陰坡、陽坡連翹及連翹葉中不同成分含量的比較△

王芳，白吉慶，黎丹，王小平，王金，胡錦蘋

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046)

陰坡、陽坡連翹及連翹葉中不同成分含量的比較△

王芳，白吉慶，黎丹，王小平*，王金，胡錦蘋

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046)

目的：比較陰坡、陽坡對(duì)連翹及連翹葉中不同成分含量的影響。方法：采用HPLC法測(cè)定連翹及連翹葉中蘆丁、連翹酯苷A及連翹苷的含量，采用水蒸汽蒸餾法提取并測(cè)定連翹中揮發(fā)油的含量。結(jié)果：陰坡、陽坡連翹中揮發(fā)油、連翹苷和連翹酯苷A的含量差異均不明顯；陰坡、陽坡連翹葉中蘆丁、連翹苷的含量差異不明顯，但連翹葉中連翹酯苷A的含量差異顯著，陰坡含量高達(dá)10.0%以上，陽坡含量?jī)H2.65%；連翹葉中主要成分的含量陰坡均高于陽坡；在同一坡向，連翹葉中連翹苷和連翹酯苷A的含量均高于連翹中含量，特別是連翹酯苷A的含量在連翹葉中幾乎是連翹中9倍。結(jié)論：陰坡、陽坡對(duì)連翹中的主要成分的含量沒有顯著影響，而連翹葉中主要成分的含量陰坡高于陽坡，并且連翹葉中連翹酯苷A的含量陰坡、陽坡影響較大，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

陰坡；陽坡；連翹；連翹葉；連翹酯苷A

連翹為木犀科植物連翹Forsythiasuspensa(Thunb.)Vahl的干燥果實(shí)，具有清熱解毒，消腫散結(jié)，疏散風(fēng)熱之功效[1]。其葉夏、秋季采集，鮮用或曬干，具有清熱解毒之功效[2]。二者具有基本相同的化學(xué)成分[3]?，F(xiàn)代藥理研究表明，連翹及其葉具有抑菌、降血糖、抗病毒、抗氧化、抗肝損傷、抗衰老、抑制癌細(xì)胞增殖等多種生物活性[4-9]。有研究表明，由于陰坡、陽坡植物土壤含水量、含氮、磷及有機(jī)物量的差異，植物生長(zhǎng)和產(chǎn)量等均有所不同[10]，本實(shí)驗(yàn)取以陰坡、陽坡的連翹及連翹葉為研究對(duì)象，以揮發(fā)油、蘆丁、連翹酯苷A和連翹苷的含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)陰坡、陽坡連翹及連翹葉進(jìn)行比較分析，為連翹及其葉的進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)參考。

1 儀器與試藥

101-2型電熱鼓風(fēng)干燥箱(北京科偉永興儀器設(shè)備有限公司)，賽多利斯BT125D型雙量程電子分析天平(賽多利斯股份有限公司)，戴安UitiMate 3000 全自動(dòng)高效液相色譜儀(二極管陣列檢測(cè)器)。

連翹苷對(duì)照品(批號(hào)：110821-200711)；蘆丁對(duì)照品(批號(hào)：080-9705)；

連翹酯苷A對(duì)照品(批號(hào)：111810-201103)；上述對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定研究院。乙腈為色譜純；水為純化水；冰醋酸等為分析純。

連翹及連翹葉于2013年7月、8月間采于陜西省銅川市耀州區(qū)小丘鎮(zhèn)，每個(gè)樣本數(shù)不低于3批，經(jīng)陜西中醫(yī)學(xué)院白吉慶副教授鑒定為木犀科植物連翹Forsythiasuspense(Thunb.)Vahl的果實(shí)及其葉。

2 方法與結(jié)果

2.1 藥材處理

將采摘下的連翹及連翹葉60 ℃干燥至水分低于10.0%，取出，即得。

2.2 連翹中揮發(fā)油的測(cè)定[1]

