葛根素聚合物膠束的制備及包封率的測定Δ

馬曉星，韓翠艷，劉　暢，朱　丹，隋小宇，袁　橙，黃海濤

（1.齊齊哈爾醫(yī)學院藥學院，黑龍江齊齊哈爾161006；2.齊齊哈爾中醫(yī)院藥劑科，黑龍江齊齊哈爾　161006）

葛根素聚合物膠束的制備及包封率的測定Δ

馬曉星1＊，韓翠艷1，劉暢1，朱丹2，隋小宇1，袁橙1，黃海濤1

（1.齊齊哈爾醫(yī)學院藥學院，黑龍江齊齊哈爾161006；2.齊齊哈爾中醫(yī)院藥劑科，黑龍江齊齊哈爾161006）

目的：制備葛根素聚合物膠束并建立其包封率測定方法。方法：采用薄膜分散法制備葛根素聚合物膠束；以離心-微孔濾膜法分離膠束和游離藥物，采用高效液相色譜法測定聚合物膠束包封率，色譜柱為Diamonsil C18（2），流動相為1%檸檬酸溶液-甲醇（65∶35），流速為1 ml/min，檢測波長為250 nm，柱溫為室溫。結(jié)果：制備的聚合物膠束形態(tài)為規(guī)則的球形或類球形，平均粒徑為54.12 nm，多分散系數(shù)為0.122，Zeta電位為-13.60 mV；葛根素檢測質(zhì)量濃度線性范圍為2～10 μg/ml（R2=0.999 4），方法回收率平均值為99.2%（RSD=0.9%，n=3），游離藥物回收率為95.3%（RSD=1.7%，n=3）；葛根素膠束平均包封率為（35.5± 2.12）%、載藥量為（0.3±0.07）%（n=3）。結(jié)論：薄膜分散法適用于制備葛根素聚合物膠束；所建立的葛根素含量及其包封率測定方法操作簡單、準確、可靠。

葛根素聚合物膠束；薄膜分散法；高效液相色譜法；離心-微孔濾膜法；包封率

葛根素是中藥葛根的主要有效成分，現(xiàn)代研究證明葛根素具有抗交感神經(jīng)作用、鈣拮抗作用和β-受體阻滯作用，可顯著擴張冠狀動脈和腦血管以及降血糖、抗氧化、保護腦神經(jīng)、治療骨質(zhì)疏松等，臨床上主要用于心腦血管疾病的治療，其藥源豐富、價廉、毒性小、安全范圍廣、療效好，發(fā)展前景廣闊［1-3］。由于葛根素水溶性較差，且其口服生物利用度相對較低，目前多以注射劑給藥；但葛根素注射劑自上市以來，相關不良反應報道日漸增多［4-5］，在臨床應用中已發(fā)生多例急性血管內(nèi)溶血不良現(xiàn)象，嚴重時甚至會導致死亡，故其目前在臨床上的使用受限［6-7］。聚合物膠束作為一種給藥載體，是由親水性和疏水性嵌段組成的兩親性共聚物制備形成的，屬于熱力學穩(wěn)定體系；其作為遞送難溶性藥物的載體，可克服口服給藥時的某些限制性因素，提高藥物的生物利用度［8］。目前，已有多種難溶性藥物如多柔比星、紫杉醇、喜樹堿及順鉑等通過包封進入膠束的疏水內(nèi)核而增溶、提高生物利用度的實例報道［9］。筆者采用薄膜分散法制備葛根素單甲氧基聚乙二醇-聚己內(nèi)酯（MPEG-PCL）聚合物膠束（以下簡稱葛根素聚合物膠束），同時建立高效液相色譜（HPLC）法測定葛根素含量，并計算其包封率，為葛根素口服制劑的開發(fā)奠定基礎。

1　材料

1.1儀器

LC-1000型液相色譜儀（山東魯南瑞紅化工儀器有限公司）；Nano-ZS90型納米粒徑儀（上海長方光學儀器有限公司）；磁力攪拌機（北京金紫光科技發(fā)展有限公司）；冷凍干燥機（寧波市靳州雙嘉儀器有限公司）；SB-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）；電子天平（丹納西赫特傳感工業(yè)控制有限公司，十萬分之一）；HT7700型透射電鏡（日本日立公司）。

