大孔樹脂對(duì)黃芪總皂苷的分離純化研究△

王登斌，鄒準(zhǔn)，陳文財(cái)，鄒節(jié)明

(桂林三金藥業(yè)股份有限公司，廣西 桂林 541004)

大孔樹脂對(duì)黃芪總皂苷的分離純化研究△

王登斌，鄒準(zhǔn)，陳文財(cái)，鄒節(jié)明*

(桂林三金藥業(yè)股份有限公司，廣西 桂林 541004)

目的：優(yōu)化黃芪中黃芪總皂苷的分離和純化工藝。方法：以總皂苷為指標(biāo)，考察5種商品化大孔樹脂(D101、AB-8、HPD300、HPD600、DM130)在靜態(tài)和動(dòng)態(tài)情況下對(duì)黃芪總皂苷的吸附和解吸性能。結(jié)果：HPD300樹脂純化效果最好，當(dāng)按上柱生藥量∶樹脂量=2∶1的吸附量吸附，4 BV 70%乙醇洗脫時(shí)，分離純化效果最佳。黃芪甲苷的洗脫率達(dá)86.5%，純度為33.8%。結(jié)論：優(yōu)化后的大孔樹脂純化工藝穩(wěn)定，適于黃芪總皂苷的分離和純化。

黃芪；黃芪甲苷；大孔樹脂；高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法

黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜莢黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根。其主要成分為皂苷類、多糖類及黃酮類?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃芪總皂苷具有穩(wěn)定紅細(xì)胞膜、提高血漿組織內(nèi)環(huán)腺苷酸(CAMP)的含量、增強(qiáng)免疫力、抗疲勞、耐缺氧等多種藥理作用[1]。

大孔樹脂吸附是20世紀(jì)70年代開發(fā)應(yīng)用的吸附分離材料，其吸附分離過程綜合了機(jī)械篩分和化學(xué)吸附原理，具有吸附性獨(dú)特、選擇性高、不受無機(jī)物影響、使用周期長、節(jié)省費(fèi)用等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于皂苷類物質(zhì)的提取[2-3]。有關(guān)大孔樹脂對(duì)中藥中皂苷類和黃酮類成分純化的報(bào)道已有不少[4]，但對(duì)黃芪中總皂苷類成分的相關(guān)報(bào)道相對(duì)較少[5-6]。本文從5種不同極性的大孔樹脂中篩選出一種型號(hào)為HPD300的樹脂，并研究了該樹脂對(duì)黃芪提取液中黃芪總皂苷在靜態(tài)和動(dòng)態(tài)下的吸附解吸性能，為工業(yè)分離純化黃芪總皂苷提出了技術(shù)性探索。

1 材料與儀器

1.1 儀器

Alliance高效液相色譜系統(tǒng)、2695高壓泵(美國Waters公司)；Alltech-6000蒸發(fā)光散檢測器(Alltech公司)；phenomenex luna C18柱(美國菲羅門公司)；分析天平(日本Mettler公司)；HZS-HA恒溫振蕩器(哈爾濱東明醫(yī)療儀器廠)。

1.2 材料

黃芪藥材購自廣西中南藥業(yè)；黃芪甲苷對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110781-201314)；D101、AB-8(天津南開大學(xué)化工廠)；HPD300、HPD600、DM130(滄州寶恩生化制劑廠)；色譜級(jí)乙腈(TIDA公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃芪甲苷的測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：phenomenex luna C18(250 mm×4.6 mm，5μm)；流動(dòng)相：乙腈-水(35∶65)；漂移管溫度：88 ℃；氮?dú)饬魉伲?.4 mL·min-1。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 取黃芪甲苷對(duì)照品，精密稱定，加甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為0.492 mg·mL-1的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取黃芪提取物約50 mg，精密稱定，置錐形瓶中，加甲醇50 mL，超聲處理30 min，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取2.1.2項(xiàng)下的對(duì)照品溶液，精密吸取2、4、6、8、10 mL，分別移至10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻。分別吸取各標(biāo)準(zhǔn)液20 μL，注入液相色譜儀，按2.1.1色譜條件測定峰面積。以黃芪甲苷進(jìn)樣量(μg)的常用對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)(X)，峰面積常用對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=2.208 6X+9.675 3，r=0.999 3。結(jié)果表明，黃芪甲苷在1.968～9.840 μg有良好的線性關(guān)系。

2.1.5 樣品測定 按2.1.3項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，依法測定，計(jì)算黃芪甲苷的量。色譜圖見圖1～2。

