長(zhǎng)白山林下仿野生栽培紫芝主要活性成分研究△

孟令文，田淋淋，李志成，季存蕊，張輝，孫佳明

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130117)

·基礎(chǔ)研究·

長(zhǎng)白山林下仿野生栽培紫芝主要活性成分研究△

孟令文，田淋淋，李志成，季存蕊，張輝*，孫佳明*

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130117)

目的：對(duì)長(zhǎng)白山林下仿野生栽培紫芝子實(shí)體中3類活性成分進(jìn)行分析研究，為其開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。方法：以長(zhǎng)白山林下仿野生栽培紫芝子實(shí)體為研究對(duì)象，采用高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)超臨界CO2萃取得到的紫芝油中三萜類成分進(jìn)行分析，采用氣相色譜-質(zhì)譜法分析紫芝油中脂肪酸類物質(zhì)的組成，采用苯酚-硫酸法測(cè)定提取紫芝油后的殘?jiān)卸嗵呛?。結(jié)果：長(zhǎng)白山林下仿野生栽培紫芝油中含有較豐富的三萜酸類成分，總?cè)普甲现ビ唾|(zhì)量的40%，并初步分析了其中含有Ganoderic acid A 等15個(gè)三萜酸的結(jié)構(gòu)；紫芝油中共檢出15種脂肪酸，其中不飽和脂肪酸占68.9%，含量較大的為油酸和亞油酸；經(jīng)測(cè)定提取紫芝油后的殘?jiān)卸嗵呛繛?.79%；結(jié)論：本品中含有豐富的多糖、三萜和脂肪酸這3類活性成分，表明長(zhǎng)白山林下仿野生栽培紫芝具有很大的應(yīng)用開(kāi)發(fā)價(jià)值。

長(zhǎng)白山;林下仿野生栽培; 紫芝; 活性成分

紫芝GanodermasinenseZhao，Xu et Zhang為擔(dān)子菌綱多孔菌科紫芝屬真菌，《中華人民共和國(guó)藥典》2010版將其與赤芝G.lucidum的干燥子實(shí)體共同定為靈芝藥用正品[1]。靈芝是我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥材，并已有悠久的藥用歷史，具有抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、保肝解毒和鎮(zhèn)痛，鎮(zhèn)靜安神，等臨床價(jià)值?，F(xiàn)代臨床中亦用作癌癥放化療后白細(xì)胞減少等癥狀，效果顯著，除藥用價(jià)值外靈芝及其深加工產(chǎn)品也經(jīng)常用作人體保健品，具有相當(dāng)高的市場(chǎng)價(jià)值[2]。而靈芝主要含有三萜類、多糖(肽)類、生物堿、脂肪酸類、核苷類、氨基酸及微量元素等成分[3]?，F(xiàn)代藥理研究表明，靈芝三萜類成分具有抗HIV、保肝、抗組胺、輔助降血壓等活性，其不飽和脂肪酸類成分具有對(duì)人體免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等均有很好的調(diào)節(jié)作用，靈芝多糖具有顯著的提高免疫力抗腫瘤功效、清除自由基抗衰老等活性。這三類成分是靈芝的主要活性成分。

隨著靈芝產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，野生靈芝遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)的需求，逐漸形成一種靈芝仿野生化栽培的撫育技術(shù)，即人工靈芝三級(jí)或者二級(jí)菌種[4]。菌種栽種于除紅松外的松科木段中，一般三到四年出芝，該模式為仿野生栽培方式，生產(chǎn)的靈芝品質(zhì)是否能夠替代野生靈芝還有待評(píng)價(jià)。因此本文對(duì)長(zhǎng)白山地區(qū)仿野生化栽培紫芝的藥用價(jià)值進(jìn)行的全面評(píng)價(jià)，采用LC-MS、GC-MS和UV分別分析這三類活性成分，為其開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

