新疆藥桑葉中1-脫氧野尻霉素定性及定量分析

孫蓮，朱衛(wèi)敏，何悅，李曉艷

(新疆醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院 化學(xué)教研室，新疆 烏魯木齊 830054)

·基礎(chǔ)研究·

新疆藥桑葉中1-脫氧野尻霉素定性及定量分析

孫蓮*，朱衛(wèi)敏，何悅，李曉艷

(新疆醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院 化學(xué)教研室，新疆 烏魯木齊 830054)

目的：建立新疆藥桑葉中1-脫氧野尻霉素(DNJ)的TLC定性鑒別及HPLC定量分析方法。方法：以正丁醇-冰醋酸-水(4.5∶1.2∶1.2)為展開劑，在高效硅膠G薄層色譜板上展開，氯-聯(lián)甲苯胺為顯色劑。采用YMC-pack ODS-A色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以甲醇(A)-0.1%醋酸水溶液(B)為流動相，等度洗脫(65%A，35%B)，檢測波長為263 nm，流速為1.0 mL·min-1。結(jié)果：新疆藥桑葉中的DNJ在白光下檢視，出現(xiàn)明顯斑點(diǎn)，Rf值為0.41。DNJ的平均回收率為99.5%(RSD=1.3%)，測得不同產(chǎn)地藥桑葉中DNJ的含量為0.79～3.42 mg·g-1。結(jié)論：建立的方法簡便、可行、靈敏、專屬性強(qiáng)，重復(fù)性好，可用于新疆藥桑葉的質(zhì)量控制。

藥桑葉；1-脫氧野尻霉素；薄層鑒別；高效液相色譜法

桑葉為?？?Moraceae) 植物桑MorusalbaL.的干燥葉，異名鐵扇子，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，桑葉味甘、苦，性寒，歸肺、肝經(jīng)，具有疏散風(fēng)熱、清肺潤燥的功能[1]。現(xiàn)代藥理研究證明，桑葉具有明顯的降血糖作用[2-4]，其中的多羥基生物堿類是主要的降血糖成分之一，1-脫氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin，DNJ)為桑葉中多羥基生物堿的一種特征性成分,是一種糖苷酶抑制劑[5-7]。新疆藥桑MorusnigraLinn主產(chǎn)于南疆的和田、喀什、阿克蘇等地區(qū)，是新疆具有的一個(gè)獨(dú)特的桑品種，也

具有極大的藥用價(jià)值。目前，還無新疆藥桑葉的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)行的桑葉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中只有蘆丁的定性及定量研究，缺乏專屬性成分的定性及定量分析。我們對新疆藥桑葉中的黃酮類、γ-氨基丁酸等有效成分進(jìn)行了定性定量分析，并對藥桑葉中的黃酮類及多糖進(jìn)行抗氧化及降血糖活性的研究[8-9]。本實(shí)驗(yàn)采用薄層色譜法對藥桑葉中的專屬性成分DNJ進(jìn)行定性鑒別，采用高效液相色譜法對其進(jìn)行含量測定[10-13]，為新疆藥桑葉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1220高效液相色譜儀(Agilent，美國)；LINOMAT 5半自動點(diǎn)樣儀(CAMAG)，REPROSTAR 3薄層色譜數(shù)碼成像系統(tǒng)(CAMAG)。

1.2材料

1-脫氧野尻霉素(DNJ，成都曼思特生物科技有限公司，批號：MUST-15022702)，氯-聯(lián)甲苯胺(上海源葉生物科技有限公司，批號：119-93-7)，芴甲氧羰酰氯(FMOC-Cl,SIGMA-ALDAICH，批號：28920-43-6)，甘氨酸(天津光復(fù)精細(xì)化工研究所，批號：20120319)，硼砂、硼酸、乙腈、甲醇、冰醋酸為優(yōu)級純；碘化鉀、次氯酸、冰乙酸、無水乙醇、正丁醇、甲醇、乙酸乙酯、三氯甲烷均為分析純,硅膠H色譜板、硅膠G色譜板、高效硅膠G色譜板、硅膠GF254色譜板、高效硅膠GF254色譜板(青島海洋化工分廠)。

