豬FoxN1基因轉(zhuǎn)錄變異體亞細(xì)胞定位研究

張冬杰，李　苓，汪　亮，劉　娣,

（1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，哈爾濱　150086；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱　150030）

豬FoxN1基因轉(zhuǎn)錄變異體亞細(xì)胞定位研究

張冬杰1，李苓2，汪亮1，劉娣1,2

（1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，哈爾濱150086；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱150030）

FoxN1基因主要表達(dá)于胸腺上皮細(xì)胞和皮膚角質(zhì)細(xì)胞，在胸腺發(fā)育、T細(xì)胞增殖、毛發(fā)生長、指甲發(fā)育等方面發(fā)揮重要作用。FoxN1基因存在多種轉(zhuǎn)錄變異體，人類FoxN1基因已發(fā)現(xiàn)18種轉(zhuǎn)錄變異體。轉(zhuǎn)錄變異體的存在使基因差異表達(dá)和蛋白質(zhì)多樣性存在可能。為深入研究轉(zhuǎn)錄變異體生物學(xué)功能，研究將前期發(fā)現(xiàn)的豬FoxN1基因3種轉(zhuǎn)錄變異體分別連入pEGFP-N1載體內(nèi)，構(gòu)建各自融合蛋白，轉(zhuǎn)入豬PK15細(xì)胞，利用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)錄變異體亞細(xì)胞定位情況。結(jié)果表明，pEGFP-N1空載體轉(zhuǎn)染表達(dá)綠色熒光蛋白在PK15細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)均勻分布，而重組載體pEGFP-N1-FoxN1(a/b/c)表達(dá)的融合蛋白僅在細(xì)胞核內(nèi)均勻分布。結(jié)果可為3種轉(zhuǎn)錄變異體后續(xù)功能研究奠定基礎(chǔ)。

豬；FoxN1基因；轉(zhuǎn)錄變異體；細(xì)胞定位

網(wǎng)絡(luò)出版時間2016-8-24 15:04:00[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20160824.1504.014.html

張冬杰,李苓,汪亮,等.豬FoxN1基因轉(zhuǎn)錄變異體亞細(xì)胞定位研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2016,47(8):55-59.

Zhang Dongjie,Li Ling,Wang Liang,et al.Research on the subcellular localization of pig transcriptional variants ofFoxN1 gene[J].Journal of Northeast Agricultural University,2016,47(8):55-59.(in Chinese with English abstract)

裸鼠（Nude mouse）是醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中重要實驗動物模型，主要表現(xiàn)為無毛及先天性胸腺缺陷。Frank等研究發(fā)現(xiàn)，造成該表型主要原因是一個被稱作FoxN1（Forkhead box protein N1）的基因發(fā)生突變，導(dǎo)致該基因功能喪失[1]。Prowse和Lee等研究表明，F(xiàn)oxN1是叉頭框蛋白家族一員，該基因家族是一類DNA結(jié)合區(qū)具有翼狀螺旋結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，目前已有17個亞族。失去FoxN1蛋白活性的人和小鼠會出現(xiàn)少發(fā)、免疫缺陷（胸腺和T細(xì)胞缺失）及皮膚缺損[2-3]。Corbeaux等研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxN1基因僅在多層上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)組織內(nèi)表達(dá)，如胸腺和皮膚，F(xiàn)oxN1對胸腺內(nèi)T細(xì)胞發(fā)育起決定性作用[4]。皮膚中，F(xiàn)oxN1主要在濾泡上皮細(xì)胞和毛囊內(nèi)表達(dá)[5]。小鼠皮膚基底層細(xì)胞第一層和一些表皮基底細(xì)胞均表達(dá)FxoN1。FoxN1表達(dá)模式與角質(zhì)細(xì)胞形成與分化一致，過表達(dá)或缺失FoxN1功能將導(dǎo)致分化畸形。且FoxN1控制濾泡上皮細(xì)胞和毛囊細(xì)胞增殖與分化平衡。此外，角質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的FoxN1還可促進(jìn)成纖維細(xì)胞生長因子2（Fibroblast growth factor 2，F(xiàn)gf2）分泌，F(xiàn)gf2可激活生黑色素細(xì)胞釋放色素，且可作為一種促細(xì)胞分裂劑促進(jìn)上皮細(xì)胞周圍細(xì)胞增殖。