取連翹粉末約30 g(過五號(hào)篩)，置圓底燒瓶中，加水300 ml與玻璃珠數(shù)粒，連接揮發(fā)油測(cè)定器與回流冷凝管。自冷凝管上端加水使充滿揮發(fā)油測(cè)定器的刻度部分，以溢流入燒瓶為止，置電熱套中緩緩加熱至微沸，并保持5 小時(shí)至油量不再增加，停止加熱，放置1 小時(shí)，再開啟活塞使油層下降至其上端恰與刻度0平齊，讀取揮發(fā)油量，并計(jì)算供試品中所含揮發(fā)油的含量(%)。

2.3 連翹中連翹苷與連翹酯苷A的含量測(cè)定[1]連翹苷

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 采用HPLC法，色譜柱為Hypersil GOLD C18 柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，乙腈-水(25∶75)為流動(dòng)相，體積流量1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為277 nm，柱溫為25 ℃。理論塔板數(shù)按連翹苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。

對(duì)照品溶液的制備 精密量取連翹苷對(duì)照品3.96 mg，置25 ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻。

供試品溶液的制備 取各樣品粉末(過五號(hào)篩)約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇15 mL，稱定重量，浸漬過夜，超聲25分鐘，放冷，補(bǔ)足重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5 mL，蒸至近干，加中性氧化鋁0.5 g拌勻，加在中性氧化鋁柱上，用70%乙醇80 mL洗脫，收集洗脫液，濃縮至干，殘?jiān)?0%甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

分別精密吸取上述對(duì)照品溶液1、2、3、4、5、6、8、10 μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件分析測(cè)定，每個(gè)體積進(jìn)樣2 次，記錄各對(duì)照品的峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，對(duì)照品質(zhì)量為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y連翹苷=7.861X+0.09，r=1；結(jié)果表明連翹苷在0.16～1.90 μg線性關(guān)系良好。

測(cè)定法 精密吸取供試品溶液適量，注入液相色譜儀測(cè)定，代入上述回歸方程計(jì)算，即得。

連翹酯苷A

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 采用HPLC法，色譜柱為Hypersil GOLD C18 柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，乙腈-0.4%冰醋酸溶液(15∶85)為流動(dòng)相，體積流量1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為330 nm，柱溫為25 ℃。理論塔板數(shù)按連翹酯苷A峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。

對(duì)照品溶液的制備 精密量取連翹酯苷A對(duì)照品4.76 mg，置50 ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻。

供試品溶液的制備 取各樣品粉末(過五號(hào)篩)約0.01 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇15 mL，稱定重量，超聲30 min，取出，放冷至室溫，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足重量，過濾，取續(xù)濾液，即為供試品溶液。

分別精密吸取上述對(duì)照品溶液1、2、3、4、5 μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件分析測(cè)定，每個(gè)體積進(jìn)樣2 次，記錄各對(duì)照品的峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，對(duì)照品質(zhì)量為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：

Y連翹酯苷A=17.98X+0.088 7，r=0.999 8；結(jié)果表明連翹苷在1.77～8.58 μg線性關(guān)系良好。

測(cè)定法 精密吸取上述對(duì)照品溶液和供試品溶液各適量，注入液相色譜儀測(cè)定，代入上述回歸方程計(jì)算，即得。

2.4 連翹葉中蘆丁、連翹酯苷A與連翹苷的含量測(cè)定

2.4.1 色譜條件 采用HPLC法，色譜柱為Hypersil GOLD C18 柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以乙腈(A)-0.4%冰醋酸溶液(B)為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫(0～8 min，10%～15%A；8～18 min，15%～22%A；18～25 min，22%～40%A；25～30 min，40%～95%A；30～35 min，95%～95%A)；流速為1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為277 nm，柱溫為30 ℃。理論塔板數(shù)按連翹苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。

2.4.2 對(duì)照品溶液的制備 分別稱取連翹苷對(duì)照品、蘆丁對(duì)照品和連翹酯苷A對(duì)照品適量，精密稱定，置25 mL量瓶中，用甲醇制成每1 mL中含連翹苷0.08 mg、含蘆丁0.108 mg、含連翹酯苷A 0.19 mg的溶液，即得。