10批藥桑葉采自于新疆南疆不同地區(qū)(喀什市、和田市、庫爾勒市、阿克蘇市、和田縣、疏勒縣、阿克蘇沙雅縣、喀什莎車縣、和田洛浦縣、庫爾勒恰爾巴格鄉(xiāng))，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院帕麗達(dá)·阿不力孜教授鑒定為?？浦参锼幧５娜~。

2 方法

2.1 薄層鑒別

2.1.1 溶液的配制

2.1.1.1 供試品溶液的制備 精密稱取過40目篩的干燥藥桑葉粉2.0 g，置于100 mL的錐形瓶中，加入0.05 mol·L-1HCl溶液40 mL，超聲提取20 min，離心分離10 min，抽濾，濾液濃縮至5 mL，用0.05 mol·L-1的HCl溶液定容至10 mL容量瓶中，搖勻，得薄層色譜用供試品溶液。

2.1.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取DNJ對照品5.97 mg于5 mL容量瓶中，用0.05 mol·L-1的HCl溶液定容至刻度，得1.19 mg·mL-1的DNJ對照品儲備液。再精密量取0.84 mL 的DNJ對照品儲備液，用0.05 mol·L-1的HCl溶液定容至10 mL容量瓶中，得0.1 mg·mL-1的DNJ對照品溶液。

2.1.1.3 顯色劑的配制 ①1%三氯化鋁溶液：稱取1 g的三氯化鋁，置于100 mL的容量瓶中，用95%乙醇定容至刻度，得1%三氯化鋁溶液。②0.2%的茚三酮溶液：稱取0.2 g茚三酮，溶于5 mL冰乙酸和95 mL正丁醇中，搖勻，可得0.2%的茚三酮溶液。③氯-聯(lián)甲苯胺溶液：準(zhǔn)確稱取32.0 mg的氯-聯(lián)甲苯胺，溶于3 mL的冰醋酸中，用水稀釋到50 mL，用時(shí)與0.4%碘化鉀溶液混合(1∶1，V/V)。

2.1.2 展開系統(tǒng)的選擇 分別吸取DNJ對照品溶液6 μL及藥桑葉樣品1 μL，點(diǎn)于高效硅膠G色譜板上，分別置于三氯甲烷-甲醇-水(5∶4.5∶1)、正丁醇-冰醋酸-水(4∶1∶1)、乙酸乙酯-無水乙醇(2∶8)及正丁醇-冰醋酸-水(4.5∶1.2∶1.2)等不同展開劑中展開，取出，自然晾干，噴以氯-聯(lián)甲苯胺顯色，白光下檢視。

2.1.3 不同顯色方法的選擇 分別吸取DNJ對照品溶液6 μL及桑葉樣品1 μL，點(diǎn)于高效硅膠G色譜板上，以正丁醇-冰乙酸-水(4.5∶1.2∶1.2)為展開劑展開，取出，自然晾干，分別噴以1%三氯化鋁溶液、0.2%茚三酮溶液、氯-聯(lián)甲苯胺溶液顯色劑顯色，白光下檢視，考察不同顯色劑的顯色效果。

2.1.4 不同薄層色譜板的選擇 分別吸取DNJ對照品溶液6 μL及藥桑葉樣品1 μL，點(diǎn)于高效硅膠G色譜板、硅膠G色譜板、硅膠H色譜板、硅膠GF254色譜板、高效硅膠GF254色譜板等不同薄層色譜板上，以正丁醇-冰乙酸-水(4.5∶1.2∶1.2)為展開劑展開，取出，自然晾干，噴以氯-聯(lián)甲苯胺顯色，白光下檢視。

2.1.5 不同點(diǎn)樣量的選擇 分別吸取DNJ對照品溶液2、4、6 μL及樣品溶液1、2、4 μL，點(diǎn)在高效硅膠G色譜板上，以正丁醇-冰乙酸-水(4.5∶1.2∶1.2)為展開劑展開，噴以氯-聯(lián)甲苯胺溶液顯色，白光下檢視。

