豬IL-18增強豬細小病毒滅活疫苗豬體細胞免疫效果的研究

韓 麗，何瀟湘,，王瑞寧，曹貝貝，耿靜微，陳紅英,，魏戰(zhàn)勇,

(1. 河南農業(yè)大學牧醫(yī)工程學院，河南 鄭州 450002；2. 河南省動物性食品安全重點實驗室，河南 鄭州450002)

豬IL-18增強豬細小病毒滅活疫苗豬體細胞免疫效果的研究

韓 麗1，何瀟湘1,2，王瑞寧2，曹貝貝1，耿靜微2，陳紅英1,2，魏戰(zhàn)勇1,2

(1. 河南農業(yè)大學牧醫(yī)工程學院，河南 鄭州 450002；2. 河南省動物性食品安全重點實驗室，河南 鄭州450002)

為了研究豬白細胞介素18是否增強豬細小病毒(PPV)滅活疫苗在豬體免疫效果，分別將豬白細胞介素18與自制豬細小病毒滅活疫苗和豬細小病毒滅活疫苗聯(lián)合免疫仔豬，并設豬白介素18和生理鹽水對照組。免疫后分別用間接ELISA方法和流式細胞技術檢測仔豬抗體水平變化和仔豬外周血T淋巴細胞亞群動態(tài)變化。結果顯示，免疫后豬白細胞介素18聯(lián)合滅活疫苗組抗體水平與無豬白介素18滅活疫苗組相似，但免疫后豬白介素18聯(lián)合PPV滅活疫苗組的CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴細胞所占比值均高于相應的PPV滅活疫苗組，但差異不顯著,且CD4+/CD8+在正常范圍內。研究證實豬白介素18主要增強PPV油乳劑滅活疫苗的細胞免疫應答。

豬白細胞介素18；豬細小病毒；滅活疫苗

豬細小病毒病是由豬細小病毒(Porcine Parvovirus, PPV)感染引起的妊娠母豬繁殖障礙性疾病。該病毒主要導致初產母豬出現(xiàn)不孕、流產、產死胎、木乃伊胎及弱胎等臨床癥狀。豬細小病毒病廣泛存在并流行于世界各地養(yǎng)豬場，嚴重制約了養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，給全球養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經濟損失。PPV的感染尚無有效的治療方法，疫苗免疫預防仍是控制該病的主要手段。目前，PPV疫苗主要包括滅活疫苗、弱毒疫苗、基因工程亞單位疫苗、基因工程活病毒載體疫苗等，其中滅活疫苗具有安全性好、產生抗體時間長、不需要低溫保存的優(yōu)點；弱毒疫苗免疫效力較強、產生抗體快、用量少、成本低，但安全性較差；基因工程亞單位疫苗免疫源性較好，但成本和技術要求都比較高；基因工程活病毒載體疫苗可以同時預防兩種病或多種病的、能夠誘導較強的免疫反應，但生產技術復雜、 成本較高；基因疫苗生產工藝簡單、免疫劑量小、成本低廉、可構建多基因或多價疫苗，但其安全性受到廣泛關注[1-3]。目前使用最廣泛的豬細小病毒病疫苗是滅活疫苗。滅活疫苗具有安全性好、保護力持久等優(yōu)點，但也存在免疫應激強、有效免疫抗體產生慢、引起細胞免疫弱甚至無法引起細胞免疫等諸多問題。因此，開發(fā)一種安全、高效的滅活疫苗免疫增強劑對豬細小病毒病的防制至關重要。豬白細胞介素18(Interleukin-18，IL-18)是在一種具有多種生物學活性的蛋白質[4]。它既能增強抗原的免疫原性，又能作用于體內免疫細胞，促進其分化、增殖，具有較好的疫苗免疫佐劑效應，在提高免疫應答水平方面發(fā)揮著重要作用，是一種重要的細胞免疫調節(jié)因子。IL-18能使HBV核酸疫苗誘導的免疫反應向Thl型為主的細胞免疫反應轉變，并增強特異性的CTL反應[5]。故可以用IL-18聯(lián)合PPV滅活疫苗來增強豬體的細胞免疫，從而彌補滅活疫苗的不足。由于IL-18可通過對IFN-γ的誘導作用，促進MHC I類分子的表達,因此可作為免疫佐劑增強疫苗的免疫效果[6]。本實驗通過PPV特異性IgG抗體、豬外周血CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴細胞亞群百分數(shù)指標的檢測，研究了其對豬體免疫效果的影響，為新型免疫增強劑的開發(fā)提供了理論基礎和試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試劑及儀器