FoxN1基因有多重轉(zhuǎn)錄變異體，目前已知人有18種轉(zhuǎn)錄變異體（Gene ID：8456），小鼠有5種（Gene ID：15218），牛有5種（Gene ID：516724），雞有3種（Gene ID：417570），石斑魚有2種（Gene ID：266748）。真核生物前體mRNA（pre-mRNA）選擇性剪切是控制基因表達(dá)和產(chǎn)生蛋白質(zhì)多樣性重要機制[6]。每種轉(zhuǎn)錄變異體均會行使相似或不同生物學(xué)功能。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，豬FoxN1基因存在3種轉(zhuǎn)錄剪切變異體[7]。為深入了解這3種不同剪切變異體是否行使不同生物學(xué)功能，本研究擬利用pEGFP-N1真核表達(dá)系統(tǒng)，對FoxN1基因3種轉(zhuǎn)錄剪切變異體亞細(xì)胞定位。為后續(xù)開展生物學(xué)功能研究奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

新生民豬仔豬5頭，購自黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所民豬保種場。斷頸屠宰后，取胸腺組織100 mg，置于無RNA酶1.5 mL EP管內(nèi)，液氮保存帶回實驗室，用于后續(xù)RNA提取。

1.2RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

使用Invitrogen公司生產(chǎn)Trizol試劑，按照李紅然等方法[8]，提取胸腺組織內(nèi)總RNA。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，嚴(yán)格按照羅氏反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit）說明書合成cDNA，反應(yīng)結(jié)束后，cDNA置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3PCR擴增與序列測定

將反轉(zhuǎn)錄合成的5頭民豬胸腺組織cDNA等體積混合，構(gòu)建成1個cDNA池。以cDNA池為模板，參照李苓等設(shè)計引物序列[7]，兩端分別引入HindⅢ和Bam HⅠ酶切位點，引物序列如下：F：5'AAGCTTATGGTGTCACTACTCCCGCCACAGT 3' R:5'GGATCCCAAGCGAGGGCCATGGGCTTGGAG 3'（下劃線為引入酶切位點序列），擴增豬FoxN1基因完整編碼區(qū)。因為存在剪切變異，預(yù)期會獲得3條條帶，長度分別為1 941 bp（a）、1 677 bp（b）和1 944 bp（c）。擴增結(jié)束后，利用天根生化科技有限公司生產(chǎn)膠回收試劑盒分別回收上述3條條帶，連入pGM-T載體，分別構(gòu)建pGM-T-Foxn1（a/b/c）3種連接產(chǎn)物，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，過夜培養(yǎng)后，挑取陽性克隆菌株，LB液體培養(yǎng)基活化后，送吉林庫美公司測序。

1.43種變異體重組質(zhì)粒構(gòu)建

將測序結(jié)果正確的3個重組質(zhì)粒pGM-T-FoxN1 （a/b/c）和pEGFP-N1載體分別用HindⅢ和Bam HⅠ兩種內(nèi)切酶雙酶切。50 μL酶切反應(yīng)體系如下：質(zhì)粒25.0 μL，HindⅢ和Bam HⅠ各4.0 μL，Buf?fer 25.0 μL，H2O 12.0 μL。37℃恒溫培養(yǎng)箱過夜酶切。反應(yīng)結(jié)束后取2 μL酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳，進(jìn)一步確定目的條帶大小是否與預(yù)期位置一致。剩余產(chǎn)物用于膠回收。酶切產(chǎn)物經(jīng)回收純化后得到目的片段和線性pEGFP-N1載體。按如下體系連接：pEGFP-N1 1.0 μL，目的片段4.0 μL，10×Li?gase Buffer 1.0 μL，T4DNA Ligase 0.8 μL，H2O 3.2 μL。上述反應(yīng)混合液16℃過夜連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，過夜培養(yǎng)后，挑取陽性克隆菌株，LB液體培養(yǎng)基活化后，送吉林庫美公司測序。選取測序結(jié)果正確質(zhì)粒，重新轉(zhuǎn)化與單克隆培養(yǎng)，LB液體培養(yǎng)基活化后，按照天根生化科技有限公司生產(chǎn)高純度質(zhì)粒小提中量試劑盒（TIANpure Midi Plasmid Kit）說明書提取高純度質(zhì)粒。

1.5PK15細(xì)胞培養(yǎng)