2.1.6 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn) 分別吸取新疆不同地區(qū)藥桑葉樣品1 μL及DNJ對照品溶液6 μL點(diǎn)于同一塊高效硅膠G色譜板上，以正丁醇-冰乙酸-水(4.5∶1.2∶1.2)為展開劑展開，取出，自然晾干，噴以氯-聯(lián)甲苯胺顯色，白光下檢視。

2.2 HPLC測定藥桑葉中DNJ的含量

2.2.1色譜條件 YMC-pack ODS-A色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相：甲醇(A)-0.1%醋酸水溶液(B)；等度洗脫(0～30 min，65%A，35%B)；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：20 μL，檢測波長：263 nm。

2.2.2 溶液的配制

2.2.2.1 供試品溶液的制備 精密稱取藥桑葉粉末2.000 0 g，置于100 mL的錐形瓶中，加入0.05 mol·L-1HCl溶液40 mL，超聲提取兩次，每次20 min，4 000 r·min-1下離心分離10 min，抽濾，濾液濃縮至5 mL，用0.05 mol·L-1的HCl溶液定容至25 mL容量瓶中，得供試品溶液，用時(shí)過0.22 μm的微孔濾膜。

2.2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取DNJ對照品5.97 mg，置于5 mL的容量瓶中，用0.05 mol·L-1的HCl溶液定容至刻度，得1.19 mg·mL-1的DNJ對照品儲備液。

2.2.3 DNJ對照品溶液的衍生化 將50 μL的硼酸鹽緩沖液(pH=8.5)與50 μL的DNJ對照溶液混合，向其中加入5 mmol·L-1FMOC-Cl乙腈溶液100 μL，混勻，20 ℃水浴中加熱20 min，再加入 0.1 mol·L-1甘氨酸溶液50 μL，終止反應(yīng)，將其轉(zhuǎn)移到5 mL容量瓶中，用0.1%醋酸溶液定容至刻度，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜。

2.2.4 方法學(xué)考察

2.2.4.1精密度試驗(yàn) 分別配制高、中、低3個(gè)濃度DNJ對照品溶液各3份，按上述色譜條件測定其峰面積的RSD。

2.2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別在0、2、4、6、12、24 h進(jìn)樣，按選定的色譜條件測定含量的RSD。

2.2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取喀什地區(qū)藥桑葉樣品6份，按2.2.2.1項(xiàng)制備供試品溶液，并按2.2.3項(xiàng)下衍生化，分別進(jìn)樣10 μL，計(jì)算峰面積的RSD。

2.2.4.4 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的同批樣品2.0 g，共9份，分別按樣品量的80%、100%、120%加入對照品溶液，按2.2.2.1項(xiàng)制備供試品溶液，并按2.2.3項(xiàng)下衍生化后，在上述色譜條件下測定，計(jì)算回收率。

2.2.4.5 線性關(guān)系的考察及檢測限 分別吸取2.0、2.5、7.5、12.5、25、30 μL 的DNJ對照品儲備液(1.19 mg· mL-1)于6個(gè)5 mL的容量瓶中，按2.2.3項(xiàng)下衍生化后，用0.05 mol·L-1的HCl溶液定容至刻度，搖勻，測定峰面積，以對照品的濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸分析。將1.19 mg·mL-1的DNJ對照品儲備液逐級稀釋后，在上述選定的色譜條件下進(jìn)行測定，按3倍信噪比計(jì)算

檢測下限。

2.2.5 樣品含量測定 精密稱取10批不同產(chǎn)地的藥桑葉樣品2.000 0 g，各3份，按2.2.2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按2.2.3項(xiàng)下的方法將其衍生化，在上述色譜條件下，分別進(jìn)樣20 μL，記錄峰面積，帶入回歸方程計(jì)算含量。

