基于雙單倍體群體的玉米株高和穗位高QTL分析

李浩川，陳 瓊，楊繼偉，曲彥志，張 慧，張朝林，李 彥，賈 璽，劉宗華

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.靈寶市農(nóng)業(yè)局，河南 靈寶 472500)

基于雙單倍體群體的玉米株高和穗位高QTL分析

李浩川1，陳 瓊1，楊繼偉1，曲彥志1，張 慧1，張朝林1，李 彥1，賈 璽2，劉宗華1

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.靈寶市農(nóng)業(yè)局，河南 靈寶 472500)

為了進(jìn)一步探明玉米株高和穗位高的遺傳基礎(chǔ)，利用鄭單958為基礎(chǔ)材料構(gòu)建的包含161個(gè)雙單倍體(Doubled haploid, DH)的群體，分別在長葛、淇縣進(jìn)行田間試驗(yàn)，采用復(fù)合區(qū)間作圖法對(duì)植株性狀進(jìn)行數(shù)量性狀位點(diǎn)(Quantitative trait locus, QTL)分析。分別檢測(cè)到7，11和6個(gè)株高、穗位高以及穗位系數(shù)(穗位高/株高)QTLs，貢獻(xiàn)率變幅分別為6.77%～21.31%，5.09%～17.12%和6.89%～17.78%，其中qph-3-3, qph-2-10, qeh-5-9以及qeh/qph-3-1為主效QTLs；株高和穗位高有4對(duì)共同標(biāo)記區(qū)間的QTLs，穗位系數(shù)與穗位高有3對(duì)共同標(biāo)記區(qū)間的QTLs，一定程度上揭示了株高和穗位高的遺傳相關(guān)性；株高和穗位高的廣義遺傳力高達(dá)88.52%和93.78%，表明株高和穗位高遺傳穩(wěn)定性強(qiáng)，受環(huán)境影響較小，是早代選擇的重要株型指標(biāo)。

玉米；雙單倍體；株高；穗位高；數(shù)量性狀位點(diǎn)

倒伏是制約玉米產(chǎn)量的重要因素之一，全球每年因倒伏使玉米產(chǎn)量損失5%～20%[1]。黃淮海夏玉米區(qū)在抽雄前后易受季風(fēng)氣候影響，因風(fēng)災(zāi)導(dǎo)致產(chǎn)量損失嚴(yán)重[2]。近年來，隨著機(jī)收面積的擴(kuò)大和機(jī)械化程度的提高，對(duì)玉米品種抗倒伏性要求越來越高。國內(nèi)外許多學(xué)者先后開展了玉米倒伏問題的相關(guān)研究。ALBRECHT等[3]研究認(rèn)為，莖稈抗倒伏能力隨著莖稈變粗、莖皮加厚而提高，隨著節(jié)間延長、植株增高而下降；莖粗對(duì)植株的抗倒伏能力影響最大，基部節(jié)間短而粗的則抗倒伏能力強(qiáng)。王永學(xué)等[4]利用相關(guān)和通徑分析研究表明，倒伏率與莖稈強(qiáng)度、莖粗呈負(fù)相關(guān)，與株高、穗位高、節(jié)間長、葉夾角呈正相關(guān)，入土的次生根數(shù)對(duì)倒伏率影響最大。付志遠(yuǎn)等[5]的研究結(jié)果表明,增加穗上節(jié)間數(shù)、適當(dāng)降低穗位高，可以提高玉米植株的抗倒伏性，認(rèn)為穗位系數(shù)即穗位高與株高的比值可以作為衡量植株抗倒伏性狀的一個(gè)重要指標(biāo)。大量研究表明，倒伏性與種植的密度、莖稈拉力、莖稈抗穿刺力、莖粗、株高、穗位高等都具有極顯著相關(guān)性[6-9]，尤其株高和穗位高通常被認(rèn)為是影響抗倒伏性的最重要的因素。盡管RADU等[8]利用雙列雜交試驗(yàn)對(duì)玉米抗倒伏性狀進(jìn)行遺傳分析，認(rèn)為抗倒伏遺傳變異占表型變異的79%，但在表型變異中，加性效應(yīng)僅占1.6%，上位效應(yīng)占55%。然而，株高和穗位高是典型數(shù)量性狀，有關(guān)其分子遺傳機(jī)制迄今仍不十分清楚。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，眾多學(xué)者分別利用不同分離群體，檢測(cè)到許多有關(guān)玉米株高和穗位高的QTL[9-11]。如李清超等[9]利用11個(gè)RIL群體，基于單環(huán)境、聯(lián)合環(huán)境的QTL分析，檢測(cè)到21個(gè)株高主效QTL和15個(gè)穗位高主效QTL；鄭克志等[10]對(duì)利用T 319與9406為親本構(gòu)建的242個(gè)RIL群體進(jìn)行分析，檢測(cè)到6個(gè)株高QTL和2個(gè)穗位高QTL。然而，這些研究由于各自所用材料和群體不同，結(jié)果不盡一致。雙單倍體(Doubled haploid, DH)系的應(yīng)用不僅能加速育種進(jìn)程，縮短育種周期，而且DH系不存在基因的顯性效應(yīng)，可對(duì)數(shù)量性狀基因的加性和上位性效應(yīng)進(jìn)行更加準(zhǔn)確的研究，同時(shí)DH系可以在多個(gè)環(huán)境或季節(jié)進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，是研究基因型與環(huán)境互作的理想材料。為了進(jìn)一步明確株高、穗位高的分子機(jī)制，本研究以DH群體為研究材料，結(jié)合簡單序列重復(fù)(Simple sequence repeat, SSR)分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)玉米株高、穗位高以及穗位高/株高進(jìn)行QTL分析，以期為抗倒伏品種選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