豬細小病毒ELISA診斷試劑盒(PPV ELISA KIT 96T,NC27606 USA)購自BioXL公司；Multiskan MK3型酶標儀購自Therm公司)；FACsort流式細胞儀(Becton Dickinson,USA)；大鼠抗小鼠CD3+、CD4+和CD8+T細胞亞群單克隆抗體以及異硫氰酸熒光素(FITC)標記兔抗大鼠IgG抗體購自北京邦定泰克生物技術有限公司。

1.2疫苗

豬細小病毒油乳劑滅活疫苗購自中牧實業(yè)股份有限公司(批號1009006-2)；自制豬細小病毒油乳劑滅活疫苗，滅活病毒的血凝(HA)效價為1∶29。

1.3豬白細胞介素18

由河南省動物性食品安全重點實驗室構建的重組質粒pcDNA-IL18，已經被證實具有一定的生物學活性[7]。經試驗測定，豬白細胞介素18免疫仔豬的最佳免疫劑量為2 mL·頭-1。

1.4安全性檢驗

1.4.1 小鼠的安全性檢驗 取10 d SPF健康昆明乳鼠15只，分3組，每組5只。將自制豬細小病毒油乳劑滅活疫苗和豬白介素18分別皮下接種每組小鼠，每只0.1 mL，另外1組設不接種對照組。觀察2周，看是否出現(xiàn)不良反應；如無異常則證明該疫苗和白介素18對乳鼠安全。

1.4.2 仔豬的安全性檢驗 取PPV陰性健康仔豬9頭，分3組，每組3頭。將自制豬細小病毒油乳劑滅活疫苗及豬白細胞介素18分別肌肉注射每組仔豬，每頭接種10 mL，另外1組設不接種對照組。觀察2周，看是否出現(xiàn)不良反應。如無異常則證明該疫苗和白介素18對仔豬安全。

1.5試驗動物及免疫

試驗所用30頭35日齡斷奶仔豬(由鄭州市某豬場提供)隨機分為6組，每組5頭，經ELISA檢測，PPV抗體陰性。試驗分組及免疫情況見表1。

1.6特異性抗體水平測定

應用間接ELISA方法，按照豬細小病毒ELISA診斷試劑盒(BioXL)說明書用試劑盒檢測仔豬血清中PPV特異性IgG抗體。

1.7外周血T淋巴細胞亞群測定

免疫后0、1、2、3、4周，每組分別隨機挑選2頭仔豬，前腔靜脈采血2 mL于含檸檬酸鈉抗凝劑的采血管中，分離淋巴細胞并計數(shù)，用無菌PBS溶液將細胞濃度調至5.0×106個·mL-1。用流式細胞儀檢測分別檢測其CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴細胞亞群含量。

表1 試驗分組及免疫情況Table 1 Grouping and vaccination of tested pigs

2 結果與分析

2.1安全性檢驗結果

2.1.1 小鼠安全性檢驗 接種小鼠觀察2周，小鼠精神食欲正常，無不良反應，注射部位沒有出現(xiàn)紅腫，瘙癢，破潰等局部反應。

2.1.2 仔豬安全性檢驗 接種健康仔豬觀察2周，豬群體溫正常、采食、精神正常，注射部位未發(fā)現(xiàn)腫塊，無不良反應。證明該自制疫苗和白細胞介素18對仔豬安全。

2.2特異性抗體水平測定

采用PPV診斷試劑盒分別對每周采集分離的血清進行PPV特異性IgG抗體水平的檢測，對各試

驗組所測數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，得到豬細小病毒IgG抗體消長的規(guī)律(圖1)。從圖1可以看出，免疫后各疫苗組IgG抗體水平均逐漸上升，并在第4周達到峰值，豬白細胞介素18組及生理鹽水組抗體水平無顯著變化。免疫后第3～5周，豬白細胞介素18聯(lián)合PPV滅活疫苗組的抗體效價高于相應的滅活疫苗免疫組，但差異不顯著。滅活疫苗免疫組的抗體水平與生理鹽水對照組差異顯著(P<0.05)，豬白細胞介素18對照組與生理鹽水對照組差異不顯著。