從液氮中取出凍存PK15細(xì)胞凍存管立即投入37℃水浴，快速晃動直至管中液體完全溶解。將細(xì)胞凍存液吹勻后轉(zhuǎn)移至離心管中，1 mL DMEM吹洗凍存管1～2次后將液體轉(zhuǎn)移至離心管中。1 000 r·min-1離心5 min。棄上清，以4 mL體系補全培養(yǎng)基后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；24 h后用新鮮完全培養(yǎng)基給細(xì)胞換液，繼續(xù)培養(yǎng)。經(jīng)2～3次細(xì)胞傳代，待細(xì)胞生長旺盛，適應(yīng)培養(yǎng)環(huán)境時，轉(zhuǎn)染。

1.6融合載體瞬時轉(zhuǎn)染與檢測

參照Invitrogen公司Lipofectamine 2000TM轉(zhuǎn)染說明試驗，確定適合PK15細(xì)胞轉(zhuǎn)染最佳質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑比例。具體步驟如下：轉(zhuǎn)染前一天用胰蛋白酶消化細(xì)胞，將細(xì)胞接種于24孔板內(nèi)，接種細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)量以第二天融合度能達(dá)到80%～90%為宜。將待轉(zhuǎn)染質(zhì)粒（μg）與轉(zhuǎn)染試劑（μL）比例定為1 ? 1～1 ? 3，各組待轉(zhuǎn)染質(zhì)粒濃度不變，轉(zhuǎn)染試劑依次遞增0.2 μL。取0.8 μg pEGFP-N1空質(zhì)粒稀釋于無血清DMEM培養(yǎng)液內(nèi)，終體積為50 μL，溫和混勻，室溫孵育5 min。取相應(yīng)體積轉(zhuǎn)染試劑分別稀釋于無血清DMEM培養(yǎng)液內(nèi)，終體積為50 μL，溫和混勻，脂質(zhì)體孵育時間<5 min。將稀釋質(zhì)粒溶液與對應(yīng)轉(zhuǎn)染試劑溶液溫和混勻，總體積為100 μL，室溫孵育20 min。棄去24孔板內(nèi)原細(xì)胞培養(yǎng)液，DMEM清洗各孔細(xì)胞2次，向每孔內(nèi)添加400 μL無血清DMEM培養(yǎng)液。20 min孵育結(jié)束后，將100 μL混合液加入各孔內(nèi)，混勻。將轉(zhuǎn)染細(xì)胞置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4～6 h后換液，更換為含20%血清DMEM培養(yǎng)液，24 h后熒光倒置顯微鏡下檢測各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。

篩選確定PK15細(xì)胞轉(zhuǎn)染最佳質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑比例后，瞬時轉(zhuǎn)染。按照Lipofectamine 2000TM轉(zhuǎn)染說明操作。轉(zhuǎn)染24 h后，PBS清洗細(xì)胞3次，加ADPI（1 ? 50，PBS稀釋，避光操作），孵育30 min；PBS洗3遍，每孔加入1 mL PBS（防止細(xì)胞死亡）；熒光倒置顯微鏡下選取形態(tài)良好細(xì)胞，觀察記錄pEGFP-N1空質(zhì)粒與pEGFP-FoxN1融合蛋白綠色熒光并觀察與記錄。

2　結(jié)果與分析

2.1pGM-T-FoxN1(a/b/c)質(zhì)粒和pEGFP-N1質(zhì)粒雙酶切結(jié)果

pGM-T-FoxN1（a/b/c）質(zhì)粒和pEGFP-N1質(zhì)粒同時Bam HⅠ和HindⅢ雙酶切，并檢測酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳。經(jīng)紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察，pGM-T-FoxN1（a/b/c）重組質(zhì)粒和pEGFP-N1質(zhì)粒雙酶切后分別得到1 941、1 677、1 944 bp兩端帶有酶切位點的FoxN1基因片段和pEGFP-N1空載體片段，如圖1所示。

圖1　pEGFP-N1質(zhì)粒和pGM-T-FoxN1(a/b/c)質(zhì)粒雙酶切結(jié)果Fig.1　Double enzymes results of pEGFP-N1 plasmid and pGM-T-FoxN1(a/b/c)plasmid

