán)境雌激素，可以通過雌激素效應對魚類、兩棲動物及哺乳動物的生殖系統(tǒng)產生危害，NP毒性持久，危害潛伏時間長，其危害日益受到人們的廣泛關注，因此加強對壬基酚的監(jiān)測具有現實意義[1-3]。然而，待檢測的含有NP的實際樣品通?；|復雜，為了減少復雜基質的干擾，對實際樣品的分析往往需要一個樣品前處理步驟來分離富集目標分析物。但在對復雜樣品基底檢測時很難進行單一組分的檢測，因此亟待開發(fā)出一種具有高選擇性和高靈敏性的分離檢測手段。分子印跡聚合物(Molecularly imprinted polymers, MIPs)是近年來發(fā)展的一類具有專一識別、吸附目標分子的新型高分子材料，適用于復雜樣品的前處理。樣品前處理對于樣品檢測有著非常重要的意義，而傳統(tǒng)的液液萃取，加速溶劑萃取[4-7]等方法不僅操作復雜，有機溶劑消耗大，而且有時很難將檢測物質從復雜的樣品環(huán)境中分離出來，而分子印跡固相萃取技術克服了傳統(tǒng)方法的缺陷，簡化了前處理的過程，減少了有機溶劑的消耗[8-10]。本研究以壬基酚為模板分子，α-甲基丙烯酸為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯劑，偶氮二異丁腈為引發(fā)劑制備了壬基酚印跡聚合物。并深入考察了該印跡聚合物對壬基酚的特異性結合性能，并將該印跡聚合物裝填成固相萃取柱，對實際樣品進行了富集、分離和測定，取得了良好的效果。為環(huán)境監(jiān)測部門分離測定壬基酚提供了一種可靠的方法。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑

壬基酚(NP)、雙酚A(BPA)、苯酚(Ph)、α-甲基丙烯酸(MAA)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)、偶氮二異丁氰(AIBN)(以上均為阿拉丁試劑)、甲苯(AR)、甲醇(AR)、冰醋酸、乙醇(AR)、超純水。

SHZ-82型水浴恒溫振蕩器(金壇市醫(yī)療儀器廠)、SB-120DT型超聲儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)、H-1650型離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)、NEXUS-670型傅里葉變換紅外光譜(FTIR)儀(Thermo Nicolet公司)、 JSM-7500F型掃描電子顯微鏡(SEM)(日本JEOL公司)、TU-1901型雙光束紫外可見分光光度儀(北京普析通用儀器有限責任公司)、Waters2695高效液相色譜儀(Waters公司)。

1.2壬基酚分子印跡聚合物的制備

將220.35 mg壬基酚、240 mg α-甲基丙烯酸和10 mL乙醇加入100 mL帶塞錐形瓶，在25 ℃恒溫水浴振蕩器中振蕩4 h。再加入1.5 mL乙二醇二甲基丙烯酸酯和55mg偶氮二異丁腈，超聲處理20 min。放入60 ℃水浴中聚合24 h，得白色固體狀聚合物。用200 mL體積比為1∶9的冰醋酸-甲醇混合溶液索氏提取48h后，用甲醇洗滌24 h，除去冰醋酸。放干燥箱內干燥24 h，得白色壬基酚分子印跡聚合物MIPs。

按此方法不加印跡分子壬基酚制得空白聚合物NIPs。

1.3壬基酚分子印跡聚合物結合性能實驗

1.3.1 平衡吸附 分別準確稱取壬基酚MIPs和NIPs各35 mg，置于100 mL碘量瓶中，分別加入25 mL10～375 mg·L-1不同質量濃度的壬基酚-乙醇溶液，混合超聲5min后于25 ℃恒溫水浴振蕩器中震蕩12 h，取上層清液過濾后用紫外分光光度法在278 nm處測定壬基酚的濃度，計算吸附量Q：

Q= (c0-cs)V/m

(1)

式中：c0為壬基酚初始濃度，mmol·L-1；cs為靜態(tài)吸附后溶液中壬基酚濃度，(mmol·L-1)；V為壬基酚溶液體積，mL；m為聚合物質量，g。

1.3.2 吸附動力學實驗 分別準確稱取壬基酚MIPs和NIPs各35 mg，置于100 mL碘量瓶中，分別加入25 mL 65 mg·L-1的壬基酚-乙醇溶液，混合超聲5 min后于25 ℃恒溫水浴振蕩器中震蕩4 h，期間每隔1 h取上層清過濾后用紫外分光光度法在278 nm處測定壬基酚的濃度，計算不同時間段內MIPs和NIPs對模板分子壬基酚的吸附量，以吸附量Q對時間t作圖，得到吸附動力學曲線。

1.3.3 吸附的選擇性 為考察印跡聚合物的選擇性，以雙酚A、苯酚與壬基酚為研究對象。它們都具有酚羥基結構，分子形狀和大小相似，同屬環(huán)境雌激素，故以雙酚A，苯酚為底物競爭吸附物質進行吸附實驗，考察印跡聚合物是否具有專一吸附性。