1.2藥品與試劑

葛根素（原料藥與對照品，上海金穗生物科技有限公司，批號：20140723，純度：≥98%）；MPEG-PCL（濟南岱昰生物工程有限公司，分子質(zhì)量：均為5 000，二者組成比：1∶1）；甲醇為色譜純，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1葛根素聚合物膠束的制備

精密稱取50 mg MPEG-PCL，置于茄形瓶中，以20 ml乙腈溶解，得透明的共聚物乙腈溶液；精密稱取葛根素2.52 mg，置于50 ml量瓶中，加入一定量的甲醇，超聲10 min（功率：200 W，頻率：40 kHz），將葛根素完全溶解，然后用甲醇定容至刻度，混合均勻，得葛根素甲醇溶液；精密量取10 ml葛根素甲醇溶液加入盛有共聚物的乙腈溶液中，轉(zhuǎn)移到茄形瓶中；60℃水浴減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮去乙腈，在茄形瓶中可看到一層均勻的透明藥物與共聚物的混合物薄膜；加入25 ml預熱至60℃的超純水，劇烈渦旋振蕩30 s，使混合物薄膜完全水化；水化液50℃水浴磁力攪拌2 h，形成葛根素膠束溶液；冷卻至室溫，使用0.45 μm微孔濾膜過濾，收集含藥的聚合物膠束濾液冷凍干燥保存。另在上述聚合物乙腈溶液中不加葛根素甲醇溶液，同法操作即制得空白膠束。

2.2葛根素聚合物膠束形態(tài)、粒徑及Zeta電位的測定

精密稱取一定量葛根素膠束的凍干產(chǎn)品，用純化水復溶，采用透射電鏡觀察膠束的形態(tài)，采用納米粒徑儀測定膠束的粒徑和Zeta電位。結(jié)果，葛根素膠束形態(tài)為規(guī)則的球形或類球形，如圖1所示；膠束平均粒徑為54.12 nm，膠束多分散系數(shù)（PDI）值為0.122，Zeta電位為-13.60 mV，如圖2所示。

圖1　葛根素聚合物膠束透射電鏡圖

圖2　葛根素聚合物膠束粒徑和Zeta電位分布圖Fig 2　Particle size and Zeta potential of Puerarin polymeric micelles

2.3葛根素含量測定方法學考察

2.3.1檢測波長的選擇精密稱取2.54 mg葛根素，置于50 ml量瓶中，加入一定量的1%檸檬酸溶液-甲醇（65∶35）溶液，超聲10 min，使葛根素完全溶解，定容。精密量取上述葛根素溶液10 ml，置于50 ml量瓶中，用1%檸檬酸溶液-甲醇（65∶35）溶液定容，在200～400 nm波長內(nèi)進行紫外掃描。結(jié)果，溶液在250 nm波長處有比較明顯的紫外吸收，表明葛根素最大吸收波長為250 nm，詳見圖3。

圖3　紫外掃描圖譜Fig 3　UV scanning spectrum

2.3.2色譜條件色譜柱：Diamonsil C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：1%檸檬酸溶液-甲醇（65∶35），流速：1 ml/min；柱溫：室溫；紫外檢測器，檢測波長：250 nm；進樣量：20 μl。

2.3.3溶液的制備精密稱取2.54 mg葛根素，置于50 ml量瓶中，加入一定量的流動相超聲10 min使葛根素完全溶解，定容，制得10.16 μg/ml葛根素對照品溶液。分別精密量取空白膠束凍干粉、葛根素膠束10 mg，置于50 ml燒杯中加適量甲醇超聲20 min溶解，加甲醇定容，用0.45 μm微孔濾膜過濾，得陰性樣品溶液和葛根素膠束樣品溶液。3種溶液按“2.3.2”項下色譜條件進樣分析。結(jié)果表明，輔料等不干擾葛根素的分析。色譜圖見圖4。

