輔酶Q10長循環(huán)脂質(zhì)體及凍干制劑的制備與質(zhì)量控制Δ

楊碩曄，王　樂，劉　娜，王貫宇，潘夢宇，胡元森

（河南工業(yè)大學生物工程學院，鄭州　450001）

輔酶Q10長循環(huán)脂質(zhì)體及凍干制劑的制備與質(zhì)量控制Δ

楊碩曄＊，王樂，劉娜，王貫宇，潘夢宇，胡元森

（河南工業(yè)大學生物工程學院，鄭州450001）

目的：制備輔酶Q10長循環(huán)脂質(zhì)體，建立含量與包封率測定方法，并將其制成凍干制劑以提高穩(wěn)定性。方法：以薄膜分散法制備輔酶Q10長循環(huán)脂質(zhì)體。檢測所制脂質(zhì)體的粒徑和Zeta電位；采用高效液相色譜法測定藥物含量；魚精蛋白沉淀法分離脂質(zhì)體與游離藥物，計算包封率。將輔酶Q10長循環(huán)脂質(zhì)體制成凍干制劑，檢測其凍干0、30、90 d后藥物含量與包封率變化。結(jié)果：所制備的輔酶Q10長循環(huán)脂質(zhì)體大小均勻，粒徑約為（166.0±5.3）nm，Zeta電位約為（-22.2±1.4）mV，3批樣品中輔酶Q10的平均含量（占標示量的百分含量）為98.2%（RSD=2.8%），平均包封率為93.2%（RSD=4.6%）；與凍干0 d比較，凍干90 d后輔酶Q10長循環(huán)脂質(zhì)體凍干制劑的含量與包封率無明顯變化。結(jié)論：成功制得含量和包封率均較高的輔酶Q10長循環(huán)脂質(zhì)體和能凍干保存90 d的凍干制劑。

輔酶Q10；長循環(huán)脂質(zhì)體；凍干制劑；魚精蛋白沉淀法；質(zhì)量評價；冷凍干燥

輔酶Q10為脂溶性醌類化合物，是細胞呼吸鏈中的重要遞氫體，能激活細胞代謝，同時具有較強的天然抗氧化作用，可用于緩解體力疲勞、抗氧化和增強免疫力［1］。研究證實，其抑制皮膚脂質(zhì)過氧化、提高皮膚抗衰老的功能優(yōu)于維生素B與維生素E，因此被廣泛用作功能食品、藥品及保健品，在臨床上主要用于心血管疾病、壞血病、糖尿病、胃潰瘍、壞死性牙周炎、病毒性肝炎與癌癥的輔助治療藥［2］。

由于輔酶Q10分子質(zhì)量大、水溶性差、見光易分解，導致其在常規(guī)制劑如片劑、膠囊、注射劑中的穩(wěn)定性差，難以長期儲存，而且其體內(nèi)生物利用度也較低［3］。目前，如何使用制劑新技術有效提高輔酶Q10的穩(wěn)定性及生物利用度是其研究熱點，已開發(fā)的輔酶Q10新制劑包括固體分散體、環(huán)糊精包合物、納米粒、微囊等［4-6］。使用長循環(huán)材料將輔酶Q10制成納米脂質(zhì)體，可以增強其穩(wěn)定性、延長體內(nèi)循環(huán)時間、提高生物利用度［7］。筆者制備了輔酶Q10長循環(huán)脂質(zhì)體并將其制成凍干制劑，詳細考察了其粒子形態(tài)、粒徑、電位、含量、包封率等質(zhì)量指標，為進一步研究其體內(nèi)外釋放特性提供了試驗依據(jù)。

1　材料

1.1儀器

TGL-16B型低速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠，離心半徑：6.0 cm）；JEM-200CX型透射電子顯微鏡（日本Jeol公司）；Nano-ZS90型激光粒度分析儀（英國Malvern公司）；Agilent 1260型高效液相色譜儀，包括G1322A標準真空脫氣機、G1312C二元泵、G1316A標準柱溫箱、G1314B可變波長檢測器（安捷倫科技有限公司）。

