變異鏈球菌自誘導(dǎo)物2信號(hào)分子的體外合成與活性檢測(cè)

張鷹　李明勇　霍麗　孟媛

解放軍第451醫(yī)院口腔科　西安 710054

變異鏈球菌自誘導(dǎo)物2信號(hào)分子的體外合成與活性檢測(cè)

張鷹李明勇霍麗孟媛

解放軍第451醫(yī)院口腔科西安 710054

目的利用分子生物學(xué)的相關(guān)技術(shù)體外合成具有良好生物學(xué)活性的自誘導(dǎo)物2（AI-2）信號(hào)分子，為進(jìn)一步研究S-核糖高半胱氨酸裂解酶（LuxS）/AI-2信號(hào)系統(tǒng)對(duì)于變異鏈球菌和口腔生物膜的致病性、耐藥性的調(diào)節(jié)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。方法構(gòu)建穩(wěn)定高效的LuxS和S-腺苷高半胱氨酸核苷酶（Pfs）原核表達(dá)載體，異丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，并進(jìn)行鎳柱層析分離純化與鑒定。利用純化表達(dá)的LuxS蛋白和Pfs蛋白體外合成AI-2信號(hào)分子，以哈維氏弧菌菌株BB170作為報(bào)告菌株，通過(guò)生物發(fā)光效應(yīng)檢測(cè)體外合成的變異鏈球菌AI-2信號(hào)分子的生物活性，并以此間接檢測(cè)LuxS蛋白和Pfs蛋白的生物學(xué)活性。結(jié)果體外合成的AI-2可誘導(dǎo)哈維氏弧菌菌株BB170強(qiáng)烈發(fā)光。以變異鏈球菌UA159標(biāo)準(zhǔn)株菌液中自然生成的AI-2為對(duì)照，體外合成AI-2誘導(dǎo)發(fā)光效果強(qiáng)于菌液。結(jié)論體外合成的AI-2具有良好的生物學(xué)活性，獲得了高效表達(dá)、可溶性的LuxS和Pfs重組蛋白。

變異鏈球菌；密度感應(yīng)系統(tǒng)；自誘導(dǎo)物2；S-核糖高半胱氨酸裂解酶蛋白

［Abstract］ObjectiveThis study aimed to produce bioactive autoinducer-2（AI-2） in vitro via molecular biological techniques，as well as provide a basis for further study on the cariogenic virulence regulation mechanism of AI-2 in Streptococcus mutans. MethodsEffective prokaryotic recombinant systems for the expression and purification of S-ribosylhomocysteinase（LuxS） and S-adenosylhomocysteine nucleosidase（Pfs） proteins were constructed. After induction by isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，expressing products were purified with the Ni-NTA spin column. AI-2，which is an informational molecule in quorum sensing，was produced in vitro using purified LuxS and Pfs. The bioactivity of AI-2 was tested by Vibrio harveyi BB170 luminescence bioassay，which indirectly proved the bioactivities of purified LuxS and Pfs. ResultsAI-2 produced in vitro could significantly induce the luminescence of Vibrio harveyi. Furthermore，its luminous intensity was much higher than that induced by the AI-2 produced naturally by a bacterial colony of Streptococcus mutans UA159. ConclusionAn efficient expression system for soluble recombinant proteins of LuxS and Pfs was established. The highly active AI-2 was manufactured，which could provide essential materials for further research.

［Key words］Streptococcus mutans；quorum sensing；autoinducer-2；S-ribosylhomocysteinase

群體感應(yīng)（quorum sensing，QS）是使用可溶性小分子在細(xì)胞間進(jìn)行信號(hào)傳遞，根據(jù)種群密度調(diào)節(jié)細(xì)胞生理行為的過(guò)程。自誘導(dǎo)物2（autoinducer-2，AI-2）介導(dǎo)的QS是唯一被革蘭氏陽(yáng)性和陰性菌共用的QS系統(tǒng)，AI-2合成酶S-核糖高半胱氨酸裂解酶（S-ribosylhomocysteinase，LuxS）廣泛分布于多種細(xì)菌，是一種跨種群交流的通用語(yǔ)。此外，LuxS還是細(xì)菌活化甲基循環(huán)的組成部分［1-4］。