2.4.3 供試品溶液的制備 取各樣品粉末(過五號(hào)篩)0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇15 mL，稱定重量，超聲提取40 min，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4.4 測(cè)定法 分別精密吸取上述對(duì)照品溶液1、2、4、5、7、8、10 μL，注入液相色譜儀，按2.4.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)體積進(jìn)樣2 次，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，對(duì)照品質(zhì)量為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y蘆丁=11.462X-0.196 2，r=0.999 9；Y連翹酯苷A=8.199 2X-0.018 9，r=0.999 9；Y連翹苷=6.914 3X+ 0.037，r=0.999 9；結(jié)果表明蘆丁在0.108～1.08 μg，連翹酯苷A在0.19～1.90 μg，連翹苷在0.08～0.80 μg線性關(guān)系良好。

分別精密吸取上述供試品溶液適量，在上述色譜條件下進(jìn)樣，記錄峰面積，代入上述回歸方程計(jì)算，即得。見圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品和連翹葉樣品的HPLC圖

2.4.5 方法學(xué)考察 精密度試驗(yàn) 精密吸取 2.4.2 項(xiàng)下對(duì)照品溶液5 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，各記錄蘆丁、連翹酯苷A、連翹苷峰面積，結(jié)果各峰面積的RSD分別為1.08%、1.13%、1.09%，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取2.4.3 項(xiàng)下同一供試品溶液，于0、5、10、15、20 h 分別進(jìn)樣5 μL，記錄蘆丁、連翹酯苷A、連翹苷峰面積，結(jié)果各色譜峰面積的RSD分別為0.99%、0.82%、0.56%，表明供試品溶液在20 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn) 稱取同一連翹葉粉末(過四號(hào)篩)5份，每份0.3 g，精密稱定，按2.4.3 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣5 μL，結(jié)果蘆丁、連翹酯苷A、連翹苷百分含量的RSD分別為1.04%、1.27%、1.51%，表明重復(fù)性良好。

加樣回收率試驗(yàn) 稱取已知含量的同一連翹葉粉末(過四號(hào)篩)6份，每份約0.1 g，精密稱定，然后分別精密加入適量的蘆丁對(duì)照品、連翹酯苷A對(duì)照品、連翹苷對(duì)照品。按2.4.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣5 μL，結(jié)果見表1。

表1 連翹葉中蘆丁、連翹酯苷A、連翹苷加樣回收試驗(yàn)

2.5 結(jié)果

按上述方法檢測(cè)連翹及連翹葉中相關(guān)成分的含量。結(jié)果如表2。

表2 測(cè)定結(jié)果

注：—表示未檢測(cè)

由表2可知，陰坡、陽坡連翹中揮發(fā)油、連翹酯苷A和連翹苷的含量差異較小，分別在2.03%～2.96%、5.73%～7.84%和0.28%～0.53%之間；陰坡、陽坡連翹葉中蘆丁和連翹苷的含量差異較小，分別在1.01%～1.57%和1.73%～3.71%之間，連翹酯苷A的含量含量差異較大，在2.65%～10.18%之間；陰坡連翹葉中主要成分的含量均高于陽坡；連翹葉中連翹酯苷A的含量幾乎是連翹中9倍。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)流動(dòng)相、檢測(cè)波長(zhǎng)、柱溫等條件的篩選，建立了同時(shí)測(cè)定連翹葉中蘆丁、連翹苷和連翹酯苷A的含量的方法，比較了甲醇-水、甲醇-0.4%冰醋酸溶液、乙腈-0.4%冰醋酸和乙腈-水體系的等度和梯度洗脫，結(jié)果乙腈-0.4%冰醋酸溶液梯度洗脫時(shí)，所得色譜圖基線平直，各待測(cè)成分的色譜峰分離度良好，且各待測(cè)成分在30 min內(nèi)均已出峰，此方法實(shí)用、可靠。