疫苗接種后時間/周Time after vaccination

2.3外周血T淋巴細胞亞群動態(tài)變化

2.3.1 免疫仔豬外周血CD3+T淋巴細胞動態(tài)變化 免疫后各組CD3+T淋巴細胞百分比值均出現(xiàn)了動態(tài)的變化(如圖2-A)。從圖2-A可見，豬白細胞介素18聯(lián)合PPV滅活疫苗的CD3+T淋巴細胞的所占比值高于相應的無豬白細胞介素18 PPV滅活疫苗組，但差異不顯著(P>0.05)。在免疫后第3～4周，各免疫組與生理鹽水對照組差異顯著(P<0.01)。

疫苗接種后時間/周Time after vaccination

2.3.2 免疫仔豬外周血CD3+CD4+T淋巴細胞動態(tài)變化 免疫后各組CD3+T淋巴細胞百分比值均出現(xiàn)了動態(tài)的變化(如圖2-B)。從圖2-B可見，豬白細胞介素18聯(lián)合PPV滅活疫苗組的CD3+CD4+T淋巴細胞所占比值高于相應的無豬白細胞介素18聯(lián)合PPV滅活疫苗組，豬白細胞介素18對照組高于生理鹽水對照組，但差異均不顯著(P>0.05)。

2.3.3 免疫仔豬外周血CD3+CD8+T淋巴細胞動態(tài)變化 免疫后各組CD3+T淋巴細胞百分比值均出現(xiàn)了動態(tài)的變化(如圖2-C)。從圖2-C可見，豬白細胞介素18聯(lián)合PPV滅活疫苗組的CD3+CD8+T淋巴細胞所占比值高于相應的無白細胞介素18 PPV滅活疫苗組，豬白細胞介素18對照組高于生理鹽水對照組，但差異均不顯著(P>0.05)。

2.3.4 免疫仔豬外周血CD4+/CD8+淋巴細胞動態(tài)變化 CD4+/CD8+的正常比值范圍為1.0～2.87，過高或過低都反映機體免疫功能紊亂。從圖3可見，豬白細胞介素18聯(lián)合PPV滅活疫苗組的(CD4+/CD8+T淋巴細胞比值)均趨于正常范圍，說明沒有對機體免疫功能造成壞的影響。

疫苗接種后時間/周Time after vaccination

3 討論

IL-18能誘導淋巴細胞產生IFN-γ[8]，IFN-γ是IL-18誘導抗病毒免疫的介導因子[9]。IL-18可通過誘導CD4+、CD8+T淋巴細胞而明顯提高細胞免疫和體液免疫功能，從而有效地發(fā)揮IL-18的免疫佐劑作用。而且，IL-18能夠促進Th1類細胞因子的表達,促進機體誘導特異性Th1細胞和CTL細胞反應，增強機體的特異性細胞免疫功能[5]。IL-18還能顯著提高T淋巴細胞的轉化率，提高機體的細胞免疫水平。IL-18的早期應用還能起到防御病毒入侵和保護心肌的作用[10]。因此，本試驗就通過用豬白介素18作為免疫增強劑來增強豬細小病毒滅火疫苗在豬體的細胞免疫功能。

間接ELISA方法檢測免疫后仔豬血清PPV抗體動態(tài)變化，結果顯示豬白細胞介素18聯(lián)合PPV滅活疫苗組抗體效價均高于相應的滅活疫苗單獨免疫組，并呈持續(xù)增長趨勢，在第3、4周抗體效價顯著增高(P<0.05)。豬白細胞介素18單獨免疫組的抗體效價在免疫后第4-6周上升比生理鹽水對照組高。結果表明，豬白細胞介素18能夠增強PPV滅活疫苗的體液免疫應答強度。