本研究以優(yōu)良玉米雜交種鄭單958為母本，以農(nóng)大高誘5號(hào)為父本，進(jìn)行雜交誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體，通過化學(xué)加倍和繁殖形成了161個(gè)DH系，以DH系構(gòu)成的群體及親本自交系鄭58和昌7-2為試驗(yàn)材料。2014年夏在長葛和淇縣種植，田間采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，單行區(qū)，2次重復(fù)，小區(qū)行長4 m，行距0.65 m，株距0.22 m，種植密度為67 500株·hm-2。前茬為小麥，土壤肥力均勻，田間管理同大田。

1.2DNA的提取和SSR標(biāo)記的分析

親本及DH群體的DNA提取采用吳向遠(yuǎn)等[13]改良的SLS方法。SSR引物選自Maize GDB數(shù)據(jù)庫，由上海生工公司合成。PCR反應(yīng)體系：每11 μL的體系中含ddH2O 6 μL,10×buffer 1.5 μL,dNTP 0.3 μL，Tap酶0.2 μL，引物2 μL，DNA 1 μL。

利用SSR標(biāo)記構(gòu)建連鎖圖譜，從823個(gè)標(biāo)記中篩選出親本間帶型差異明顯的107個(gè)多態(tài)性標(biāo)記，覆蓋玉米基因組全長的2 497 cM，標(biāo)記間平均距離23 cM。運(yùn)用Mapmaker/QTL 1.2軟件對(duì)株高、穗位以及穗位系數(shù)(穗位高/株高)進(jìn)行QTLs定位分析，判斷QTL存在的閾值LOD≥2.5，QTL命名參照McCOUCH等[14]1997年提出的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1鄭單958的親本及其DH系群體的株高和穗位高變異分析

從表1看出，父本自交系昌7-2的株高和穗位高明顯高于母本自交系鄭58，其雜交種鄭單958的株高和穗位高表現(xiàn)明顯的超親優(yōu)勢(shì)；DH群體中各家系的株高和穗位高變異廣泛，但均值仍然偏高親或超高親。從DH群體的峰度和偏度來看，除株高的峰度值大于1外，其偏度和穗位高的峰度和偏度絕對(duì)值均小于1，表明該群體趨于正態(tài)分布。

表1 鄭單958 DH群體及親本的株高和穗位高變異分析 Table 1 Varation of plant height and ear height performance for parents and their DH population from Zhengdan 958 cm