本實(shí)驗(yàn)中連翹與連翹葉均同時(shí)采用2010版藥典中連翹項(xiàng)下的含量測(cè)定方法(2.3項(xiàng)下方法)和2.4.1項(xiàng)下方法進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果采用2.4.1項(xiàng)下方法時(shí)連翹中蘆丁分離度較差，影響其含量測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確性，故連翹含量測(cè)定方法采用2.3項(xiàng)下方法；連翹葉采用2.4.1項(xiàng)下方法時(shí)，各待測(cè)成分分離度良好，色譜圖基線平直，故連翹葉采用2.4.1項(xiàng)下方法對(duì)蘆丁、連翹苷、連翹酯苷A進(jìn)行了含量測(cè)定。

通過上述兩種方法的比較，連翹葉中連翹苷與連翹酯苷A含量無顯著性差異，而藥典中連翹苷和連翹酯苷A分別建立了不同的檢測(cè)方法，大大增加了檢測(cè)成本和檢測(cè)周期，本文建立的含量測(cè)定方法可同時(shí)測(cè)定連翹葉中蘆丁、連翹苷和連翹酯苷A的含量，既降低了檢測(cè)成本，又縮短了檢測(cè)周期，該方法準(zhǔn)確可靠、簡(jiǎn)單易行，可為下一步藥典含量方法的制定提供借鑒依據(jù)。

通過比較，發(fā)現(xiàn)陰坡連翹葉中黃酮類成分和木質(zhì)素類成分的含量較高于陽坡，這可能與陰坡、陽坡的土壤厚度、土壤pH值、含水率、有效磷、有效氮和有機(jī)質(zhì)含量等差異[10]有關(guān)，而連翹酯苷A在陰坡、陽坡中的差距也可能與連翹酯苷A的穩(wěn)定性[11]有關(guān)；在同一坡向，連翹葉中連翹苷和連翹酯苷A的含量均高于連翹中含量，特別是連翹酯苷A的含量在連翹葉中幾乎是連翹中的9倍。這可能與有效成分在植物體不同部位的分布相關(guān)。

通過比較，發(fā)現(xiàn)不同生長(zhǎng)期連翹葉中主要成分如連翹酯苷A含量差異較大，這可能與氣候、陽光等多種生態(tài)因子有關(guān)，有待進(jìn)一步考察分析。

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ComparativeStudyonContentofConstituentsinFruitsandLeavesofForsythiasuspensaGrowingonShadeandSunnySlope

WANG Fang，BAIJiqing，LIDan，WANGXiaoping*，WANGJin，HUJinping

(ShaanxiUniversityofChineseMedicine，Xianyang712046，China)

Objective：To compare the content of different constituents infruits and leaves ofForsythiasuspensagrowing on shady and sunny slope.Methods：HPLC was used to determine the content of rutin，forsythiaside A and phillyrin.The steam distillation was applied in the determination of volatile oil.Results：InF.suspensa，the content of volatile oil，forsythiaside A and phillyrin was not significant difference growing on shady and sunny slope；InF.SuspensaLeaves，the difference was insignificant of the content of rutin and forsythiaside A in shady and sunny slope.While a significant difference was existed in the content of forsythiaside A，the content of shady slope was as high as 9.0%，the content of sunny slope wass only 6.3%；The content of main components inF.Suspensaleaves in shady slope were higher than in sunny slope；In the same slope direction，the content of forsythiaside A and phillyrin inF.Suspensaleaves were higher thanF.suspensafruits，especially the content of forsythiaside A inF.Suspensaleaves was almost nine times inF.suspensafruits.Conclusions：Shady sunny slope has no significant effect on the content of the main ingredient inF.suspensafruits，while the content of main components inF.Suspensaleaves of shady slope was higher than that of the sunny slope，especially the content of forsythiaside A，with statistical significance.

Shady slope；sunny slope；Forsythiasuspensa；Forsythiasuspensaleaves；forsythiaside A

2015-06-10)

科技部項(xiàng)目(11C26216103652)；工業(yè)和信息化部項(xiàng)目([2012]369號(hào))；陜西省科技廳項(xiàng)目(2014K14-01-01)；陜西省教育廳(2013JK0834)

*

王小平，教授，研究方向：中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)及新藥開發(fā)；Tel：(029)38185165，E-mail：wangxiaoping323@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.2.014