T淋巴細胞亞群是構成機體免疫系統(tǒng)的重要成分。CD3分子是存在于所有成熟T淋巴細胞膜表面的重要分化抗原，是成熟T細胞的特征性標志，其主要功能是傳遞T細胞活化信號[11-12]。CD4+T淋巴細胞是免疫系統(tǒng)的主要調節(jié)細胞，能分泌多種細胞因子，具有誘導和增強免疫應答的作用[13-14]。CD3+、CD4+淋巴細胞亞群激活后可增殖分化為Th1和Th2 效應細胞，并通過表達不同的細胞因子介導各自的免疫功能[13-15]。本研究利用流式細胞技術檢測免疫后各組仔豬脾臟T淋巴細胞亞群的動態(tài)變化，評價豬白細胞介素18對PPV滅活疫苗的細胞免疫水平的影響。結果顯示，豬白細胞介素18 聯(lián)合PPV滅活疫苗組的CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴細胞所占比值均高于相應的PPV滅活疫苗免疫組。免疫后21～28d，豬白細胞介素18聯(lián)合PPV滅活疫苗試驗組的CD4+T淋巴細胞數(shù)與相應的滅活疫苗單獨免疫組差異顯著(P<0.05)。免疫后第21天，豬白細胞介素18聯(lián)合PPV滅活疫苗組的CD8+T淋巴細胞所占比值比相應的滅活疫苗單獨免疫組高，且差異顯著(P<0.05)。從本研究的CD4+、CD8+T淋巴細胞比值變化情況看，CD4+T淋巴細胞在豬白細胞介素18增強細胞免疫應答中發(fā)揮著重要作用，表明豬白細胞介素18佐劑主要通過CD4+T淋巴細胞介導作用增強仔豬的細胞免疫應答。各免疫組免疫仔豬后，豬白細胞介素18聯(lián)合PPV滅活疫苗組的CD4+、CD8+T淋巴細胞比值比相應的滅活疫苗單獨免疫組高。研究結果表明，白細胞介素18能夠提高PPV油乳劑滅活疫苗的體液免疫水平細胞，同時還能增強PPV油乳劑滅活疫苗的細胞免疫應答強度，證明豬白細胞介素18能夠被用作PPV油乳劑滅活疫苗的免疫增強劑。

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(責任編輯：蔣國良)

Enhancingimmuneresponsestoinactivatedporcineparvovirusoilemulsionvaccinebyco-inoculatingporcineinterleukin18inporcine

HAN Li1, HE Xiaoxiang1,2, WANG Ruining2, CAO Beibei1, GENG Jingwei2, CHEN Hongying1,2, WEI Zhanyong1,2

(1. College of Animal Husbaudry and Veterinary Science， Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002,China； 2. Key Laboratory for Animal-derived Food Safety of Henan Province, Zhengzhou 450002, China)

The objective of this study is to characterize the enhancing immune responses to inactivated porcine parvovirus(PPV) oil emulsion vaccine by co-inoculating porcine interleukin 18 (IL-18) in porcine. In this study, the immunogenicity of PPV vaccine and the immuno-regulatory activities of IL-18 were investigated. The inactivated PPV vaccines with or without IL-18 were inoculated into piglet by subcutaneous injection. Then humoral and cellular immune responses were evaluated by indirect enzyme-linked immunosorbent assays(ELISA) and fluorescence-activated cell sorter analyses (FACS). The results demonstrated that after immunity, the swine IL-18 joint inactivated vaccine group antibody levels were similar to inactivated vaccine without IL-18, and the T lymphocyte ratio of swine IL-18 joint PPV inactivated vaccine group CD3+,CD3+CD4+,CD3+CD8+were higher than PPV inactivated vaccine group,but the difference was not significant. In conclusion, these results suggest that IL-18 possess better cellular immune-enhancing capability and can be exploited into an effective immune-adjuvant for inactivated vaccines.

porcine interleukin 18; porcine parvovirus; inactivated vaccine

S852.4

：A

2015-12-12

河南省重大科技攻關項目(132102110034)；河南省科技開放合作項目(142106000042)

韓 麗(1989-)，女，河南南陽人，碩士研究生，主要從事動物分子病毒學研究。

魏戰(zhàn)勇(1975-)，男，河南安陽人，教授，碩士生導師。

1000-2340(2016)02-0224-05