2.2鄭單958DH群體株高與穗位高的相關(guān)性及其方差分析

相關(guān)分析表明，來自于鄭單958 DH群體的株高與穗位高在長葛和淇縣均達(dá)到了極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.81和0.79。

聯(lián)合方差分析結(jié)果(表2)表明， 試點(diǎn)和DH家系各自之間在株高、穗位高方面均存在極顯著差異，但試點(diǎn)與DH家系互作差異不顯著，表明各家系之間遺傳變異豐富，但家系與地點(diǎn)效應(yīng)獨(dú)立。株高和穗位高的廣義遺傳力分別高達(dá)88.52%和93.78%，表明株高和穗位高遺傳穩(wěn)定性性強(qiáng)，受環(huán)境影響較小。

表2 鄭單958 DH群體的株高和穗位高方差分析Table 2 Variance analysis of plant height and ear height for the DH population from Zhengdan 958

注：*，** 分別代表差異達(dá)0.05和0.01顯著水平。

Note:*，** indicates significance at 0.05 and 0.01 level，respectively.

2.3鄭單958DH群體株高和穗位高的QTL分析

2.3.1 鄭單958 DH群體株高的QTL分析 從表3看出，長葛和淇縣分別定位到2個(gè)和7個(gè)株高QTL，分別位于第1，2，3，5，7和8染色體上(圖1)，其中位于第1染色體上的qph-1-3和位于第2染色體上的qph-2-10在長葛和淇縣均被檢測(cè)到，2點(diǎn)共檢測(cè)到7個(gè)株高QTL，這些QTL貢獻(xiàn)率變幅為6.77%～21.31%，大于10%的有3個(gè)，其中qph-3-3的貢獻(xiàn)率最高為21.31%。值得注意的是，由于qph-2-10是2個(gè)地點(diǎn)同時(shí)被檢測(cè)到且貢獻(xiàn)率均大于15%的QTL，據(jù)此推斷該QTL可能是控制株高的主效QTL。在檢測(cè)到的7個(gè)株高QTL中，除第3染色體上的qph-3-3以及第7染色體上的qph-7-10效應(yīng)來自父本昌7-2之外，其他5個(gè)株高QTL效應(yīng)均來自母本鄭58。結(jié)合QTL的貢獻(xiàn)率，不難看出，增加淇縣點(diǎn)株高基因位點(diǎn)主要來自昌7-2的qph-3-3。

2.3.2 鄭單958 DH群體穗位高的QTL分析 在長葛和淇縣分別檢測(cè)到5個(gè)和7個(gè)與穗位高QTL，分別位于第1，2，3，4，5和8染色體上，只有qeh-1-3是兩地同時(shí)被檢測(cè)到的唯一共同的QTL。盡管方差分析結(jié)果(表2)顯示地點(diǎn)與家系之間互為不顯著，但該QTL在兩地的貢獻(xiàn)率相差較大，分別為12.45%和7.54%，表明該QTL的表達(dá)受環(huán)境條件影響仍較大，存在明顯的基因型與環(huán)境的互作效應(yīng)；2個(gè)地點(diǎn)共檢測(cè)到11個(gè)穗位高QTL，貢獻(xiàn)率變幅為5.09%～17.12%，qeh-5-9位點(diǎn)的貢獻(xiàn)率最高為17.12%。