長(zhǎng)白山林下仿野生栽培紫芝藥材經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)張輝教授鑒定為多孔菌科紫芝屬真菌紫芝GanodermasinenseZhao，Xu et Zhang的子實(shí)體。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

Agilent 1100 series LC-MSD液質(zhì)聯(lián)用儀，包括：Agilent SL 型多級(jí)離子阱質(zhì)譜儀、低壓四元梯度泵、二極管陣列檢測(cè)器(DAD)、自動(dòng)進(jìn)樣、柱溫箱、Chemistation 化學(xué)工作站等；GL-20G-H型低溫超速離心機(jī)；BP211D型十萬(wàn)分之一電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)。Aglent6890N GCsystem；質(zhì)譜：Angilent 5973 Network MSD(MassSelctive Detector)，NIST98數(shù)庫(kù)；Agilent 7683 series自動(dòng)進(jìn)樣器。蒸餾裝置，分光光度計(jì)，電子天平，苯酚，硫酸。實(shí)驗(yàn)所用乙腈為色譜純，水為娃哈哈純凈水，其余試劑為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 應(yīng)用LC-MS分析長(zhǎng)白山林下仿野生栽培紫芝油中三萜類成分

2.1.1 樣品制備 取長(zhǎng)白山林下仿野生栽培紫芝超臨界CO2萃取得到紫芝油1 g，加入甲醇20 mL，超聲30 min，離心取上清，上清液回收溶劑至干，得黃色粉末狀總?cè)?0 mg。另取該粉末1 mg，加甲醇1 mL，超聲溶解，過(guò)0.22 μm膜供LC-MS分析。

2.1.2 色譜條件 Eclipse plus C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈/0.1%的甲酸水溶液二元線性梯度洗脫，流動(dòng)相梯度設(shè)置(見(jiàn)表1)。流速：0.3 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：257 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL[5-7]。

表1 流動(dòng)相梯度表

2.1.3 質(zhì)譜條件 電離源：電噴霧離子源(ESI)；檢測(cè)方式：正、負(fù)離子同時(shí)采集；掃描范圍：m/z 50～1200；目標(biāo)分子量：500；干燥氣溫度：350 ℃；干燥氣流量：9 L·min-1；霧化氣壓強(qiáng)：0.24 MPa(35.0 psi)；毛細(xì)管電壓：4 kV。

2.2 應(yīng)用GC-MS分析長(zhǎng)白山林下仿野生栽培紫芝油中脂肪酸成分

2.2.1 樣品溶液制備 精密稱取長(zhǎng)白山林下仿野生栽培紫芝孢子油5 mg，加1 mL正己烷超聲提取30 min，靜置，取上清待用[13-15]。

2.2.2 方法與條件 工作條件：DB-1MS石英毛細(xì)管色譜柱(30.00 m×0.25 mm×0.25 μm)；進(jìn)樣口260 ℃，柱溫70 ℃(2 min)～290 ℃(5 min)，10 ℃/min；氣質(zhì)接口280 ℃載體為He，流速1.2 mL·min-1。進(jìn)樣量為1 μL；離子源溫度230 ℃，四極桿溫度50 ℃。電離方式EI，電子能量70eV。數(shù)據(jù)采集電子掃描范圍35～500 aum[13-15]。

2.3 應(yīng)用苯酚-硫酸法測(cè)定提取紫芝油后藥材殘?jiān)卸嗵?/p>

2.3.1 供試品溶液制備 稱取長(zhǎng)白山林下仿野生栽培紫芝提取紫芝油后藥材殘?jiān)? g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加蒸餾水20 mL，100 ℃回流提取3次，每次1 h，過(guò)濾，合并濾液，加乙醇至75%，靜置過(guò)夜，過(guò)濾，濾液減壓回收乙醇至無(wú)醇味，剩余水液凍干，得棕黃色粗多糖，備用。取粗多糖1 mg，加蒸餾水，超聲溶解，定容至1 mL量瓶中，搖勻，即得。