圖4　高效液相色譜圖A.葛根素對照品溶液；B.陰性樣品溶液；C.葛根素膠束樣品溶液Fig 4　HPLC chromatogramsA.puerarin control solution；B.negative sample solution；C.Puerarin polymeric micelles solution

2.3.4標準曲線的建立精密稱取葛根素適量，用流動相制成0.050 8 mg/ml的對照品貯備液，備用。貯備液分別加流動相稀釋為2.032、4.064、6.096、8.128、10.16 μg/ml的系列對照品溶液，進樣測定。以峰面積（y）為縱坐標、質(zhì)量濃度（x）為橫坐標，得回歸方程：y=74 432x+4 850.1（R2=0.999 4）。結(jié)果表明，葛根素檢測質(zhì)量濃度線性范圍為2～10 μg/ml。

2.3.5靈敏度試驗取2.032 μg/ml葛根素對照品溶液進行一系列稀釋，分別進樣測定。以信噪比為3時的質(zhì)量濃度為最低檢測限質(zhì)量濃度，以信噪比為10時的質(zhì)量濃度為最低定量限濃度。結(jié)果，葛根素的最低檢測限質(zhì)量濃度為0.5 μg/ml，最低定量限質(zhì)量濃度為2.0 μg/ml，即最低檢測限為0.01 μg、最低定量限為0.04 μg。

2.3.6精密度試驗取葛根素對照品溶液低、中、高3個質(zhì)量濃度（2.032、6.096、10.16 μg/ml），進樣測定，同日內(nèi)連續(xù)進樣5次，計算日內(nèi)精密度；連續(xù)進樣5 d，計算日間精密度。結(jié)果，日內(nèi)RSD=0.19%、日間RSD=1.8%（n=3），表明精密度良好。

2.3.7穩(wěn)定性試驗取葛根素膠束樣品溶液，分別于放置0、4、8、24、72、168 h測定峰面積。結(jié)果，平均峰面積為685 641，RSD=1.5%（n=3），表明制備的樣品溶液至少在168 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.8方法回收率試驗分別取10.08 μg/ml的葛根素對照品溶液4、6、8 ml，各置于10 ml量瓶中，各加入空白膠束對照溶液1 ml，以甲醇定容至刻度，混勻，進樣測定。各質(zhì)量濃度溶液進樣3次，計算回收率。結(jié)果，方法回收率分別為99.5%、98.7%、99.4%（RSD分別為1.6%、0.4%、0.6%，n=3），平均方法回收率為99.2%（RSD為0.9%，n=3）。

2.4葛根素聚合物膠束中葛根素包封率和載藥量的測定

2.4.1提取回收率試驗分別取2.032、4.064、10.16 μg/ml的葛根素藥物溶液適量倒入離心管中，以4 000 r/min離心（離心半徑：13.5 cm）10 min，用0.45 μm微孔濾膜過濾。取離心、過濾前后的藥物溶液，進樣分析，計算游離藥物回收率。結(jié)果，平均回收率為95.3%（RSD=1.7%，n=3）。

2.4.2包封率和載藥量的測定按“2.1”項下薄膜分散法制備載藥膠束3份，采用離心-微孔濾膜法測定包封率和載藥量。精密稱取葛根素膠束溶液，倒入離心管中，4 000 r/min，離心（離心半徑13.5 cm）10 min，分離水層；加適量甲醇將膠束破壞，使包裹的藥物從膠束中游離出來，轉(zhuǎn)移到50 ml量瓶中，用流動相定容至刻度，用0.45 μm微孔濾膜過濾。水層和濾液進樣測定，記錄峰面積，先計算出載藥膠束中的葛根素質(zhì)量濃度，然后計算葛根素聚合物膠束藥物含量［10］，代入公式求得包封率（膠束中葛根素含量/葛根素投藥量×100%）和載藥量（膠束中葛根素含量/膠束量×100%）。結(jié)果，3批樣品平均包封率為（35.5±2.12）%，平均載藥量為（0.3±0.07）%。