2.2 黃芪的提取和純化

2.2.1 黃芪提取液的制備 取黃芪藥材5 kg，加入含2%氫氧化鈉(NaOH)的70%乙醇溶液，提取2次，每次2 h，濾過，合并濾液?；厥找掖贾翢o醇味，加水適量，高速離心，稀釋成0.4 g·mL-1(生藥計(jì))的樣品液，作為提取液。經(jīng)測定，黃芪甲苷的質(zhì)量濃度為為8.12 mg·mL-1。

圖1 黃芪甲苷對(duì)照品色譜圖

圖2 大孔樹脂純化后的黃芪提取物供試樣色譜圖

2.2.2 樹脂的選擇 參照文獻(xiàn)[7]方法，取D101、AB-8、HPD300、HPD600、DM130 5種樹脂，用95%乙醇浸泡24 h，充分溶脹，然后用95%乙醇不斷沖洗，至1份流出液加3份純化水不出現(xiàn)渾濁為止，再用純化水沖洗至無醇味，備用。

不同吸附樹脂對(duì)黃芪甲苷的靜態(tài)飽和吸附實(shí)驗(yàn)：稱取預(yù)處理過的D101、AB-8、HPD300、HPD600、DM130各5 g，置具塞錐形瓶中，分別加入黃芪提取液各50 mL，塞緊瓶塞，置于振蕩器上，振搖吸附24 h，使樹脂對(duì)黃芪提取液中黃芪甲苷的吸附達(dá)到平衡狀態(tài)，靜置，濾過，得吸附后黃芪甲苷溶液；再將靜態(tài)吸附的樹脂抽干，加30 mL 95%乙醇解吸，放入搖床上振蕩6 h，濾過，得黃芪甲苷洗脫液。分別取吸附后溶液、洗脫液各2 mL，蒸干，按2.1.3項(xiàng)下方法制得供試品溶液，測得溶液中黃芪甲苷量，計(jì)算吸附率和洗脫率。結(jié)果見表1。

表1 5種樹脂對(duì)黃芪甲苷的靜態(tài)吸附-洗脫性能實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由上表1中吸附率可看出：吸附率排序?yàn)镠PD600>HPD300>AB-8>DM130>D101；解吸率排序?yàn)镠PD300>AB-8>DM130>HPD600>D101。結(jié)果表明，靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)中，HPD300、AB-8型樹脂對(duì)樣品中黃芪甲苷的吸附率和洗脫率均高于D101、DM130樹脂，HPD600型樹脂吸附率雖高，但洗脫率太低?？紤]到靜態(tài)吸附與動(dòng)態(tài)吸附之間存在一定差異，我們選取靜態(tài)吸附、解吸性能較好的HPD300、AB-8型樹脂，進(jìn)一步考察其對(duì)黃芪甲苷的動(dòng)態(tài)吸附性能。

HPD300、AB-8吸附樹脂對(duì)黃芪甲苷的動(dòng)態(tài)飽和吸附實(shí)驗(yàn)：取預(yù)處理過的HPD300、AB-8適量，分別濕法裝柱(17 cm×1.5 cm)，柱體積約為30 mL，以質(zhì)量濃度為0.4 g·mL-1(生藥計(jì))的黃芪提取液上樣，流速為2 BV·h-1，分別收集流出液，每流出15 mL(相當(dāng)于0.5 BV)收集1瓶，作為一組份，測定黃芪甲苷含量，繪制各樹脂的泄漏曲線，結(jié)果見圖3。

圖3 HPD300、AB-8樹脂動(dòng)態(tài)吸附泄漏曲線

由圖3可見，等量柱體積的HPD300、AB-8兩種樹脂，對(duì)同一黃芪提取液進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，HPB300出現(xiàn)泄漏點(diǎn)和達(dá)到吸附飽和時(shí)，所加黃芪提取液量均高于AB-8樹脂，說明HPB300樹脂動(dòng)態(tài)飽和吸附量大于AB-8樹脂。

HPD300、AB-8吸附樹脂對(duì)黃芪甲苷的動(dòng)態(tài)解吸實(shí)驗(yàn)：取預(yù)處理過的HPD300、AB-8適量，分別濕法裝柱(17 cm×1.5 cm)，柱體積約為30 mL，以質(zhì)量濃度為0.4 g·mL-1(生藥計(jì))的黃芪提取液上樣，以2 BV·h-1的流速吸附后，先用2 BV水洗脫，再用70%乙醇以2 BV·h-1的流速洗脫，每流出15 mL(相當(dāng)于0.5 BV)收集1瓶，作為一組份，測定黃芪甲苷含量，繪制解吸曲線，結(jié)果見圖4。

圖4 HPD300、AB-8樹脂動(dòng)態(tài)解吸曲線

由圖4可見，HPD300對(duì)黃芪甲苷的解吸效果優(yōu)于AB-8。綜合兩種吸附樹脂對(duì)黃芪甲苷的動(dòng)態(tài)吸附和解吸性能，選用HPD300樹脂來分離純化黃芪提取液中總皂苷效果最佳。