2.3.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取干燥至恒重的D-無(wú)水葡糖糖對(duì)照品10 mg于100 mL容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，得到0.1 mg·mL-1的對(duì)照品溶液，置冰箱中備用。

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密吸取對(duì)照品溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL分別置于具塞試管中，各加蒸餾水至1 mL，加入5%的苯酚1 mL，快速加入硫酸溶液5 mL搖勻，放至5 min水浴加熱15 min，冷卻至室溫，以蒸餾水1 mL為空白，同法操作，于490 nm處測(cè)定吸光度(A)，以質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)，A為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[16-17]，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=8.675 7C+0.014 0(r=0.995 2)，線性范圍0.02～0.1 mg·mL-1[21-22]。

2.3.4 精密度試驗(yàn) 精密量取對(duì)照品溶液6份，各0.4 mL，分別加蒸餾水定容至1 mL，按2.3.3方法連續(xù)測(cè)定，結(jié)果RSD 2.5%，表明儀器精密度良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一樣品6份，按2.3.1制備供試品溶液，按2.3.3方法測(cè)定，計(jì)算總多糖含量，結(jié)果RSD 3.7%，表明重復(fù)性良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取供試品溶液1mL，按2.3.3方法操作，分別于0，1，2，3，4 h測(cè)定A，結(jié)果吸光度RSD 1.8%，表明供試品溶液在4 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.7 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批已知含量的供試品6份各0.5 g，分別加入適量葡萄糖溶液，按2.3.1制備供試品溶液，按2.3.3測(cè)定A?；厥章试?8.7%～103.9%，RSD 2.6%。

2.3.8 樣品含量測(cè)定 稱取長(zhǎng)白山林下仿野生栽培紫芝提取紫芝油后藥材殘?jiān)?，?.3.1制備供試品溶液，平行3份。精密吸取0.1 mL至試管中，按2.3.3測(cè)定其吸光度A。

3 結(jié)果與討論

3.1 紫芝油中三萜類成分分析

采用LC-MS聯(lián)用技術(shù)，根據(jù)每一組分的保留時(shí)間、色譜紫外吸收特征、準(zhǔn)分子離子峰和二級(jí)質(zhì)譜碎片信息，并參考文獻(xiàn)[5-13]進(jìn)行解析，鑒定了長(zhǎng)白山林下仿野生栽培紫芝油中15個(gè)三萜類化學(xué)成分的可能結(jié)構(gòu)，結(jié)果見(jiàn)圖1，表2。

在長(zhǎng)白山林下仿野生栽培紫芝油總?cè)浦幸呀?jīng)初步確定了15個(gè)三萜酸的結(jié)構(gòu)，其中13個(gè)集中在9.3～21.0 min，它們的峰面積占總色譜峰面積的93.4%。而長(zhǎng)白山林下仿野生栽培紫芝油總?cè)频馁|(zhì)量占紫芝油的40%，說(shuō)明長(zhǎng)白山林下仿野生栽培紫芝油中含有較豐富的三萜酸類成分。

3.2 紫芝油中脂肪酸成分分析

長(zhǎng)白山林下仿野生栽培紫芝孢子油經(jīng)GC-MS鑒定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明至少有15個(gè)特征峰出現(xiàn)，共檢出油酸，亞油酸，肉豆蔻酸，棕櫚酸，2，3，4-三甲基癸烷，1-甲氧基-4-(1-丙烯基)苯等15種化合物。采用面積歸一化計(jì)算各組分的相對(duì)含量，總離子流圖和化合物鑒定詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)圖2、表3。

