基于ITS2序列的維吾爾藥材蜀葵及其近緣種鑒定研究△

樊叢照，坤杜孜·阿依，李曉瑾

(新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所，新疆 烏魯木齊 830002)

·專(zhuān)題·

基于ITS2序列的維吾爾藥材蜀葵及其近緣種鑒定研究△

樊叢照，坤杜孜·阿依，李曉瑾*

(新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所，新疆 烏魯木齊 830002)

目的：研究蜀葵與藥蜀葵特征DNA序列的差異，為鑒定維吾爾藥材蜀葵及藥蜀葵提供依據(jù)。方法：采用試劑盒法提取蜀葵及藥蜀葵基因組DNA，PCR擴(kuò)增ITS2片段，雙向測(cè)序，應(yīng)用Mega6.0軟件分析序列，計(jì)算種內(nèi)及種間遺傳距離，構(gòu)建NJ鑒別樹(shù)。結(jié)果：蜀葵ITS2序列長(zhǎng)度為233 bp，與藥蜀葵231～232 bp存在差異；蜀葵種內(nèi)最大K2P遺傳距離為0.004，藥蜀葵種內(nèi)K2P遺傳距離為0，蜀葵與藥蜀葵種間平均K2P遺傳距離為0.0732；NJ樹(shù)結(jié)果表明蜀葵與藥蜀葵均單獨(dú)聚為一支。結(jié)論：ITS2序列可用于維吾爾藥材蜀葵真?zhèn)舞b定的DNA條形碼，為保障臨床正確用藥提供了新的方法。

ITS2；蜀葵；鑒定

錦葵科(Malvaceae)蜀葵屬植物在我國(guó)分布有3種，其中蜀葵Althaearosea與藥蜀葵Althaeaofficinalis在新疆分布較為廣泛，而裸花蜀葵Althaeanudiflora分布較少[1-2]。

蜀葵及藥蜀葵皆為維吾爾醫(yī)常用藥，但功效用法不同。蜀葵：花可鎮(zhèn)靜安神、止咳平喘，種子用于清熱解毒、利水通便，根則下乳、生肌[3-4]；藥蜀葵：葉外用可消瘡祛癰，根內(nèi)服利尿止咳[5-6]。新疆藥材地方標(biāo)準(zhǔn)僅收載了蜀葵[7-8]。但市場(chǎng)上常因兩者外觀相似而混淆[9]，存在臨床用藥安全隱患。因此，準(zhǔn)確鑒定藥材基原，對(duì)保障藥材質(zhì)量具有重要的意義。

DNA條形碼是利用植物基因組中一段通用標(biāo)準(zhǔn)短序列來(lái)進(jìn)行物種鑒定的分子診斷新技術(shù)[10]，可不受樣品形態(tài)形狀的限制，實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確的判定植物基源。陳士林等研究證明ITS2序列可以作為通用DNA條形碼鑒別藥用植物[11-15]，已在羌活[16]、阿魏[17]、金銀花[18]、香青蘭[19]等中藥民族藥材得到驗(yàn)證。“中藥材DNA分子鑒定指導(dǎo)原則”已載入《中華人民共和國(guó)藥典》2010版第三增補(bǔ)本[20]和2015版[21]。本文旨在研究蜀葵屬I(mǎi)TS2序列，建立蜀葵、藥蜀葵藥材基原的鑒定方法，保障患者用藥的準(zhǔn)確與安全，為正確合理利用維吾爾藥材資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

研究樣本34個(gè)(詳見(jiàn)表1)。其中：11份采自新疆各地，由新疆中藥民族藥研究所副研究員王果平鑒定為蜀葵8份，藥蜀葵3份，憑證標(biāo)本保存于新疆中藥民族藥研究所標(biāo)本館(新疆XTNM)；購(gòu)自維吾爾藥市場(chǎng)蜀葵藥材樣品6份；查自GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)蜀葵序列10條，藥蜀葵序列5條，歐亞花葵序列2條。

表1 研究樣本信息

注：標(biāo)本號(hào)為654021120704002、65230736的樣本ITS2序列與KF454359一致，H0228序列與KF454364一致。

1.1.2 試劑 PCR擴(kuò)增引物由生工生物工程合成，ITS2正向序列：5’-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3’，反向：5’-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3’；DNA提取試劑盒、DNA聚合酶及dNTP等均購(gòu)自天根生物。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 研磨儀：型號(hào)GT-100，GRINDER；離心機(jī)：型號(hào)Anker TGL-16C，上海安亭科學(xué)儀器；PCR擴(kuò)增儀：型號(hào)070-851，An Analytik Jena company。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取及檢測(cè) 稱(chēng)取干燥藥材30 mg，DNA提取研磨儀1000 r·min-1研磨2 min，植物DNA提取試劑盒提取總DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA的質(zhì)量。