1.2藥品與試劑

輔酶Q10對照品（上海晶純生化科技股份有限公司，批號：C111045，純度：98.5%）；注射用大豆磷脂（上海太偉藥業(yè)有限公司，種類：95，批號：130621）；磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000（DSPE-PEG2000）、二棕櫚酰磷脂酰甘油（DPPG）、膽固醇（美國Avanti公司，批號：880128C、840455P、700000）；硫酸魚精蛋白注射液（上海第一生化藥業(yè)有限公司，批號：20150609，規(guī)格：10 ml/支）；維生素E（VE，廣州日康食用化工有限公司）；甲醇、正己烷為色譜純，其余試劑均為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1輔酶Q10長循環(huán)脂質(zhì)體的制備

采用薄膜分散法制備輔酶Q10長循環(huán)脂質(zhì)體［8］。稱取適量輔酶Q10、豆磷脂95、DPPG、膽固醇或DSPE-PEG2000于茄形瓶中，加氯仿并超聲振蕩使充分溶解。將真空度控制在0.05 MP進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，至茄形瓶內(nèi)壁形成一層薄膜，通氮氣除盡剩余氯仿。精密加入去離子水8 ml，超聲使薄膜脫落成凝膠并充分分散，經(jīng)細胞破碎儀破碎后過0.45 μm濾膜，制得的輔酶Q10長循環(huán)脂質(zhì)體為淡黃色半透明狀液態(tài)制劑。由于輔酶Q10見光易分解，上述操作均在避光條件下完成。

2.2形態(tài)觀察

樣品用1%磷鎢酸進行負染色，使用透射電子顯微鏡觀察輔酶Q10長循環(huán)脂質(zhì)體的形態(tài)結(jié)構。結(jié)果顯示，脂質(zhì)體樣品均為類球形顆粒，表面的指紋狀分子層明顯。透射電鏡圖見圖1。

圖1　輔酶Q10長循環(huán)脂質(zhì)體的透射電鏡圖Fig 1　TEM photograph of coenzyme Q10 long-circulating liposomes

2.3粒徑、Zeta電位、多分散系數(shù)的測定

取3批次的輔酶Q10長循環(huán)脂質(zhì)體適量，用純凈水稀釋，激光粒度分析儀測定，動態(tài)光散射軟件進行數(shù)據(jù)處理，測得平均粒徑、Zeta電位、多分散系數(shù)（PDI），結(jié)果見表1。

表1　輔酶Q10長循環(huán)脂質(zhì)體的粒徑、Zeta電位和PDI的測定結(jié)果Tab 1　Results of particle size，Zeta potential and PDI of coenzyme Q10long-circulating liposomes

2.4輔酶Q10含量的測定

2.4.1溶液的制備精密稱取輔酶Q10對照品適量，用甲醇溶解并稀釋制成150 μg/ml的輔酶Q10對照品溶液。精密量取輔酶Q10長循環(huán)脂質(zhì)體1 ml（相當于1 mg輔酶Q10），置于100 ml量瓶中，加甲醇破乳溶解并定容，搖勻即得供試品溶液。制備不含輔酶Q10的空白脂質(zhì)體，同法制成空白脂質(zhì)體破乳溶液。

2.4.2色譜條件色譜柱：C18（200 mm×4.6 mm，5 μm），流動相：甲醇-正己烷（4∶1），流速：1.5 ml/min，柱溫：30℃，檢測波長：275 nm，進樣量：20μl。

2.4.3專屬性考察分別取輔酶Q10對照品溶液、空白脂質(zhì)體破乳溶液、空白脂質(zhì)體破乳溶液+輔酶Q10對照品溶液、供試品溶液進樣測定，記錄色譜。結(jié)果輔酶Q10的保留時間約為11.0 min，脂質(zhì)體輔料不干擾其測定。色譜圖見圖2。

圖2　高效液相色譜圖Fig 2　HPLC chromatograms

2.4.4標準曲線的繪制取輔酶Q10對照品適量制備成系列濃度的對照品溶液，進樣測定。以質(zhì)量濃度（c）為橫坐標、峰面積（A）為縱坐標進行回歸分析，得回歸方程為A=9.385×104c+ 30.303（r=0.999 2，n=5）。結(jié)果表明，輔酶Q10檢測質(zhì)量濃度的線性范圍為5.0～150.0μg/ml，檢測限與定量限分別為1、3 ng。

2.4.5精密度試驗取適量輔酶Q10對照品溶液，于同日內(nèi)測定6次，連續(xù)測定3 d，考察日內(nèi)、日間精密度。結(jié)果，日內(nèi)、日間RSD分別為1.20%、7.30%（n=3）。