LuxS/AI-2信號(hào)系統(tǒng)一直是QS研究的熱點(diǎn)，luxS基因的同源序列存在于大部分口腔致病菌的基因中，變異鏈球菌是人類齲齒的主要致病菌，AI-2信號(hào)分子對(duì)其致齲性和毒力具有十分關(guān)鍵的調(diào)控功能。本研究構(gòu)建組氨酸標(biāo)簽（His）-LuxS 和His-S-腺苷高半胱氨酸核苷酶（S-adenosylhomocysteine nucleosidase，Pfs）融合蛋白的原核表達(dá)載體，得到高濃度高純度的活性LuxS和Pfs，人工體外合成AI-2，并利用哈維氏弧菌的生物發(fā)光效應(yīng)檢測(cè)AI-2活性。為明確AI-2分子特性，區(qū)分LuxS/AI-2系統(tǒng)代謝效應(yīng)和QS效應(yīng)，找出AI-2的變異鏈球菌受體，進(jìn)一步研究AI-2介導(dǎo)的QS機(jī)制提供必要條件。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1菌株與質(zhì)粒變異鏈球菌菌株UA159（四川大學(xué)口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)），質(zhì)粒pET-28a （Novagen公司，德國(guó)），大腸桿菌菌株BL21（DE3）（解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所），哈維氏弧菌菌株BB170（解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所）

1.1.2材料與試劑Taq DNA聚合酶（北京天為時(shí)代科技有限公司），限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、XhoⅠ（Promega生物技術(shù)有限公司，美國(guó)），T4 DNA連接酶（紐英倫生物技術(shù)公司，美國(guó)），樹(shù)脂型TM基因組DNA提取試劑盒、基因組DNA純化試劑盒、Cycle-Purekit純化回收試劑盒（北京賽百盛基因技術(shù)有限公司），Gen Extract質(zhì)粒小量提取試劑盒（北京道普生物科技有限公司），IPTG（Sigma公司，美國(guó)），蛋白純化鎳柱樹(shù)脂（Qiagen公司，德國(guó)），離心柱聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）產(chǎn)物純化試劑盒（Promega生物技術(shù)有限公司，美國(guó)）、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、DNA純化回收試劑盒，S-腺苷高半胱氨酸（S-adenosylhomocysteine，SAH）（北京賽馳生物科技有限公司），TPY液體培養(yǎng)基，LB培養(yǎng)基。

1.2方法

1.2.1重組質(zhì)粒pET-28a-luxS與pET-28a-pfs的構(gòu)建與鑒定根據(jù)GENBANK提供變異鏈球菌基因組工程測(cè)序結(jié)果中l(wèi)uxS和pfs序列，在Dnaman引物設(shè)計(jì)軟件的輔助下設(shè)計(jì)引物：擴(kuò)增luxS基因所用上游引物為luxS1（5'-CCG GAATTC ATGACAAAAGAAGTT-3'），下游引物為luxS2（5'-CCGCTCGAGT TTACACTAGATGACG-3'），擴(kuò)增pfs基因所用上游引物為pfs1（5'-CCG GAATTC ATGAAAATTGGAA-3'），下游引物為pfs2（5'-CCGCTCGAGT TCATTGGTCTAAGAT-3'）。

在兩者上游引物中引入EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，在下游引物中引入XhoⅠ酶切位點(diǎn)及其相應(yīng)的保護(hù)堿基［5-8］。

以變異鏈球菌菌株UA159菌體為模板，擴(kuò)增目的基因，PCR產(chǎn)物測(cè)序，EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切上述剩余的純化產(chǎn)物，連接到同樣酶切處理的pET-28a載體上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中，提取質(zhì)粒，PCR酶切鑒定，測(cè)序鑒定陽(yáng)性克隆。

1.2.2LuxS和Pfs蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)純化與定量重組質(zhì)粒pET-28a-luxS與pET-28a-pfs轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌菌株BL21（DE3），接種于5 mL LB培養(yǎng)基，37 ℃搖床200 r·min-1培養(yǎng)8 h，取450 mL LB培養(yǎng)基，加入卡那霉素2 mL（50 μL卡那霉素/ 100 mL LB），添加搖好的菌液，37 ℃劇烈振蕩2～3 h，使光密度（optical density，OD）值達(dá)到0.4～0.5，再加入1 mol·L-1IPTG 45 μL，使其濃度大約為0.1 mmol·L-1，37 ℃搖3 h后離心收集。收集所得蛋白加4.5 mL鎳柱結(jié)合緩沖液重懸，按45～60 kU·g-1菌體加溶菌酶，30 ℃中水浴15 min，冰浴中超聲裂解菌體，12 000 r·min-1離心4 min，吸取上清經(jīng)小濾器濾掉雜志，加入鎳柱使His-LuxS于鎳柱充分結(jié)合，洗去雜蛋白后洗脫目的蛋白，加入超濾管（截流量5 000），6 000 r·min-14 ℃離心30 min，棄去外液后再加磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）重復(fù)超濾3次，濾去鹽離子、小分子蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。

