盾葉薯蕷藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究△

康阿龍，湯迎爽，孫文基

(1.解放軍第451醫(yī)院，陜西 西安 710054；2.解放軍第323醫(yī)院，陜西 西安 710054；3.西北大學(xué) 陜西省生物醫(yī)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710069)

·基礎(chǔ)研究·

盾葉薯蕷藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究△

康阿龍1*，湯迎爽2，孫文基3

(1.解放軍第451醫(yī)院，陜西 西安 710054；2.解放軍第323醫(yī)院，陜西 西安 710054；3.西北大學(xué) 陜西省生物醫(yī)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710069)

目的：建立盾葉薯蕷藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為該藥材及其制劑的質(zhì)量控制提供有效方法。方法：采用顯微和薄層色譜法鑒別，并對10批藥材的水分、浸出物進(jìn)行檢查，采用HPLC對藥材中薯蕷皂苷元含量進(jìn)行了測定。結(jié)果：確定了盾葉薯蕷藥材的顯微特征，建立了TLC鑒別方法，擬定了其水分、浸出物限量。薯蕷皂苷元的進(jìn)樣量在2.36～21.24 μg線性關(guān)系良好(r=0.999 9)，平均回收率為97.33%，RSD=1.28%(n=6)。結(jié)論：該方法操作簡單、重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確可靠，可較全面地控制盾葉薯蕷藥材及其制劑的質(zhì)量。

盾葉薯蕷；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；TLC；HPLC；檢查項(xiàng)；薯蕷皂苷元

盾葉薯蕷為薯蕷科植物盾葉薯蕷DioscoreazingiberensisC.H.Wright的干燥根莖。由于其外形如姜，新鮮時(shí)斷面顯鮮黃至橙黃色，在藥材主產(chǎn)地藥農(nóng)均稱之“黃姜”，是我國特有的藥用植物品種，具有解毒消腫、利濕止痛、活血化瘀功能。用于蜂螫蟲咬、風(fēng)濕腰痛、胸痹心痛、高脂血癥、冠心病等的治療[1]。盾葉薯蕷主要含有甾體皂苷類成分，是主要的甾體激素類藥源植物之一，國內(nèi)多個(gè)省都在大量種植，其中陜西是其最優(yōu)適生地，種植面積較大[2-3]，但目前該藥材還未被收入《中華人民共和國藥典》(《中國藥典》)，沒有一個(gè)較為全面的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。為了更好地對其進(jìn)行開發(fā)利用，我們從其基原、標(biāo)本采集著手，較系統(tǒng)地考察了其水分、浸出物；采用TLC建立了其鑒別方法，并建立了顯微鑒別特征；采用HPLC測定了薯蕷皂苷元的含量[4]；為該藥材及其制劑的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

美國熱電P4000高效液相色譜儀，UV1000檢測器，SEPU3000數(shù)據(jù)工作站(杭州普惠)，電子分析天平(北京賽多利斯天平有限公司，型號：BT25S，d=0.01 mg；型號：BS210S，d=0.1 mg)。

1.2 材料

黃姜素對照提取物(自制)，薯蕷皂苷元對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：1539-200001，供含量測定用)；乙腈為色譜純試劑，水為重蒸水，其他試劑均為分析純。

10份盾葉薯蕷藥材均為自購或自采，經(jīng)西安市食品藥品檢驗(yàn)所謝志民主任藥師鑒定為盾葉薯蕷DioscoreazingiberensisC.H.Wright的干燥根莖，樣品信息見表1。

表1 盾葉薯蕷藥材樣品來源信息表

2 方法與結(jié)果

2.1 植物形態(tài)

多年生草質(zhì)藤本。根莖橫生，呈鹿角狀分枝；表面深棕色，具多數(shù)細(xì)長而堅(jiān)韌的須根，莖纖細(xì)，纏繞性，無毛，具縱皺紋或淺槽，有時(shí)在分枝或葉柄基部兩側(cè)微突出，或具短刺。單葉互生，葉盾形；葉片三角狀卵形或長卵形，長3～11 cm，寬2～9 cm，邊緣淺波狀或全緣，基部心形或近截形；常3裂，中央裂片先端漸尖，兩側(cè)裂片圓耳狀；葉柄略短于葉片?；▎紊?，雌雄異株；雄花序穗狀，腋生，有時(shí)有分枝；花無柄，常2～3朵簇生，僅1～2朵完全發(fā)育；苞片膜質(zhì)，卵形或三角狀卵形；花被片6，卵形，紫紅色，雄蕊6；雌花序有花6～8朵，有短柄，花被6裂，雄蕊退化；子房長圓柱形。蒴果有3翅，干后藍(lán)黑色，表面附有白色粉狀蠟被；翅半月形，長約2.5 cm，寬1.5 cm，頂端微凹，或近于截形，基部狹圓形。見圖1。