2.3.3 鄭單958 DH群體穗位系數(shù)的QTL分析 穗位系數(shù)是反映株型協(xié)調(diào)與否以及抗倒伏性的重要指標(biāo)之一。本研究中長葛和淇縣兩點(diǎn)分別檢測(cè)到3個(gè)和4個(gè)與穗位系數(shù)有關(guān)的QTL，分別位于第2，3和8染色體上， qeh/qph-3-1是兩地同時(shí)被檢測(cè)到的唯一共同的QTL，該QTL在兩地的貢獻(xiàn)率分別為14.67%和17.78%，是控制穗位系數(shù)的主效QTL。兩地共檢測(cè)到6個(gè)穗位系數(shù)QTL，貢獻(xiàn)率變幅為6.89%～17.78%，這6個(gè)QTL均由來自母本鄭58的基因起作用。值得注意的是，6個(gè)穗位系數(shù)QTL中的4個(gè)位于第2染色體上，其累加貢獻(xiàn)率達(dá)38.25%，表明第2染色體上富集的相關(guān)QTL對(duì)決定株型具有重要作用。同時(shí)看出，位于第2染色體上與穗位系數(shù)有關(guān)qeh/qph-2-8，qeh/qph-2-15以及第3染色體上的qeh/qph-3-1分別與穗位高對(duì)應(yīng)QTL相一致，而位于第2染色體上的qeh/qph-2-7和qeh/qph-2-14以及第8染色體上的qeh/qph-8-1又分別是長葛、淇縣新檢測(cè)到的特異表達(dá)的QTL。顯然，控制穗位高和穗位系數(shù)的QTL不盡一致，其性狀表現(xiàn)既有內(nèi)在聯(lián)系，又有個(gè)別性差異。

表3 鄭單958 DH群體植株性狀的QTL定位Table 3 Identification of QTLs for plant traits in DH population from Zhengdan 958

注：PVE/%為可解釋的表型變異；a表示2個(gè)地點(diǎn)都被檢測(cè)到的QTL。

Note: PVE/% means explainable phenotypic variation;a represents QTL detected in two locations.

3 結(jié)論與討論

3.1有關(guān)玉米株高和穗位高QTL的一致性

目前，隨著玉米機(jī)收面積的擴(kuò)大和機(jī)收水平的提高，對(duì)玉米品種抗倒伏能力的要求越來越高， 大量研究表明，株高和穗位高與子粒產(chǎn)量呈正相關(guān)[14-16]。本研究的結(jié)果也顯示，株高、穗位高表現(xiàn)出明顯的正向雜種優(yōu)勢(shì)。然而，植株過高勢(shì)必增加倒伏的風(fēng)險(xiǎn)，因此，深入分析株高、穗位高的遺傳基礎(chǔ)，協(xié)調(diào)好株高、穗位高與抗倒伏特性以及單株優(yōu)勢(shì)與群體產(chǎn)量之間的關(guān)系，是選育適應(yīng)機(jī)收新品種中必須值得關(guān)注的重要課題。 國內(nèi)外很多學(xué)者對(duì)株高和穗位高已有大量研究報(bào)道，并定位了許多相關(guān)的QTL，但不同學(xué)者因所用的群體和標(biāo)記的密度不同，結(jié)果不盡一致。MILENA等[16]利用熱帶種質(zhì)組配的F2∶3群體分別檢測(cè)出6個(gè)株高和9個(gè)穗位高QTL；鄭克志等[10]利用玉米自交系T 319與9406構(gòu)建的RIL群體，檢測(cè)到6個(gè)株高QTL，分布在第1，2，3，5，7，10染色體上，檢測(cè)到2個(gè)穗位高的主效QTL，位于第1和第10染色體上。本研究利用鄭單958誘導(dǎo)產(chǎn)生的DH群體，在第1，2，3，4，5，7，8染色體上共檢測(cè)到7個(gè)株高和11個(gè)穗位高QTL，在株高QTL中貢獻(xiàn)率最高的是位于bin 3.05-3.06的qph-3-3，貢獻(xiàn)率高達(dá)21.31%，是淇縣點(diǎn)特異表達(dá)的主效QTL，與MILENA等[16]、李清超等[9]、鄭克志等[10]在bin 3.05-3.06發(fā)現(xiàn)的株高主效QTL一致或基本接近；位于bin 2.07的qph-2-10是長葛、淇縣同時(shí)被檢測(cè)到的QTL，貢獻(xiàn)率分別達(dá)15.74%和17.55%，推測(cè)是一個(gè)控制株高的另一個(gè)主效QTL，與鄭克志等[10]的結(jié)果基本一致。證明這些主效QTL是真實(shí)存在的。