2.2.3 洗脫劑濃度的篩選 將一定量的黃芪提取液通過樹脂柱，流速為2 BV·h-1，吸附結(jié)束后，用水洗至流出液不顯Molish反應(yīng)，再依次用10%、30%、50%、70%、90%洗脫劑洗脫，速度為2 BV·h-1，每個(gè)濃度洗脫4 BV，收集洗脫液，測定洗脫液中黃芪甲苷的含量。以測定結(jié)果繪制解吸曲線，見圖5。

注：1～4號(hào)10%乙醇解吸液；5～8號(hào)30%乙醇解吸液；9～12號(hào)50%乙醇解吸液；13～16號(hào)70%乙醇解吸液；17～20號(hào)90%乙醇解吸液。圖5 不同洗脫劑濃度乙醇對(duì)黃芪甲苷純化的影響

洗脫曲線顯示，黃芪甲苷主要集中在50%、70%乙醇洗脫液中。另取黃芪提取液2份，每份30 mL，分別上柱，先用2 BV水洗脫，再分別用50%、70%乙醇溶液各100 mL洗脫，測定黃芪甲苷洗脫率分別為71.2%、88.5%，70%乙醇的解吸效果優(yōu)于50%乙醇，故確定洗脫條件為先水洗去雜質(zhì)后，再用70%乙醇洗脫，收集70%乙醇洗脫部分。

2.2.4 吸附容量的確定 取處理后的大孔樹脂3根，吸取黃芪提取液40 mL，上柱，預(yù)吸附1 h，過柱流出液重吸附1次，靜置吸附12 h，先用2 BV水洗脫，再用70%乙醇洗脫，收集70%乙醇洗脫液，平行測定3次，測定黃芪甲苷含量，計(jì)算吸附容量。結(jié)果見表2。

表2 黃芪甲苷吸附容量的測定

注：吸附容量=(上柱液中黃芪甲苷含量-過柱液中黃芪甲苷含量)/樹脂干重。

2.2.5 上樣量的確定 取質(zhì)量濃度為0.4 g·mL-1(生藥計(jì))的黃芪提取液上樣，以0.5 BV為單位收集流出液，測定黃芪甲苷含量，考察黃芪甲苷泄漏點(diǎn)。結(jié)果顯示，出現(xiàn)泄漏的最高量為4 BV柱體積。折算成黃芪生藥量與樹脂量的比例為2.2∶1，考慮生產(chǎn)實(shí)際偏差，確定上柱生藥量與樹脂量之比為2∶1。

2.2.6 洗脫劑量的確定 取120 mL的黃芪提取液，通過預(yù)處理過的HPD300樹脂層析柱(1 BV=30 mL)，吸附結(jié)束后，先用2 BV水洗脫，棄去。再用70%乙醇以2 BV·h-1的速度進(jìn)行洗脫，按順序每0.5 BV收集1瓶，共收集9瓶。測定各號(hào)瓶中黃芪甲苷的含量，以測定結(jié)果繪制動(dòng)態(tài)解析曲線。見圖6。

由圖6可知，用4 BV 70%乙醇溶液，可將吸附的黃芪甲苷解析下來，因而確定洗脫劑用量為4倍柱體積的70%乙醇溶液。

圖6 黃芪甲苷的動(dòng)態(tài)解吸曲線

分別取上柱液、過柱液、解析液適量，蒸干，按2.1.3項(xiàng)下的方法制得供試品溶液，測定，計(jì)算黃芪甲苷動(dòng)態(tài)吸附率和解析率，結(jié)果見表3。

表3 HPD300樹脂對(duì)黃芪甲苷的吸附率與解析率

2.2.7 驗(yàn)證試驗(yàn) 按上述試驗(yàn)得出的優(yōu)選工藝條件進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，分別取黃芪提取液(黃芪甲苷質(zhì)量濃度為8.12 mg·mL-1)2000 mL，通過裝有預(yù)處理過的400 g HPD300樹脂柱中，先用2 BV水洗脫，棄去。再用4 BV 70%乙醇洗脫，收集70%乙醇洗脫部分，濃縮，干燥，得黃芪提取物，測定。結(jié)果見表4。

表4 3次驗(yàn)證試驗(yàn)測定結(jié)果

2.2.8 大孔樹脂使用次數(shù)考察 取3份預(yù)處理過的HPD300樹脂，分別濕法裝柱，各吸取黃芪提取液40 mL，以2 BV·h-1的流速吸附后，先用2 BV水洗脫，再用4 BV 70%乙醇以2 BV·h-1的流速洗脫。分別收集過柱液、洗脫液，測定黃芪甲苷含量，計(jì)算樹脂柱吸附容量。最后用適量蒸餾水沖洗樹脂至滴出液無醇味，不經(jīng)再生，重復(fù)以上操作，以使用次數(shù)為橫坐標(biāo)，吸附容量為縱坐標(biāo)作圖，見圖7。