3 結(jié)果與討論

3.1 薄層鑒別

3.1.1 展開系統(tǒng)的選擇 以不同的展開劑展開后的結(jié)果見圖1，可以看出，以三氯甲烷-甲醇-水(5∶4.5∶1)為展開劑時(shí)，樣品中的斑點(diǎn)分離的不好，點(diǎn)的清晰度不夠；以乙酸乙酯-無水乙醇(2∶8)為展開劑時(shí)，有明顯的拖尾現(xiàn)象；以正丁醇-冰乙酸-水(4∶1∶1)為展開劑時(shí)，對照品DNJ的斑點(diǎn)模糊；只有以正丁醇-冰乙酸-水(4.5∶1.2∶1.2)為展開劑時(shí)，斑點(diǎn)圓整，各個(gè)斑點(diǎn)的分離效果較好，DNJ的Rf值為0.41，故本實(shí)驗(yàn)選用正丁醇-冰乙酸-水(4.5∶1.2∶1.2)為展開劑。

注：A.三氯甲烷-甲醇-水(5∶4.5∶1)；B.乙酸乙酯-無水乙醇(2∶8)； C.正丁醇-冰醋酸-水(4∶1∶1)；D.正丁醇-冰醋酸-水(4.5∶1.2∶1.2)； 1.DNJ對照品溶液；2.樣品。圖1 藥桑葉薄層鑒別不同展開劑的考察

3.1.2 不同顯色方法的選擇 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以三氯化鋁溶液為顯色劑時(shí)，薄層色譜板上幾乎無斑點(diǎn)；以0.2%茚三酮溶液為顯色劑時(shí)，樣品處有斑點(diǎn)出現(xiàn)，但為藥桑葉中的氨基酸，DNJ對照品處無斑點(diǎn)；以氯-聯(lián)甲苯胺溶液為顯色劑時(shí)，顯色效果較明顯，樣品的分離情況也較好，故選擇氯-聯(lián)甲苯胺溶液為顯色劑。

3.1.3 不同薄層色譜板的選擇 以正丁醇-冰乙酸-水(4.5∶1.2∶1.2)為展開劑，分別在高效硅膠G色譜板、硅膠G色譜板、硅膠H色譜板、硅膠GF254色譜板及高效硅膠GF254色譜板等不同薄層色譜板上展開的結(jié)果見圖2。

注：A.硅膠GF254色譜板；B.高效硅膠GF254色譜板；C.硅膠G色譜板；D.硅膠H色譜板； E.高效硅膠G色譜板；1.DNJ對照品溶液；2.樣品。圖2 藥桑葉薄層鑒別不同薄層色譜板的考察

由圖2可知，硅膠GF254色譜板所分離的斑點(diǎn)清晰度不夠，且分離效果不好；高效硅膠GF254色譜板上，對照品與樣品所得到DNJ斑點(diǎn)的Rf值有偏差；硅膠H色譜板得到的斑點(diǎn)不清晰；硅膠G色譜板與高效硅膠G色譜板分離效果都較好，相比較之下，高效硅膠G色譜板上斑點(diǎn)的分離度及清晰度都較優(yōu)，故本實(shí)驗(yàn)選擇高效硅膠G色譜板為薄層色譜板。

3.1.4 不同點(diǎn)樣量的選擇 不同點(diǎn)樣量的結(jié)果表明，DNJ對照品的最佳點(diǎn)樣量為6 μL，樣品最佳點(diǎn)樣量為1 μL。

3.1.5 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn) 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果見圖3。結(jié)果表明，白光下，10批藥桑葉供試品薄層色譜中，在與對照品DNJ相應(yīng)的位置上，均能出現(xiàn)Rf值相同的灰藍(lán)色斑點(diǎn)，且分離度好、斑點(diǎn)清晰，可作為藥桑葉定性鑒別指標(biāo)。

注：1.DNJ對照品；2.喀什市樣品；3.和田市樣品；4.庫爾勒市樣品；5.阿克蘇市樣品；6.和田縣樣品；7.疏勒縣樣品；8.阿克蘇沙雅縣樣品；9.喀什莎車縣樣品；10.和田洛浦縣樣品；11.庫爾勒恰爾巴格鄉(xiāng)樣品。圖3 藥桑葉薄層鑒別驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