吸取少量上清進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polya-crylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）。

蛋白樣本取2 μL與蒸餾水按1：50、1：100和1：200體積比稀釋，各取40 μL加入96孔板；蛋白定量用10、25、50、100、200 μg 分子量標(biāo)準(zhǔn)和蒸餾水分別取40 μL，加入96孔板，Lowry法根據(jù)OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3檢測(cè)體外合成的AI-2誘導(dǎo)生物發(fā)光效應(yīng)制備變異鏈球菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期無(wú)細(xì)胞上清液作為陽(yáng)性對(duì)照組：變異鏈球菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期無(wú)細(xì)胞上清液按照1、10、50、100、500倍稀釋，所得稀釋液各取20 μL+1：5 000稀釋哈維氏弧菌菌株BB170的菌液180 μL。陰性對(duì)照組為PBS液200 μL；實(shí)驗(yàn)組：體外合成的AI-2按照1、10、50、100、500倍稀釋，所得稀釋液各取20 μL+1：5 000稀釋BB 170菌液 180 μL。

將各組樣本加入96孔板，30 ℃搖床175 r·min-1孵育1 h，閃爍記數(shù)器檢測(cè)發(fā)光量的每分鐘閃爍次數(shù)（count per minute，CPM）。

2　結(jié)果

2.1luxS和pfs的克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建

針對(duì)變異鏈球菌luxS、pfs基因構(gòu)建原核表達(dá)載體，經(jīng)PCR鑒定，重組載體均有與預(yù)期目的基因大小相同的插入片段（圖1、2），測(cè)序結(jié)果證實(shí)插入片段均為正確全長(zhǎng)基因。

圖1　pET-28a-luxS表達(dá)載體菌落的PCR電泳圖Fig1　Electrophoretogram of pET-28a-luxS positive clones' PCR identification

圖2　pET-28a-pfs表達(dá)載體菌落的PCR電泳圖Fig2　Electrophoretogram of pET-28a-pfs positive clones' PCR identification

2.2變異鏈球菌His-LuxS與His-Pfs的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

SDS-PAGE分析顯示：經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，對(duì)表達(dá)的上清蛋白經(jīng)鎳柱組氨酸標(biāo)簽捕捉（HisTrap）方法純化。

根據(jù)圖3、4可知，在預(yù)期位置上，重組質(zhì)粒pET-28a-pfs、pET-28a-luxS形成了和設(shè)想具有同樣分子量的蛋白表達(dá)條帶，意味著在大腸桿菌BL21中，目的片段的表達(dá)是理想的。在可溶性方面，研究重組蛋白可發(fā)現(xiàn)，兩種重組蛋白均傾向于上清表達(dá)，具有良好的可溶性。且與Ni-NTA柱結(jié)合良好，經(jīng)過(guò)鎳柱后的穿透液中未見(jiàn)明顯的目的蛋白條帶，純化效率較高。

圖3　Ni-NTA純化His-LuxS蛋白Fig3　Purification of His-LuxS using Ni-NTA

圖4　Ni-NTA純化His-LuxS蛋白Fig4　Purification of His-LuxS using Ni-NTA

2.3His-LuxS和His-Pfs的蛋白定量

Lowry法檢測(cè)LuxS和Pfs蛋白濃度：以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將LuxS和Pfs蛋白樣本做1：50、1：100、1：200梯度稀釋，由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得蛋白濃度（圖5）。按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得LuxS蛋白含量約為60 g·L-1，Pfs蛋白含量約為3 g·L-1。

圖5　Lowrry法蛋白定量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig5　Standard curve for detecting target protein concentration

2.4AI-2的體外合成及活性檢測(cè)

當(dāng)純化的重組蛋白LuxS和Pfs與SAH同時(shí)作用后，其反應(yīng)液經(jīng)過(guò)濾，按照1、10、50、100、500倍稀釋的體外合成AI-2和變異鏈球菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期無(wú)細(xì)胞上清液都能激發(fā)哈維氏弧菌菌株BB170產(chǎn)生發(fā)光反應(yīng)，其中AI-2溶液激發(fā)的發(fā)光反應(yīng)更強(qiáng)烈：以無(wú)細(xì)胞的磷酸鈉緩沖液發(fā)光值為空白基數(shù)，體外合成的AI-2誘發(fā)的熒光度約為基數(shù)的8 200倍，而變形鏈球菌上清中的AI-2誘發(fā)的熒光度約為基數(shù)的780倍（圖6）。