圖7 HPD300樹脂柱連續(xù)使用過程中黃芪甲苷吸附容量的變化

由圖7可知，樹脂初次使用時(shí)，黃芪甲苷吸附容量約為61.8 mg·g-1，使用次數(shù)增加，樹脂吸附能力有所下降。本實(shí)驗(yàn)中，連續(xù)使用18次后，黃芪甲苷吸附容量為原來的72.1%。因而可認(rèn)為樹脂首次使用后，在連續(xù)使用18次后，需要經(jīng)過再生后才能使用。

2.2.9 大孔樹脂再生方法考察 一般來講，用95%乙醇洗脫至無色，再水洗至無醇味，即可再用。但若樹脂受污染嚴(yán)重，顏色變深，吸附能力降低，應(yīng)用強(qiáng)酸堿液再生處理。本實(shí)驗(yàn)中樹脂使用18次后顏色略有變深，因而考慮用95%乙醇洗脫再生。

對(duì)已使用過18次的HPD300樹脂，先用95%乙醇浸泡2 h，裝柱，再用95%乙醇洗至滴出液無色，最后用大量水洗至無醇味，再重新上樣，考察再生后樹脂柱的吸附容量、吸附率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。

表5 95%乙醇洗脫再生工藝考察

結(jié)果表明，用95%乙醇再生后，樹脂對(duì)黃芪甲苷的吸附容量可達(dá)到新樹脂的95.5%，再生連續(xù)使用3次，樹脂對(duì)黃芪甲苷的吸附容量可達(dá)到新樹脂的93.6%。由此說明，采用95%乙醇洗脫對(duì)樹脂進(jìn)行再生是可行的。

3 討論

黃芪甲苷是黃芪藥材重要的藥效活性物質(zhì)，但其含量較低，各產(chǎn)地藥材間差別較大[8]，質(zhì)量控制較為困難。近年來，多篇文獻(xiàn)[9-12]報(bào)道了在黃芪藥材提取或制劑分析中采用堿液處理方法，以提高黃芪甲苷的含量。本實(shí)驗(yàn)中，我們通過優(yōu)化工藝參數(shù)，選擇水解條件相對(duì)溫和的堿性乙醇回流提取黃芪總皂苷。通過皂化反應(yīng)，將黃芪中眾多環(huán)黃芪醇皂苷配糖體上含-OAC基團(tuán)轉(zhuǎn)化為-OH，提高了黃芪甲苷的含量。經(jīng)測定，水解前后樣品中總皂苷含量無明顯差異，但水解后樣品中黃芪甲苷的含量增加了近20倍。由于總皂苷中各種原生皂苷的種類和比例通過堿液水解后有了較大的變化，黃芪甲苷含量顯著提高后與原總皂苷相比是否具有增效作用還需結(jié)合具體功能作進(jìn)一步的藥理驗(yàn)證。

本文通過5種大孔樹脂對(duì)黃芪總皂苷的吸附、純化性能的對(duì)比篩選，最后選定HPD-300型樹脂作為純化樹脂。黃芪提取物經(jīng)HPD-300樹脂精制后，黃芪甲苷含量可達(dá)33.8%，精制度平均可達(dá)545.2%。

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StudyonSeparationandPurificationofTotalSaponinsfromRadixAstragaliwithMacropereResin

WANG Dengbin，ZOUZhun，CHENWencai，ZOUJieming*

(GuilinSanjinPharmaceuticalCo.，Ltd.，Gangxi，Guilin541004，China)

Objective：To optimize the separation and purification processes of total saponins from Radix Astragali.Methods：The adsorption and desorption properties of total saponins of Astragalus(D101、AB-8、HPD300、HPD600、DM130)under static and dynamic conditions were investigated with the content of total saponins as index。Results：The purification effect of HPD300 resin was optimal，when the loading quantities was 2∶1(crude drug of Radix Astragali：macropere Resin)，With 70% ethanol as eluant，the amount was 4BV.The Desorption ratio and product purity reached 86.5% and 33.8% separately.Conclusion：The optimized macroporous resin purification process is stable and feasible，and can be used for separation and purification of total saponins of Astragalus.

Macropere resin；Radix Astragali；Astragaloside Ⅳ；HPLC-ELSD

2015-07-15)

廣西科技攻關(guān)項(xiàng)目(桂科攻14124004-2-10)

*

鄒節(jié)明，教授級(jí)高工，研究方向：中藥現(xiàn)代化；Tel：(0773)5842588，E-mail：zjm@sanjin.com.cn

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.2.019