圖1 長葛和淇縣檢測(cè)到的玉米鄭單958 DH群體QTL在染色體上的位置Fig.1 Position of QTLs for plant height and ear height detected in Qixian and Changge

本研究發(fā)現(xiàn),控制玉米穗位高QTL的主效位點(diǎn)為bin 1.02處的qeh-1-3，bin 2.07的qeh-2-10和bin 4.07-4.08的qeh-4-8，與李清超等[9]研究發(fā)現(xiàn)的bin 1.01-1.02處富集穗位高QTL,在bin 1.02發(fā)現(xiàn)的穗位高QTL高度一致。同時(shí),也檢測(cè)到一些前人沒有檢測(cè)到位點(diǎn)，可作進(jìn)一步發(fā)掘新的相關(guān)QTL的參考依據(jù)。

本研究檢測(cè)到的株高和穗位高QTL中有4對(duì)即qph1-3與qeh1-3，qph2-10與qeh2-10，qph5-8與qeh5-8以及qph8-4與qeh8-4依次分別位于相同標(biāo)記區(qū)間bnlg1429-bnlg1007，umc1637-umc1560，bnlg118-bnlg1118和umc1384-umc1069，尤其前兩對(duì)QTL是兩地同時(shí)被檢測(cè)到的共同QTL，貢獻(xiàn)率也比較高。如果這些成對(duì)被檢測(cè)到的QTL是分別位于第1，2，5和第8染色體上的一因多效或連鎖基因，則可一定程度上揭示株高和穗位高存在相關(guān)性的遺傳原因，因而可進(jìn)一步通過精細(xì)定位加以驗(yàn)證，為基因的克隆和聚合育種奠定基礎(chǔ)。

3.2DH系群體的分離與表現(xiàn)

本研究中,利用的DH系是通過孤雌生殖誘導(dǎo)系誘導(dǎo)加倍后產(chǎn)生的，利用生物誘導(dǎo)孤雌生殖所產(chǎn)生的單倍體及其DH系的分離情況已有報(bào)道，如CHANG[17]和LASHEMES等[18]研究表明，由孤雌生殖誘導(dǎo)系途徑產(chǎn)生的DH群體中，等位基因的分離均符合1∶1的遺傳分離比例。文科等[19]利用孤雌生殖誘導(dǎo)系誘導(dǎo)高抗青枯病的1145和高感青枯病的Y 331的F1代而產(chǎn)生的單倍體進(jìn)行分離的分析，通過卡方測(cè)驗(yàn)孤雌生殖單倍體的雙親的配子的比例數(shù)符合孟德爾1∶1的隨機(jī)分離比例。對(duì)來源于雜交種1145×Y 331的92個(gè)DH和130個(gè)重組自交系群體(Recombination inbred lines, RIL)的株高、穗位等農(nóng)藝性狀比較分析表明，所有性狀的平均值t測(cè)驗(yàn)結(jié)果表明二者差異不顯著，2個(gè)群體主要農(nóng)藝性狀表現(xiàn)基本一致，DH群體表現(xiàn)出系內(nèi)整齊性更高；可能的原因是由于該單倍體是利用玉米孤雌生殖誘導(dǎo)系誘導(dǎo)產(chǎn)生的，誘導(dǎo)系的作用并不影響F1代配子的重組交換及獨(dú)立分離，只是促使單倍性胚的產(chǎn)生。此外，DH群體創(chuàng)建只需一年兩代即可，大大縮減了構(gòu)建穩(wěn)定作圖群體的時(shí)間，創(chuàng)建的DH群體可穩(wěn)定繁殖，與早代的F2，F(xiàn)2:3等分離群體相比可消除單株間競(jìng)爭(zhēng)的影響，減小環(huán)境的試驗(yàn)誤差。

[1] FLINTGARCIA S A, JAMPATONG C, DARRAH L L, et al. Quantitative trait locus analysis of stalk strength in four maize populations[J]. Crop Science, 2003, 43:13-22.

[2] 李樹巖, 王宇翔, 胡程達(dá), 等. 抽雄期前后大風(fēng)倒伏對(duì)夏玉米生長及產(chǎn)量的影響[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2015, 26(8):2405-2413.