2.2 藥材性狀

本品呈近圓柱形，指狀或不規(guī)則分支狀，分支長短不一，直徑1.5～3.0 cm。表皮棕褐色，有明顯白色圓點(diǎn)狀根痕及殘留須根。質(zhì)硬，易折斷，斷面較平坦，灰白色至黃白色，散有黃白色點(diǎn)狀維管束，氣微，味苦。見圖2。

圖1 盾葉薯蕷原植物

圖2 盾葉薯蕷藥材

2.3 顯微鑒別

照《中華人民共和國藥典》2010年版(一部)顯微鑒別法(附錄ⅡC)進(jìn)行石蠟制片和粉末制片，根據(jù)觀察對象不同，滴加相應(yīng)試液，蓋片，顯微鏡下觀察并拍照記錄。

2.3.1 橫切面顯微鑒別 黃姜根莖主要由周皮、基本組織和散生在基本組織中的維管束組成，周皮由木栓層、木栓形成層和栓內(nèi)層組成，木栓層為7～10層排列緊密的厚壁細(xì)胞；基本組織為薄壁細(xì)胞，近圓形，內(nèi)含有多數(shù)淀粉粒，大型黏液細(xì)胞散在，多數(shù)含草酸鈣針晶束。散生維管束分布于基本組織中。見圖3。

注：A.木栓層與皮部(×40)；B.散生維管束(×40)；C.針晶束(×40)。圖3 盾葉薯蕷橫切面圖

2.3.2 粉末顯微鑒別 粉末土黃色，淀粉粒較多，多為單粒，少數(shù)為復(fù)粒；單粒長圓形、橢圓形或腎形，直徑5～20 μm，臍點(diǎn)點(diǎn)狀或狹縫狀，多偏于一側(cè)，草酸鈣針晶束較多，針晶長約50～85 μm?？梢娋呔壖y孔、網(wǎng)紋或梯紋導(dǎo)管，偶見棕色塊狀物。見圖4。

注：A.淀粉粒(×40)；B.草酸鈣針晶束(×40)；C.導(dǎo)管(×40)；D.棕色塊狀物(×40)。圖4 盾葉薯蕷粉末顯微圖

2.4 薄層色譜鑒別

取本品粗粉1 g，加70%乙醇20 mL，超聲處理15 min，靜置30 min，取上清液作為供試品溶液。另取盾葉薯蕷對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。再取黃姜對照提取物適量，加70%乙醇制成1 mL含5.0 mg的溶液，作為對照提取物溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版一部附錄Ⅵ B)試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水(65∶35∶10)10 ℃以下放置過夜后的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以E試劑(取1 g對-二甲氨基苯甲醛，加34 mL鹽酸使溶解，即得)，熱風(fēng)吹至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品及對照藥材色譜相應(yīng)位置上有相同顏色的斑點(diǎn)。見圖5。

注：1、2.黃姜素對照提取物；3.陜西安康樣品 4.陜西旬陽樣品；5.陜西白河樣品；6.陜西銅川樣品；7、8.陜西眉縣樣品；9、10 黃姜素對照提取物。圖5 盾葉薯蕷TLC圖

2.5 水分檢查

照水分測定法(《中國藥典》2010年版附錄Ⅸ H)第一法烘干法(含淀粉和皂苷類成分，不含揮發(fā)油類成分)進(jìn)行測定，結(jié)果見表1。

2.6 浸出物測定

以70%乙醇為溶劑，照浸出物測定法(《中國藥典》2010年版附錄X A)醇溶性浸出物測定法的熱浸法測定，結(jié)果見表2。

表2 盾葉薯蕷藥材檢查項(xiàng)考察結(jié)果 (%)

2.7 薯蕷皂苷元的含量測定

盾葉薯蕷主要含甾體皂苷類成分，我們課題組從其總皂苷中分離鑒定了4種成分，分別為黃姜素A、盾葉新苷、薯蕷皂苷、仟細(xì)皂苷等，也建立了用高效液相色譜法(蒸發(fā)光散射檢測器)直接測定黃姜素A的專屬性方法，但由于目前對照品量還無法滿足日常檢驗(yàn)使用，故我們參考文獻(xiàn)采用高效液相色譜法進(jìn)行了薯蕷皂苷元含量測定[4]。

2.7.1 色譜條件 色譜柱：Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-水(93∶7)；檢測波長：203 nm。流速：1.0 mL·min-1；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：10 μL。在此條件下，薯蕷皂苷元對照品色譜峰理論板數(shù)大于5000，與相鄰色譜峰的分離度良好。對照品與供試品色譜圖見圖6。

注：A.薯蕷皂苷元對照品；B.供試品；1.薯蕷皂苷元。圖6 盾葉薯蕷藥材及對照品HPLC圖

2.7.2 對照品溶液制備 精密稱取經(jīng)干燥的薯蕷皂苷元對照品6.0 mg，用無水乙醇溶解并定容至5 mL，配制成濃度為1.18 mg·mL-1的對照品溶液，即得。