2.2構(gòu)建pEGFP-N1-FoxN1(a/b/c)重組質(zhì)粒

連接轉(zhuǎn)化純化回收FoxN1(a/b/c)基因片段與pEGFP-N1質(zhì)粒片段，構(gòu)建pEGFP-N1-FoxN1(a/ b/c)重組質(zhì)粒，以LB固體培養(yǎng)基生長陽性克隆菌落為模板PCR，瓊脂糖凝膠電泳檢測，分別在1 941、1 677和1 944 bp位置獲得單一DNA條帶，結(jié)果見圖2。證明pEGFP-N1-FoxN1（a/b/c）重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖2　pEGFP-N1-FoxN1（a/b/c）重組質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果Fig.2　PCR identification results of pEGFP-N1-FoxN1（a/b/c）recombinant plasmid

圖3　瞬時轉(zhuǎn)染24 h后pEGFP-N1-FoxN1(a/b/c)亞細(xì)胞定位結(jié)果(40×)Fig.3　Subcellular location results of pEGFP-N1-FoxN1(a/b/c)through transient transfection for 24 h(40×)

2.3瞬時轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-N1-FoxN1(a/b/c)亞細(xì)胞定位結(jié)果

瞬時轉(zhuǎn)染pEGFP-N1空質(zhì)粒和pEGFP-N1-FoxN1 (a/b/c)重組質(zhì)粒24 h后，顯微鏡下觀察到pEGFPN1空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞發(fā)出綠色熒光信號定位于整個細(xì)胞中（主要包括細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)）。融合蛋白pEGFPN1-FoxN1(a/b/c)產(chǎn)生的綠色熒光信號全部定位于細(xì)胞核，細(xì)胞質(zhì)無綠色熒光信號，且在細(xì)胞核內(nèi)，綠色熒光呈斑點樣分布，不同變異體間無差異。說明FoxN1蛋白是一種核表達(dá)蛋白（見圖3）。

3　討論與結(jié)論

FoxN1是一個保守的轉(zhuǎn)錄因子，在皮膚中調(diào)節(jié)角蛋白表達(dá)。FoxN1一旦缺失或發(fā)生突變，會導(dǎo)致毛干由于角質(zhì)化缺陷而在毛囊中卷曲，無法穿透表皮形成正常毛發(fā)。同時，依賴于角蛋白的皮膚和指甲也會出現(xiàn)明顯發(fā)育缺陷。胸腺中主要功能分為胚胎期和出生后兩個階段，胚胎期主要調(diào)控胸腺上皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)胸腺上皮前體細(xì)胞向皮質(zhì)和髓質(zhì)上皮細(xì)胞分化；出生后主要維持胸腺生理功能[8]。目前，關(guān)于FoxN1基因功能的研究還在繼續(xù)深入[9-10]，但對其不同轉(zhuǎn)錄變異體研究鮮有報道。從NCBI數(shù)據(jù)庫中已提交數(shù)據(jù)獲悉，很多物種FoxN1基因存在多種轉(zhuǎn)錄變異體。

轉(zhuǎn)錄變異體在mRNA前體經(jīng)5'戴帽、剪接和3'加尾等修飾為成熟mRNA過程中產(chǎn)生，可由一個基因產(chǎn)生若干具有獨特結(jié)構(gòu)和功能的蛋白異構(gòu)體，極大提高一因多效功能。研究表明，約94%人類基因會發(fā)生選擇性剪切，形成大量不同轉(zhuǎn)錄變異體，出現(xiàn)不同甚至是完全相反功能。雖然各種生物基因組存在大量轉(zhuǎn)錄變異體，但研究集中在醫(yī)學(xué)腫瘤疾病方面。已知不同轉(zhuǎn)錄變異體對腫瘤形成、治療及預(yù)后關(guān)系存在不同效應(yīng)[11-13]。

目前針對FoxN1基因不同轉(zhuǎn)錄變異體是否具有不同生物學(xué)功能尚未見報道，但FoxN1基因是一個具有明顯組織表達(dá)特異性的基因，目前已知僅在胸腺、皮膚和舌中表達(dá)，且對其生長、發(fā)育起重要調(diào)控作用。表達(dá)有限性、功能重要性及結(jié)構(gòu)復(fù)雜性，說明對該基因還需開展更深入研究。本研究僅從亞細(xì)胞定位角度分析豬FoxN1基因3種轉(zhuǎn)錄變異體，發(fā)現(xiàn)3種轉(zhuǎn)錄變異體均位于細(xì)胞核中，尚無法區(qū)分三者間是否存在功能差異。今后需從轉(zhuǎn)錄水平及功能分析等角度開展深入研究。

[1]Frank J,Pignata C,Panteleyev AA,et al.Exposing the human nude phenotype[J].Nature,1999,398(6727):473-474.