1.2.2 PCR擴(kuò)增及測(cè)序 反應(yīng)體積25 μL，dNTP 0.4 μL(10 mmol·L-1)，PCR緩沖液2.5 μL(10×)，引物各1.0 μL(2.5 μmol·L-1)，聚合酶1.0 U，總DNA 1 μL(約30 ng)。引物ITS2擴(kuò)增程序：94 ℃，變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s(40個(gè)循環(huán))；72 ℃延伸10 min[13]。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)后，使用ABI 3730 XL(Applied Biosystems Co.，USA)測(cè)序儀由美吉生物測(cè)序公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

測(cè)序峰圖用CodonCode Aligner V 4.0.4(CodonCode Co.，USA)校對(duì)拼接，去除引物區(qū)。將所有序列由軟件MEGA6.0(molecular evolutionary genetics analysis)分析比對(duì)[22]，ITS2序列基于隱馬爾可夫模型的HMMer注釋方法，去除兩端5.8S和28S區(qū)段獲得ITS2間隔區(qū)序列[23]，用鄰接(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)聚類(lèi)樹(shù)，使用bootstrap(1000次重復(fù))檢驗(yàn)各分支的支持率[24]。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取、PCR擴(kuò)增及測(cè)序結(jié)果

從樣品葉片、干燥花、種子、根等藥用部位中均成功提取了基因組DNA，經(jīng)電泳檢測(cè)條帶清晰，PCR結(jié)果經(jīng)雙向測(cè)序，質(zhì)量較好。

2.2 序列信息及變異

蜀葵24條ITS2序列比對(duì)后，長(zhǎng)度均為233 bp。其中來(lái)源于基原植物標(biāo)本的8條ITS2序列種內(nèi)無(wú)變異位點(diǎn)，為1個(gè)單倍型，來(lái)源于藥材市場(chǎng)的蜀葵藥材有兩個(gè)單倍型，編號(hào)為YC000043的樣本在24 bp位點(diǎn)有C-個(gè)變異，其余樣本序列與蜀葵基原植物一致(如圖1)，來(lái)源于GenBank的序列均與基原植物相同。藥蜀葵8條序列比對(duì)后，長(zhǎng)度為231～232 bp，KF454365在125 bp位點(diǎn)有T堿基缺失變異，其余序列與KF454364一致。蜀葵平均GC含量為53.22%，藥蜀葵為57.76%，蜀葵與藥蜀葵種間GC含量差異顯著。

圖1 不同單倍型實(shí)驗(yàn)樣本種內(nèi)及種間變異位點(diǎn)比較

2.3 種內(nèi)及種間K2P距離分析

蜀葵種內(nèi)K2P距離為0～0.004，平均K2P距離為0.000 3；藥蜀葵種內(nèi)K2P距離為0。 蜀葵與藥蜀葵種間K2P距離為0.073～0.078，種間平均K2P距離為0.073 2，表2。ITS2序列種間存在18個(gè)變異位點(diǎn)，其中信息變異位點(diǎn)有16個(gè)，16個(gè)信息變異微店均以將蜀葵與藥蜀葵進(jìn)行區(qū)分。

表2 種內(nèi)種間K2P遺傳距離計(jì)算結(jié)果

2.4 蜀葵與藥蜀葵NJ樹(shù)聚類(lèi)鑒定結(jié)果

采用蜀葵23條ITS2序列，藥蜀葵7條ITS2序列，以與蜀葵屬親緣關(guān)系相近形態(tài)相似的植物歐亞花葵作為外緣種構(gòu)建NJ系統(tǒng)聚類(lèi)樹(shù)，根據(jù)圖1可以看出，所有來(lái)源的蜀葵序列聚為一支，支持率為99%；藥蜀葵單獨(dú)聚為一支，支持率為99%。歐亞花葵作為外緣種，與前兩者顯著區(qū)分。因此，ITS2序列作為條形碼可準(zhǔn)確鑒別維吾爾藥材蜀葵與藥蜀葵。

圖2 基于ITS2序列的單倍型NJ鑒別樹(shù)，在圖中顯示分支支持率(≥50%，bootstrap 1000次重復(fù))