[3] ALBRECHT K A, MARTIN M J , RUSSEL W A，et al. Chemical and in vitro digestible dry matter composition of maize stalks after selection for stalk strength and stalk-rot resistance[J]. Crop Science, 1986，26:1051- 1055.

[4] 王永學(xué)，張戰(zhàn)輝，劉宗華. 玉米抗到伏性狀的配合力效應(yīng)及通徑分析[J]. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011, 45(1):1-6.

[5] 付志遠(yuǎn)，邵可可，丁冬，等. 穗上節(jié)間數(shù)與玉米抗倒伏能力的相關(guān)性分析[J]. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，45(2):149-154.

[6] 豐光，劉志芳，李妍妍，等. 玉米莖稈耐穿刺強(qiáng)度的倒伏遺傳研究[J]. 作物學(xué)報(bào)，2009, 35(11): 2133-2138.

[7] 勾玲，黃建軍，孫銳，等. 玉米不同耐密植品種莖稈穿刺強(qiáng)度的變化特征[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2010, 26(11):156-162.

[8] RADU A, PARASCHIVU U. Use of genetic estimates in breeding maize for resistance to stem breakage[J]. Lucrari Stiintifice(Romania),1944,7:70-80.

[9] 李清超，李永祥，楊釗釗，等. 基于多重相關(guān)RIL群體的玉米株高和穗位高QTL定位[J]. 作物學(xué)報(bào)，2013, 39(9):1521-1529.

[10] 鄭克志，李元，瞿會(huì)，等. 玉米株高和穗位高的QTL 定位[J]．江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43(5):61-63．

[11] 鄭德波，楊小紅，李建生，等. 基于SNP標(biāo)記的玉米株高及穗位高QTL定位[J]. 作物學(xué)報(bào)，2013, 39(3):549-556.

[12] KNAPP S J, STROUP W W, ROSS W M. Exact confidence intervals for heritability on a progeny mean basis[J].Crop Sci,1985, 25:1305-1320.

[13] 吳向遠(yuǎn), 丁冬, 宋桂良，等. 玉米基因組DNA快速提取方法[J]. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，46(1):7-10.

[14] MCCOUCH S R, CHO Y G, YANO M, et al. Report on QTL nomenclature[J]. Rice Genet Newslett, 1997, 14:11-13.

[15] 楊偉光，蘇穎，張建華，等．玉米株高和穗位遺傳模型測(cè)驗(yàn)[J]．吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2000,22(4)：28-13；44．

[16] MILENA L, SOUZA C, BENTO D, et al. Mapping QTL for grain yield and plant traits in a tropical maize population[J]. Mol Breed, 2006, 17:227-239.

[17] CHANG M. Stock 6 induce double haploidy is random[J]. Maize Genet, 1992, 67: 98-99.

[18] LASHERMES P， BECKERT M. Genetic control of maternal haploid in maize(ZeamaysL.)selection of haploid inducing lines[J]. Theor Appl Genet，1988, 76: 405-410.

[19] 文科，黎亮，劉玉強(qiáng)，等. 高效生物誘導(dǎo)玉米單倍體機(jī)器加倍方法研究初探[J]. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，11(5):17-20.

(責(zé)任編輯：常思敏)

QTLanalysisofplantandearheightbyusingDHpopulationinmaize

LI Haochuan1, CHEN Qiong1, YANG Jiwei1, QU Yanzhi1, ZHANG Hui1, ZHANG Chaolin1, LI Yan1, JIA Xi2,LIU Zonghua1

(1.College of Agronomy, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China; 2.Agricultural Bureau of Lingbao City,Lingbao 472500, China)

corn; doubled haploid; plant height; ear height; quantitative trait locus

S 513

：A

2015-12-15

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(U1204316)；國家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2012AA100300)

李浩川(1978-)，男，河南舞鋼人，副教授，博士，主要從事玉米遺傳育種研究。

劉宗華(1960-), 男，河南三門峽人，教授，博士生導(dǎo)師。

1000-2340(2016)02-0161-06