2.7.3 供試品溶液的制備 取本品粉末(過5號篩)約1.0 g，精密稱定，置250 mL圓底燒瓶中，加入含2.5 mol·L-1鹽酸的60%甲醇溶液和石油醚(90～120 ℃)各25 mL，于沸水浴中加熱回流提取6 h。濾過，濾液移至分液漏斗中，靜置分層，待濾液冷卻后，分取上層石油醚相，下層再用石油醚萃取3次(每次25 mL)，合并萃取液。減壓回收溶劑，真空干燥，再用無水乙醇溶解并轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加無水乙醇至刻度，0.45 μL微孔濾膜濾過，即得。

2.7.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取對照品溶液2.0、6.0、10.0、14.0、18.0 μL，依次進(jìn)樣，測定薯蕷皂苷元的峰面積。以峰面積對進(jìn)樣量進(jìn)行回歸，得回歸方程Y=439 985X-544.4，r=0.999 9，以上結(jié)果表明在2.36～21.24 μg薯蕷皂苷元峰面積值與進(jìn)樣量呈良好的線性關(guān)系。

2.7.5 樣品測定 分別精密吸取對照品溶液5、10 μL，供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀中，計(jì)算樣品中薯蕷皂苷元的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表4。

文獻(xiàn)報(bào)道的含量均較高[5]，但收集到的10份樣品測定值卻比較低，原因是多方面的，但高含量種質(zhì)資源的減少是其主要原因之一，也是當(dāng)前盾葉薯蕷種植急需解決的問題?？紤]到實(shí)際狀況，暫定為不得少于0.3%。

表4 盾葉薯蕷中薯蕷皂苷元的測定(n=3) (%)

3 討論

薄層鑒別中，我們參考文獻(xiàn)，采用酸水解后磷鉬酸顯色的鑒別方法[6]，進(jìn)行了鑒別實(shí)驗(yàn)，但由于其專屬性較差，含薯蕷皂苷元的同類藥材如穿龍薯蕷、黃山藥均可檢出；再一方面操作過程需要水解，耗時(shí)長，未將其收入正文。我們采用黃姜提取物(總皂苷)作為對照，專屬性強(qiáng)，色譜信息量大，色譜斑點(diǎn)清晰，可很好鑒定盾葉薯蕷的真?zhèn)巍?/p>

先后比較了甲醇-水系統(tǒng)不同比例、乙腈-水系統(tǒng)不同比例，最終確定流動(dòng)相為乙腈-水(93∶7)最適合該樣品的測定。

該標(biāo)準(zhǔn)的建立，方法簡便、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，對盾葉薯蕷藥材的開發(fā)利用提供了有效的質(zhì)控依據(jù)。

[1] 國家中醫(yī)藥管理局.中華本草：第8冊[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社.1999：252.

[2] 丁志遵，唐世蓉，秦慧貞，等.甾體激素藥源植物[M].北京：科學(xué)出版社，1983：64.

[3] 康阿龍，孫文基，朱朝德，等.盾葉薯蕷引種栽培調(diào)查報(bào)告[J].中藥材，2002，25(7)：8-9.

[4] 鐘世安，華懷杰，賀國文，等.反相高效液相色譜法測定盾葉薯蕷中薯蕷皂甙元[J].光譜實(shí)驗(yàn)室，2006，23(5)：898-901.

[5] 李子輝，程新奇，萬海清.盾葉薯蕷高產(chǎn)的關(guān)鍵制約因素分析[J].中國中藥雜志，2001，26(3)：203-204.

[6] 山東省藥品監(jiān)督管理局.山東中藥材標(biāo)準(zhǔn)[S].濟(jì)南：山東友誼出版社，2003：157-159.

StudyonQualityStandardsofDioscoreaezingiberensisRhizoma

KANGAlong1*，TANGYingshuang2，SUNWenji3

(1.Hospital451ofPLA，Xi’an710054，China；2.Hospital323ofPLA，Xi’an710054，China；3.KeylaboratoryofbiologicalmedicineinShaanxi，NorthwesternUniversity，Xi’an710069，China)

Objective：To establish the quality standard of Dioscoreae zingiberensis Rhizoma for providing the effective quality control method of the herb and its preparations.Methods：10 batch the plants were identified by microscopic and TLC methods，the contents of extract and water were determined.The content of diosgenin in Huangjiang was determined by HPLC.Results：The microscopic characteristics of Dioscoreae zingiberensis Rhizoma had been detected.TLC identification method had been established.The content of moisture and extract had been measured.Diosgenin showed a good linear relationship within the range of 2.36-21.24 μg(r=0.999 9)，The average recovery was 97.33%，and the RSD was 1.28%(n=6).Conclusion：This method is simple，accurate and with good reproducibility，particularly suitable for the comprehensive quality control of Dioscoreae zingiberensis Rhizoma and its preparations.

Dioscoreae zingiberensis Rhizoma；quality standards；TLC；HPLC；check items；diosgenin

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.4.012

2015-03-13)

陜西省中藥材標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目(2010-038)

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康阿龍，主任藥師，研究方向：中藥材鑒定、分析及醫(yī)院藥學(xué)；E-mail：kalong1900@163.com