稱取3份印跡聚合物各35 mg，加入配好的0.1 mmol·L-1，的壬基酚、苯酚和雙酚A的甲醇溶液中，超聲混合后置于25 ℃恒溫水浴振蕩器中震蕩，12 h后用紫外分光度法測定吸收后溶液中壬基酚、雙酚A和苯酚的濃度。計算印跡聚合物對3種物質的吸附量。

對于非印跡材料做法同上。

1.3.4 分子印跡-固相萃取柱的制備 準確稱取100 mg制備的MIPs和NIPs分別填充于聚丙烯固相萃取空柱，一端事先放一聚乙烯篩板，壓緊聚合物并使表面平齊后加入另一篩板壓實。裝好的柱子用2倍體積的洗脫液(冰醋酸-甲醇體積比為1∶9)洗去模板分子，再用甲醇洗脫除去洗脫液后烘干備用。

1.3.5 樣品處理

1.3.5.1 標準曲線 準確稱取250 mg壬基酚于25 mL容量瓶，用甲醇定容。配制成0.1～5 mg·L-1系列質量濃度的NP溶液，采用HPLC進行分析，以峰面積對含量計算回歸曲線。

1.3.5.2 樣品處理 將新鮮鯉魚腮和魚肉分別置于料理機中絞碎成魚泥。取10 mL甲醇于10 g魚泥中超聲振蕩20 min，再以3 000 r·min-1離心10 min，取上層清液，待凈化。

移取樣品提取液加入已活化的固相萃取小柱中，使其緩慢通過小柱；最后用10 mL甲醇分3次洗脫吸附在固相萃取小柱上的待測物，收集洗脫液。洗脫液于常溫下于通風櫥揮干，用1 mL無水乙醇溶解洗滌殘留物，轉移至10 mL棕色容量瓶并用無水乙醇定容，供HPLC分析。

2 結果與分析

2.1印跡材料的表征

圖1為MIPs的掃描電鏡圖。從圖1可以看出，聚合物的粒度均一，為單分散的分子印跡微球。圖2為MIPs和NIPs的FTIR譜圖。由圖2可以看出，MIPs的主要紅外吸收峰分別在3 435.93 、2 988.14、2 359.61、1 727.06、1 637.52、1 398.13 cm-1處。

圖1 MIPs 的電鏡圖 Fig.1 Scanning electron micrograph of molecular imprinted polymermicrospheres

NIPs的主要紅外吸收峰分別在3 442.74、2 990.65、2 361.27、1 727.85、1 639.28、1 399.13 cm-1處。

圖2 MIPs和NIPs的紅外譜圖Fig.2 FT-IR spectra of MIPs and NIPs

2.2平衡吸附實驗及Scatchard分析

采用靜態(tài)平衡吸附法來考察分子印跡聚合物對壬基酚的吸附能力。由圖3可知隨著壬基酚濃度的不斷增大，MIPs和NIPs對壬基酚的吸附量都增加，但MIPs的吸附量明顯高于NIPs，而且NIPs的吸附量增加的趨勢相對于MIPs也較緩慢，兩者的吸附效果具有明顯差異，說明MIPs對模板分子的親和能力較強，具有更高的吸附容量。

Scatchard一直是分析分子印跡聚合物吸附性能的經典方法，其方程可表示為：

(2)

式中：Qmax為最大表觀吸附量μmol·g-1，Kd為印跡聚合物的平衡解離常數mL·g-1，Q為平衡吸附量μmol·g-1，c為吸附后模板分子的平衡濃度(mmol·L-1)。

它是通過將競爭結合曲線轉換成直線，從而得到印跡聚合物對模板分子結合位點的個數以及聚合物的最大表觀結合量。圖4是根據Scatchard模型對MIPs的結合特性分析得到的。從圖4可以看出，Scatchard分析圖有2個明顯不同的曲線，對這2段線性部分進行擬合得方程分別為y=-0.501 1x+ 14.892 0和y=-0.031 2x+ 7.499 7，(其中，x為質量濃度，y為表觀吸附量)這說明MIPs對壬基酚的吸附存在2類不同的結合位點，其中高親和性結合位點的解離常數和最大表觀吸附量為29.72 mL·g-1和240.377 5μmol·g-1，低親和性結合位點的解離常數和最大表觀吸附量為1.99 mL·g-1和32.05μmol·g-1。

圖3 MIPs和NIPs的吸附等溫線Fig.3 Adsorption isotherms of MIPs and NIPs adsorbing NP

圖4 MIPs的Scatchard曲線Fig.4 Scatchard’s polt for MIPs

2.3吸附動力學

如圖5所示，隨著吸附時間的延長，MIPs和NIPs對壬基酚的吸附量逐漸增加。對MIPs來說，吸附6 h后達87.48%，此后吸附量幾乎達到飽和。由此可推測，聚合物中帶有識別位點且能與模板分子相互匹配的三維空穴大都存在于聚合物的表面，且形成的空穴體積較大。因此可以快速地吸附目標化合物。而且可以觀察到MIPs的吸附量遠大于NIPs，說明在MIPs中形成了有效識別壬基酚的特異性結合位點，實現了對壬基酚的特異性吸附。