圖1 長(zhǎng)白山林下仿野生栽培紫芝油中三萜類成分的液相色譜圖和總離子流圖

表2 長(zhǎng)白山林下仿野生栽培紫芝油三萜類成分正離子掃描模式的LC-MS分析結(jié)果

*Ganoderic acid AM1的準(zhǔn)分子離子峰和碎片峰為負(fù)離子模式下檢測(cè)，標(biāo)注為[M-H]-。

圖2 長(zhǎng)白山林下仿野生栽培紫芝油脂肪酸類成分GC-MS分析總離子流圖

表3 長(zhǎng)白山林下仿野生栽培紫芝油脂肪酸類成分GC-MS分析結(jié)果

由表3可知，長(zhǎng)白山林下仿野生栽培紫芝油中富含多種脂肪酸，不飽和脂肪酸占68.9%，其中油酸占47.397%，亞油酸占21.491%；飽和脂肪酸以硬脂酸，棕櫚酸，肉豆蔻酸為主，含量分別為4.414%，9.606%和0.991%。此外，紫芝油樣品中還檢測(cè)出少量2，6-二甲基壬烷，3，6-二甲基癸烷，2，6，10，14-四甲基十六烷，2，3，4-三甲基癸烷，二十五烷，二十八烷，二十七烷類烷烴，以及芳香類化合物1-甲氧基-4-(1-丙烯基)苯，2，5-二叔丁基酚。以上分析數(shù)據(jù)為利用長(zhǎng)白山林下仿野生栽培紫芝孢子油提供了科學(xué)依據(jù)。

3.3 提取紫芝油后藥材殘?jiān)嗵菧y(cè)定

1 g長(zhǎng)白山林下仿野生栽培紫芝提取紫芝油后藥材殘?jiān)?jīng)提取純化得到粗多糖22.7 mg，測(cè)得粗多糖中多糖含量為34.7%，折合藥材殘?jiān)卸嗵呛繛?.79%。

3.4 討論

采用LC-MS方法對(duì)長(zhǎng)白山林下仿野生栽培紫芝中三萜類成分進(jìn)行分析，結(jié)果紫芝油中含有較豐富的三萜酸類成分，而且現(xiàn)已經(jīng)初步確定了15個(gè)三萜酸的結(jié)構(gòu)；采用GC-MS法對(duì)紫芝油中脂肪酸類物質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)和含量分析，結(jié)果紫芝油中富含多種脂肪酸，其中不飽和脂肪酸占總量的68.9%，與文獻(xiàn)報(bào)道的靈芝中不飽和脂肪酸含量(61.2%～73.6%)無(wú)明顯差別[13-17]；尤其是長(zhǎng)白山林下仿野生栽培紫芝提取紫芝油后的藥材殘?jiān)嗵橇亢繛?.79%，略高于《中華人民共和國(guó)藥典》2010版靈芝中多糖含量不低于0.5%的標(biāo)準(zhǔn)[1]。

現(xiàn)代藥理研究表明，紫芝具有良好的抗腫瘤、提高免疫力、清除自由基和抑菌等活性，而紫芝所含的三萜、多糖和不飽和脂肪酸類成分系其主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。其中紫芝胞內(nèi)酸性三萜和胞外酸性三萜在250 μg·mL-1時(shí)，對(duì)人肝癌細(xì)胞BEL7402和人乳腺癌細(xì)胞MCF-7均有顯著抑制作用，另外紫芝含有的三萜類化合物Ganoderic acid F和Ganoderic acid Z具有阻止乳癌生長(zhǎng)的作用，可作為治療癌癥的輔助劑[19，23]。紫芝胞內(nèi)酸性三萜在40 mg·mL-1時(shí)，對(duì)大腸桿菌Escherichia coli和金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus的生長(zhǎng)均具有顯著抑制作用，且紫芝胞外三萜物質(zhì)也表現(xiàn)出不同抑菌活性，其中對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的最小抑菌濃度分別為30、30、60 mg·mL-1[24-25]。在紫芝總多糖口服給藥劑量為40.5 mg·kg-1時(shí)，對(duì)H22肝癌小鼠的抑瘤率為63.94%，對(duì)Lewis肺癌小鼠的抑瘤率為58.32%，表現(xiàn)出較明顯的抗癌活性；對(duì)紫芝液體深層發(fā)酵菌絲體精制多糖進(jìn)行進(jìn)一步分離純化得到的單一組分GS-A-1對(duì)荷瘤小鼠由環(huán)磷酰胺引起的化療損傷具有保護(hù)作用[26-27]。而紫芝粗多糖經(jīng)DEAE-52柱層析純化得到的3種多糖組分GSP1、GSP2和GSP3，均具有抗氧化活性，其中GSP2在1.6 mg·mL-1時(shí)DPPH自由基清除率達(dá)到76.3%，抗氧化活性尤為明顯[28]。紫芝富含的不飽和脂肪酸中油酸、亞油酸則能通過(guò)提高SOD活性等作用表現(xiàn)出顯著的清除自由基活性，以及通過(guò)促進(jìn)正常小鼠幼生IL-2促進(jìn)ConA誘導(dǎo)的脾T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，從而起到調(diào)節(jié)免疫的作用[29]。