圖6　體外合成AI-2生物活性Fig6　Bioactivity of in vitro synthesized AI-2

3　討論

自然界中細(xì)菌很少以獨(dú)立的形式存在，多種細(xì)菌常常聚集在一起以菌落或生物膜的形式生存，且細(xì)菌間的交流以某一通用信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路為媒介。借助生成擁有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的牙菌斑生物膜，口腔中的各種共生菌得以擁有一個(gè)適宜的外界環(huán)境，以供生存所需。現(xiàn)今，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)luxS基因同源序列普遍存在于多種口腔致病細(xì)菌，如戈登氏鏈球菌、牙齦卟啉菌、變異鏈球菌等中，在利用QS體系控制某些生理活動(dòng)的同時(shí)，在牙菌斑內(nèi)細(xì)菌間，LuxS/AI-2信號(hào)分子也扮演著信息傳遞者的角色［9］。LuxS/AI-2同時(shí)具有代謝及密度感應(yīng)功能，其中任一方面出現(xiàn)問(wèn)題，均能造成生理功能或致病性方面的改變［10］。

目前尚不明確大部分細(xì)菌中AI-2的體內(nèi)調(diào)節(jié)和與相鄰細(xì)菌間的交流規(guī)律，只有少數(shù)幾種病菌如沙門氏菌、大腸桿菌、弧菌已有較深入的研究。牙周病、齲病的發(fā)生和口腔牙菌斑息息相關(guān)，深入研究AI-2信號(hào)通路對(duì)于探究QS系統(tǒng)與致齲性基因的關(guān)系大有裨益，可為研發(fā)針對(duì)QS系統(tǒng)的相關(guān)拮抗、治療藥物提供指導(dǎo)，進(jìn)而對(duì)牙菌斑的生成加以抑制，達(dá)到預(yù)防、治療齲病及牙周病的目的。

現(xiàn)階段，國(guó)內(nèi)外針對(duì)LuxS/AI-2的研究主要是通過(guò)luxS基因敲除技術(shù)觀察細(xì)菌突變株在侵襲性、毒力等方面的變化，但LuxS不僅參與群體感應(yīng)，還在細(xì)胞中心代謝扮演重要角色，細(xì)菌毒力的變化究竟是由哪種效應(yīng)決定的尚不明了，對(duì)于AI-2和LuxS蛋白酶自身的作用及AI-2合成過(guò)程中受哪些因素的調(diào)控也鮮有提及。

此外，LuxS蛋白酶作為合成AI-2的關(guān)鍵性蛋白酶，同時(shí)也是激活甲基循環(huán)的重要組成部分，其催化機(jī)制和調(diào)控因子皆不清楚［11］。本次研究結(jié)果顯示，體外合成的AI-2與變異鏈球菌菌液中AI-2均可誘導(dǎo)哈維氏弧菌菌株BB170發(fā)光，且體外合成AI-2誘導(dǎo)效果強(qiáng)于菌液。證明了體外合成的AI-2具有良好的生物學(xué)活性，可以進(jìn)一步開(kāi)展后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究AI-2對(duì)變異鏈球菌侵襲性和轉(zhuǎn)錄水平的影響。

同時(shí)體外合成的AI-2成功誘導(dǎo)生物發(fā)光也間接證明了，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的表達(dá)載體可以大量表達(dá)生物學(xué)活性良好的LuxS和Pfs蛋白，有助于進(jìn)一步對(duì)其功能、結(jié)構(gòu)晶體進(jìn)行分析。為研究這兩種QS系統(tǒng)關(guān)鍵酶的調(diào)控機(jī)制打下了基礎(chǔ)，使在維持LuxS活化甲基基團(tuán)代謝作用的前提下單獨(dú)研究AI-2分子的調(diào)控作用成為可能，對(duì)進(jìn)一步明確QS系統(tǒng)在變鏈菌中的作用機(jī)制和降低口腔生物膜的致病性、耐藥性有著重要意義。

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（本文編輯張玉楠）

Biosynthesis of autoinducer-2 and determination of its bioactivity in vitro

Zhang Ying，Li Mingyong，Huo Li，Meng Yuan.（Dept. of Stomatology，The 451st Hospital of People's Liberation Army，Xi'an 710054，China）

R 37

A

10.7518/gjkq.2016.05.007

2015-11-12；［修回日期］2016-06-16

張鷹，主治醫(yī)師，博士，Email：naotaka@sohu.com

李明勇，副主任醫(yī)師，博士，Email：yfy1114@163.com