3.2 HPLC測定桑葉中DNJ的含量

3.2.1 色譜條件 在上述色譜條件下的色譜圖如圖4所示。

注：A.1-脫氧野尻霉素對照品；B.樣品；1.DNJ。圖4 藥桑葉及對照品HPLC圖

3.2.2 方法學(xué)考察

3.2.2.1 精密度及穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果 精密度的測定結(jié)果為：峰面積的RSD值均<2.0%。穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果：DNJ衍生產(chǎn)物含量的RSD=1.2%，說明供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.2.2.2 重復(fù)性試驗(yàn) 結(jié)果表明樣品中DNJ衍生產(chǎn)物峰面積的RSD=1.4%。

3.2.2.3 回收率試驗(yàn) 加樣回收試驗(yàn)的結(jié)果見表1。

表1 藥桑葉中1-脫氧野尻霉素回收率試驗(yàn)結(jié)果

3.2.2.4 線性關(guān)系的考察及檢測限 將測得峰面積(Y)與濃度(X)經(jīng)回歸處理后，得標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=59.97X-5.792 7，r=0.999 6，線性范圍為0.478～7.164 μg·mL-1。測得DNJ的檢測下限為0.06 mg·L-1。

3.2.3 樣品含量測定 10批樣品中DNJ的含量測定結(jié)果見表2。

表2 10批藥桑葉樣品中1-脫氧野尻霉素的含量測定結(jié)果

測得10批藥桑葉中DNJ的含量有差異，疏勒縣的藥桑葉中DNJ的含量最高，可達(dá)3.42 mg·g-1，而和田洛浦的最低，為0.79 mg·g-1，由此可見，有必要對藥桑葉的質(zhì)量進(jìn)行控制。

本實(shí)驗(yàn)選擇了不同濃度的鹽酸溶液(0.01、0.03、0.05、0.07、0.1 mol·L-1)為提取溶劑，試驗(yàn)了不同的超聲提取時(shí)間(10、20、30、40、50 min)及提取次數(shù)(1、2、3次)對DNJ提取效果的影響，選擇的最佳提取條件是：0.01 mol·L-1鹽酸溶液為提取溶劑，超聲提取2次，每次20 min。

實(shí)驗(yàn)建立的方法簡便、可行、靈敏、專屬性強(qiáng)，重復(fù)性好，可用于新疆藥桑葉的質(zhì)量控制。

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QualitativeandQuantitativeAnalysisof1-DeoxynojirimycininMorusnigraLeavesofXinjiang

SUN Lian*，ZHU Weimin，HE Yue，LI Xiaoyan

(DepartmentofChemistryofPharmacyCollegeofXinjiangMedicalUniversity，Urumqi830011，China)

Objective：To establish a TLC identification and a HPLC quantitative analysis methods of 1-deoxynojirimycin (DNJ) inMorusnigraleaves of Xinjiang.Methods：DNJ was developed on efficient silica gel G plate using n-butanol-acetic acid-water (4.5∶1.2∶1.2) as a developing system，chloro-o-toluidine was used as a chromogenic reagent.The content determination was performed on a YMC pack ODS column (250 mm×4.6 mm，5 μm) with methanol-0.1% acetic acid solution as the mobile phase，isocratic elution(65%A，35%B)，detection wavelength was 263 nm，and the flow rate was 1.0 mL · min-1.Results：Obvious spots of DNJ appeared under natural light，its Rf = 0.41,the average recovery of DNJ of HPLC was 99.5%(RSD=1.3%),and the content of DNJ from different area’sM.nigraleaves were 0.79 ～ 3.42 mg·g-1.Conclusion：The established method is simple，practical，sensitive，specific and reproducible，which can be used as a quality control ofM.nigraleaves.

Morusnigraleaves；1-deoxynojirimycin (DNJ)；TLC；HPLC

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.10.011

2016-01-18)

*

孫蓮，教授，研究方向：藥物分析；E-mail：sl_yxy@126.com