圖5 MIPs和NIPs的吸附吸附動力學曲線Fig.5 Adsorption kinetics curve of MIPs and NIPs

2.4吸附選擇性

圖6是MIPs和NIPs在相同時間范圍內對三種化合物的吸附量比較，可以看出NIPs對3種物質的吸附量都小于MIPs，但都對壬基酚的吸附量是最大的，對BPA，Ph的吸附要差一些。這是因為在制備印跡聚合物時是以壬基酚為模板的，當除去模板分子后形成的空穴和識別位點都是與壬基酚相匹配的，所以能快速吸附目標分子。而對于壬基酚結構類似的物質，雖然也存在相似的識別位點，但空穴的影響也是一個重要因素，因此印跡聚合物只能部分識別BPA和Ph，這也說明了所制備的印跡聚合物具有較好的專一吸附能力。

圖6 BPA、NP、Ph在MIPs和NIPs上的相對吸附量Fig.6 Relative binding isotherms of BPA，NP and Ph on MIPs and NIPs

2.5實際樣品分析

為檢驗已制備的印跡聚合物-固相萃取柱的實際應用性能，用高效液相色譜法在流動相V(甲醇)∶V(水)=75∶25，檢測波長為278 nm，流速：1.0 mL·min-1條件下采用加標回收法測定了鯉魚中的壬基酚含量，每個樣品分別測定3次。均未測出NP，測定結果如表1所示，回收率在93.50%～108.00%之間，相對標準偏差為1.5%～3.1%，說明了MIPs聚合物富集分離鯉魚中的壬基酚的可行性，而且該固相萃取柱經處理后重復使用10次，回收率并未明顯降低，證明所制備的聚合物比較穩(wěn)定，再生性能較好，可以重復使用。

表1 鯉魚中壬基酚含量和回收率Table 1 Contents and recoveries of nonylphenol A in carp

注：-表示未檢出。Note:-Not detected.

3 結論

為了分離測定環(huán)境雌激素壬基酚，本研究采用以NP為模板分子，MAA 為功能單體， EDMA為交聯劑，AIBN 為引發(fā)劑，甲苯為溶劑，沉淀聚合法合成了MIPs。通過靜態(tài)、動態(tài)和吸附選擇性實驗考察了該聚合物對壬基酚具有特異性強，吸附性好等特點。經過Scatchard模型分析，壬基酚印跡聚合物上有2類不同性質的結合位點，2種結合位點的解離常數分別為1.99、32.05 mL·g-1，對壬基酚的最大表觀吸附量分別為29.72、240.38 μmol·g-1。并將該聚合物制成固相萃取柱對鯉魚中的壬基酚進行了富集、分離和測定，回收率在93.50%～108.00%之間，而且該固相萃取柱重復使用10次后回收率并未明顯降低，表明所制備的聚合物比較穩(wěn)定，再生性能好，可以重復使用，可作為新型固相萃取填料對壬基酚進行分離、富集和測定，為環(huán)境監(jiān)測部門提供了一種可行的方法。

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(責任編輯：蔣國良)

Studyonpreparationofnonylphenolmolecularimprintedpolymersanditsrecognitioncharacter

MENG Lei1, SU Hui1, WEI Peng1, YUAN Zhihua2, ZHAO Zhonglin1, MA Binqiang1, YUAN Chao1

(1.College of Sciences, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China; 2. College of Mechanical and Electrical Engineering, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002,China)

The molecularly imprinted polymers (MIPs) were prepared by using nonylphenol (NP) as template，α-methylacrylic acid as functional monomer，ethylene glycol dimethyl acrylate as the crosslinking agent, azobisisobutyronitrile as initiator, and toluene as solvent. Then the static and dynamic experiment results showed that MIPs had specific recognition selectivity and excellent binding selectivity for the template molecule. Scatchard analysis indicated that the nonylphenol imprinted polyer had two kinds of recognitionsites, the dissociation constant being 1.99 and 32.05 mL·g-1, the apparent maximum absorption capacity being 29.72 and 240.38 μmol·g-1, respectively. Besides, in a recovery experiment by adding standard samples with carp, the result shows that imprinted material of NP can enrich and separate for trace amounts of NP, and it is also easy to be used repeatedly.

molecularly imprinted polymers；nonylphenol；solid-phase extraction

TS201

：A

2015-09-12

河南省教育廳科技研究重點項目(12A150012);鄭州市科技攻關項目(083SGYG-24123-3)

孟 磊(1970-)，女，河南鄭州人，副教授，碩士，主要從事分析化學和食品安全方面的研究。

袁 超(1961-)，男，河南開封人，副教授。

1000-2340(2016)02-0214-05