3 討論

3.1 ITS2序列能夠準(zhǔn)確穩(wěn)定的鑒定維吾爾藥材

蜀葵與藥蜀葵為功效不同的兩種維吾爾常用藥材，但兩者存在混用現(xiàn)象[9]。本研究采用DNA條形碼ITS2序列對(duì)維吾爾藥材蜀葵、藥蜀葵進(jìn)行鑒定，研究結(jié)果表明，藥用部位葉片、花、種子、根等藥用部位都能成功提取基因組DNA，適合應(yīng)用DNA條形碼ITS2序列進(jìn)行鑒定。通過(guò)對(duì)市場(chǎng)收集的6份蜀葵藥材進(jìn)行鑒定，ITS2序列比對(duì)及NJ鑒別樹(shù)結(jié)果表明，不同地區(qū)收集的6份藥材均來(lái)源于蜀葵。本研究結(jié)果僅包括了6份市售藥材，不能代表市場(chǎng)上流通的所有藥材蜀葵，但DNA條形碼技術(shù)能準(zhǔn)確鑒定市售藥材蜀葵的基原，為藥材的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

3.2 DNA條形碼在維吾爾藥材鑒定中的意義

藥材基原的準(zhǔn)確性與中藥材的準(zhǔn)確鑒定對(duì)中藥材的臨床療效有著重要的作用。相比中藥材，維吾爾藥材來(lái)源更為復(fù)雜，廣泛使用進(jìn)口藥材，在長(zhǎng)期的用藥過(guò)程中由于翻譯錯(cuò)誤、鑒定錯(cuò)誤、代用混用等原因，考證難度較大，傳統(tǒng)的形態(tài)、顯微、化學(xué)等鑒定方法雖然在藥材的鑒別中發(fā)揮了一定的作用，但對(duì)于鑒定近緣種和外觀形態(tài)相似的藥材，還存在一定的困難，加之藥材形狀易受到采收加工及儲(chǔ)存條件的影響，傳統(tǒng)鑒定方法已無(wú)法滿(mǎn)足藥材的鑒定需要[25]。相比之下，DNA條形碼鑒定不受藥材形狀影響，不受專(zhuān)業(yè)技術(shù)的限制，直接從基因水平提供鑒定依據(jù)。已有研究者采用DNA條形碼技術(shù)對(duì)來(lái)源與不同地區(qū)藥材市場(chǎng)的紅景天[26]、澤瀉[27]、鹿茸[28]、川木香[29]等中藥材進(jìn)行了鑒定分析，結(jié)果表明DNA條形碼技術(shù)不僅可以為這幾種藥材市場(chǎng)真?zhèn)纹番F(xiàn)狀提供依據(jù)，而且可以追溯藥材的基原。因此，采用DNA條形碼技術(shù)可以快速準(zhǔn)確的鑒定維吾爾藥材，在今后藥材來(lái)源、標(biāo)準(zhǔn)制定、藥材流通和市場(chǎng)管理等實(shí)際應(yīng)用中具有重要的價(jià)值。

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IdentificationofUyghurMedicineAlthaearoseaandItsCloselyRelatedSpeciesBasedonITS2Sequence

FAN Congzhao，KUNDUZI·Ayi，LI Xiaojin*

(XinjiangInstituteofChineseMateriaMedicaandEthnicalMateria，Urumqi830002，China)

Objective：To explore a new method to identify Uygur MedicineAlthaearoseaand its closely related speciesA.officinalisby the difference of ITS2 regions.Methods：Genomic DNA ofA.roseaandA.officinaliswere extracted by Reagent kit，ITS2 sequences were obtained by PCR amplification and sequenced bidirectionally.Mega 6.0 software was used to analyze sequence，calculate intra- and inter-specific genetic distance and construct neighbor joining (NJ) tree.Results：The ITS2 sequence length ofA.roseawas 233 bp andA.officinaliswas 231 to 232 bp differences.The maximum K2P genetic distance ofA.roseawas 0.004，whenA.officinaliswas zero.The average interspecific K2P genetic distance betweenA.roseaandAlthaeaofficinaliswas 0.0732.NJ tree results showed thatA.roseaandA.officinaliswere clustered，respectively.Conclusion：The ITS2 sequences can be used to identify UygurA.roseawithA.officinalisas an effective DNA barcoding，which provides a new methods to ensure its clinical safety.

ITS2；Althaearosea；identification

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.10.004

2016-01-15)

新疆維吾爾自治區(qū)科技廳高新技術(shù)研究發(fā)展項(xiàng)目(201517107)

*

李曉瑾，研究員，研究方向：中藥資源，Tel：(0991)2665614，E-mail：xjlxj@126.com