綜上，長(zhǎng)白山林下仿野生栽培紫芝具有野生靈芝相當(dāng)?shù)乃幱脙r(jià)值，具有很大的市場(chǎng)開(kāi)發(fā)前景。目前，以靈芝中三萜和不飽和脂肪酸類成分開(kāi)發(fā)的靈芝油軟膠囊的產(chǎn)品較多，但提油后剩余物作為工業(yè)殘?jiān)蝗拥?，其中富含的多糖沒(méi)有得到充分利用，十分可惜。為了對(duì)長(zhǎng)白山林下仿野生栽培紫芝資源進(jìn)行科學(xué)合理的綜合利用，根據(jù)本文的研究結(jié)果，應(yīng)進(jìn)一步對(duì)提油后的紫芝殘?jiān)械亩嗵沁M(jìn)行提取純化，進(jìn)而為開(kāi)發(fā)具有免疫調(diào)節(jié)活性的功能食品和藥品奠定基礎(chǔ)。

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AnalysisofMainActiveIngredientsofWild-imitatedGanodermasinenseCultivatedUnderForestofChangbaiMountain

MENG Lingwen，TIANLinlin，LIZhicheng，JICunrui，ZHANGHui*，SUNJiaming*

(ChangchunUniversityofChineseMedicine，Changchun130117，China)

Objective：Three kinds of different active ingredients from the fruiting bodies from wild-imitatedGanodermasinensecultivated under the forest of Changbai mountain have been studied.The experimental data could be used as a basis for its development and utilization.Methods：Triterpenoids ofG.sinenseoil extracted by supercritical CO2were analyzed using LC-ESI-MS/MS.Fatty acid compositions ofG.sinenseoil were analyzed by GC-MS.The polysaccharide ofG.sinenseresidue after extracted oil was measured by phenol-sulfuric acid method.Results：G.sinenseoil contained rich triterpenoids.The total triterpenoid content was 40% ofG.sinenseoil，in which 15 triterpenes have benn initially identified including ganoderic acid A by LC-MS.15 fatty acids were detected inG.sinenseoil，in which unsaturated fatty acid content is 68.9% and the content of oleic acid and linoleic aeid is the most.The content of sugars in polysaccharide fromG.sinenseresidue after extracted oil was 0.79%；Conclusion：G.sinense oil contains rich triterpenoids，fatty acids and polysaccharides，which indicate that wild-imitatedG.sinensecultivated under the forest of Changbai mountain has great application value for development.

Changbai mountain；wild-imitated cultivation under the forest；Ganodermasinense；active ingredients

2015-04-20)

中醫(yī)藥行業(yè)科研專項(xiàng)(201207002-05)

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張輝，教授，研究方向：中藥化學(xué)、中藥資源學(xué)；Tel：(0431)86172080，E-mail：zhanghui_8080@163.com 孫佳明，教授，研究方向：中藥化學(xué)、中藥資源學(xué)； E-mail：sun_jiaming2000@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.2.002