3　討論

聚合物膠束的粒徑是藥物在體內(nèi)傳遞行為的關鍵因素。本研究制備的葛根素聚合物膠束平均粒徑約為54.12 nm，小于100 nm，更容易被口服吸收，為今后葛根素口服制劑的研究提供了理論基礎［11］；同時載藥后的粒徑比空白膠束粒徑稍大，這與載藥量的多少有關，一般載藥量越高，粒徑越大，系因包埋的藥物使得膠束的核區(qū)增大所致［12］。

包封率是評價聚合物膠束制劑的質(zhì)量標準指標之一，采用恰當?shù)姆椒▽⑤d藥聚合物膠束與游離的藥物分離是準確測定包封率的重要因素。一般分離聚合物膠束與游離藥物的方法有透析法、超濾法、凝膠柱層析法等［13］。透析法技術并不復雜，適用于分離小分子物質(zhì)，但操作耗時；超濾法需要選用適宜的Millipore超濾管，適用范圍窄［14］。由于葛根素微溶于水，在水中的溶解度為0.462 g/100 ml［15］，故所制得的膠束溶液中未包封藥物主要是以顆粒形式存在，離心過濾即可除去，所以本試驗使用離心-微孔濾膜法分離載藥聚合物膠束與游離的葛根素。結(jié)果顯示，本試驗制得的葛根素聚合物膠束包封率不高，特別是載藥量也較低，分析可能的原因為葛根素的水溶性與脂溶性均較差［16］，因此在球形的疏水核芯和親水殼層區(qū)域均不易裝載。

本試驗建立了葛根素含量及其膠束包封率的測定方法，結(jié)果表明該方法操作簡單、準確、可靠，可用于葛根素聚合物膠束中藥物含量和包封率的測定。

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（編輯：劉萍）

Preparation and Determination of Entrapment Efficiency of Puerarin Polymeric Micelles

MA Xiaoxing1，HAN Cuiyan1，LIU Chang1，ZHU Dan2，SUI Xiaoyu1，YUAN Cheng1，HUANG Haitao1
（1.College of Pharmacy，Qiqihar Medical University，Heilongjiang Qiqihar 161006，China；2.Dept.of Pharmacy，Qiqihar Hospital of TCM，Heilongjiang Qiqihar 161006，China）

OBJECTIVE：To prepare Puerarin polymeric micelles and establish a method to determine its entrapment efficiency. METHODS：Puerarin polymeric micelles were prepared by film dispersion method.The polymeric micelles and free drug were separated by centrifugal-millipore filter filtration method.The entrapment efficiency of puerarin polymeric micelles was determined by HPLC.Diamonsil C18（2）column was used with 1%citric acid solution-methanol（65∶35）at the flow rate of 1 ml/min.The detection wavelength was set at 250 nm，and column temperature was room temperature.RESULTS：The prepared polymeric micelles were spherical and spherical-like in shape with a mean particle size of 54.12 nm，polydispersity index of 0.122，Zeta potential of-13.60 mV；the linear range of puerarin was 2-10 μg/ml（R2=0.999 4）with average recovery rate of 99.2%（RSD=0.9%，n=3）.The recovery rate of free drug was 95.3%（RSD=1.7%，n=3）.The mean entrapment efficiency and drug-loading amount of puerarin were（35.5±2.12）%and（0.3±0.07）%，respectively（n=3）.CONCLUSIONS：Film dispersion method is suitable for the preparation of Puerarin polymeric micelles.Established method is convenient，accurate and reliable for the content and entrapment efficiency determination of Puerarin polymeric micelles.

Puerarin polymeric micelles；Film dispersion method；HPLC；Centrifugal-millipore filter filtration method；Entrapment efficiency

R943

A

1001-0408（2016）22-3122-03

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.22.29

齊齊哈爾市科學技術計劃項目（No.SFGG-201332）

＊講師，碩士。研究方向：制劑新技術與新劑型。E-mail：13846244161@163.com

2016-01-12

2016-03-22）