[2]Prowse D M,Lee D,Weiner L,et al.Ectopic expression of the nude gene induces hyperproliferation and defects in differentia?tion:implications for the self-renewal of cutaneous epithelia[J]. Dev Biol,1999,212(1):54-67.

[3]Lee D,Prowse D M,Brissette J L.Association between mouse nude gene expression and the initiation of epithelial terminal dif?ferentiation[J].Dev Biol,1999,208(2):503-515.

[4]Corbeaux T,Hess I,Swann J B,et al.Thymopoiesis in mice de?pends on a Foxn1-positive thymic epithelial cell lineage[J].Proc Natl Acad Sci USA,2010,107(38):16613-16618.

[5]Weiner L,Han R,Scicchitano B M,et al.Dedicated epithelial re?cipient cells determine pigmentation patterns[J].Cell,2007,130 (5):932-942.

[6]黨萬太,周京國,謝文光.基因轉(zhuǎn)錄剪接體:潛在的病變位點[J].中華臨床醫(yī)師雜志:電子版,2013,7(23):10846-10849.

[7]李苓,張冬杰,汪亮,等.民豬FoxN1基因的克隆及生物信息學(xué)分析[J].中國畜牧獸醫(yī),2016,43(4):928-933.

[8]李紅然,張連軍,趙勇.Foxn1在胸腺上皮細(xì)胞發(fā)育分化中的關(guān)鍵調(diào)控作用[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2010,26(11):1161-1163.

[9]O'Neill K E,Bredenkamp N,Tischner C,et al.Foxn1 is dynami?cally regulated in thymic epithelial cells during embryogenesis and at the onset of thymic involution[J].PLoS One,2016,11(3): e0151666.

[10]Gao Y,Wang X,Yan H,et al.Comparative Transcriptome anal?ysis of fetal skin reveals key genes related to hair follicle morpho?genesis in cashmere goats[J].PLoS One,2016,11(3):e0151118.

[11]左波,李玫,劉玉蘭,等.G蛋白偶聯(lián)受體34轉(zhuǎn)錄變異體在結(jié)腸癌中的表達(dá)及其潛在意義[J].中華臨床醫(yī)師雜志:電子版,2013, 7(8):3377-3383.

[12]周永柏,張亞歷,王繼德,等.XAF1轉(zhuǎn)錄變異體在胃腸道腫瘤細(xì)胞株中的表達(dá)及意義[J].胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志,2015,24 (11):1380-1383.

[13]孟化,戴德堅,陸才德.Survivin轉(zhuǎn)錄變異體在胃癌組織中的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系[J].中華胃腸外科雜志,2005,8(3):234-236.

Research on the subcellular localization of pig transcriptional variantsofFoxN1 gen e

/ZHANG Dongjie1,LI Ling2,WANG Liang1,LIU Di1,2(1.Institute of Animal Husbandry,Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150086,China;2.School of Animal Science and Technology,NortheastAgricultural University,Harbin 150030,China)

FoxN1 gene was mainly expressed in thymic epithelial cell and skin keratinocytes.It played important roles in thymus development,T cell proliferation,hair growth and nail development.There were many transcriptional variants in theFoxN1 gene.It had been found 18 transcriptional variants in human FoxN1 gene.The presence of transcriptional variants made it possible of gene differential expression and protein diversity.In previous study,three transcriptional variants of pigFoxN1 gene were found.In order to deep research on the functional of every transcriptional variant,three transcriptional variants of pigFoxN1 gene were connected with pEGFP-N1 vector.Fusion protein of everyone was constructed and transfected in PK15 cell.The results showed that,only EGFP expression could be detected in PK15 cell nucleus and cytoplasm.Three fusion proteins only could be detected in cell nucleus.This result could prove the basic knowledge for further research on pigFoxN1 gene.

pig;FoxN1 gene;transcript variant;cellular localization

S828；Q343.1+7

A

1005-9369（2016）08-0055-05

2016-05-27

國家自然科學(xué)基金項目（31301955）；國家生豬產(chǎn)業(yè)體系崗位科學(xué)家項目（CARS-36）；黑龍江省自然科學(xué)基金項目（C201312）

張冬杰（1980-），女，副研究員，博士，研究方向為豬分子遺傳育種。E-mail:djzhang8109@163.com

劉娣，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向為豬遺傳育種。E-mail:nkyliudi2016@163.com