2.4.6回收率試驗按處方比例取空白脂質(zhì)體于量瓶中，分別精確加入輔酶Q10對照品溶液（300 μg/ml）8.0、10.0、12.0 ml，純凈水定容，搖勻，0.45 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液進樣測定。另取輔酶Q10對照品溶液進樣，記錄峰面積，計算回收率分別為99.5%、96.3%、99.7%，RSD分別為0.64%、0.90%、0.54%（n=3）。

2.4.7穩(wěn)定性試驗取輔酶Q10對照品溶液2份，分別置于避光與光照條件（強度為2 000 lx）中，于0、2、4、6、8、10、12 h測定輔酶Q10含量。結(jié)果顯示，在避光環(huán)境中輔酶Q10的含量12 h內(nèi)基本不變，峰面積RSD為1.32%；而在光照條件下輔酶Q10含量12 h內(nèi)下降了約25%，因此在測定過程中須注意避光操作。

2.4.8含量測定分別取輔酶Q10對照品溶液和供試品溶液進樣測定，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算輔酶Q10含量。結(jié)果，3批次輔酶Q10長循環(huán)脂質(zhì)體中輔酶Q10的含量（占標示量的百分含量，下同）分別為96.7%、102.3%、95.6%，RSD分別為2.36%、1.87%、4.15%。

2.5輔酶Q10長循環(huán)脂質(zhì)體包封率的測定

2.5.1魚精蛋白用量對脂質(zhì)體分離的影響采用魚精蛋白沉淀法分離脂質(zhì)體與游離藥物，計算包封率。取硫酸魚精蛋白注射液適量，分別稀釋適當倍數(shù)得系列稀釋液。取100μl輔酶Q10長循環(huán)脂質(zhì)體，加入100μl稀釋液，混勻放置后精確加入4.0 ml純凈水，以離心半徑7.6 cm、12 000 r/min離心10 min，取上清液于540 nm波長處測定吸光度，記為A1；另取100μl輔酶Q10長循環(huán)脂質(zhì)體，直接加入4 ml純凈水，同法操作測定吸光度，記為A0；以（A0-A1）/A0×100%計算澄清度。同法測定系列稀釋液分離輔酶Q10長循環(huán)脂質(zhì)體所得上清液的澄清度。結(jié)果表明，使用較低量的魚精蛋白（0.5 mg）即可有效分離輔酶Q10長循環(huán)脂質(zhì)體與游離藥物（澄清度＞95%）。魚精蛋白用量對脂質(zhì)體分離效果的影響見圖3。

2.5.2魚精蛋白用量對輔酶Q10包封率的影響按“2.5.1”項下方法依次使用系列稀釋液分離輔酶Q10長循環(huán)脂質(zhì)體與游離藥物，取上清液按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，計算包封率。結(jié)果，魚精蛋白用量在0.1～1.0 mg范圍內(nèi)，輔酶Q10包封率在82%～90%之間，表明魚精蛋白用量對輔酶Q10包封率的影響不大。

2.5.3回收率試驗以甲醇制備低、中、高質(zhì)量濃度的輔酶Q10溶液，加入適量空白脂質(zhì)體并混勻作為樣品溶液，測定輔酶Q10的量；再以中質(zhì)量濃度的輔酶Q10對照品溶液作為對照，測定輔酶Q10的量，計算回收率。結(jié)果回收率分別為100.4%、104.5%、99.6%，RSD為4.31%、4.14%、4.59%（n=3）。

2.5.4包封率測定精密吸取適量脂質(zhì)體，按“2.5.1”項下方法操作，取上清液進樣，外標法計算游離藥物的質(zhì)量（m1）；另取適量脂質(zhì)體，加入甲醇破乳溶解，搖勻后進樣測定，計算藥物總量（m0），計算包封率（%）=（1-m1/m0）×100%。結(jié)果，3批次輔酶Q10長循環(huán)脂質(zhì)體的包封率分別為94.0%、94.2%、91.4%，RSD分別為4.63%、6.74%、2.54%。

2.6長循環(huán)脂質(zhì)體凍干制劑的制備

2.6.1凍干工藝將輔酶Q10長循環(huán)脂質(zhì)體從冰箱（4℃）中取出，使用渦旋混合器和超聲波清洗機分散均勻后再使用細胞破碎儀進行破碎，然后倒入燒杯，冷凍3 h。在冷凍完成前40 min，接通冷凍干燥機電源，打開制冷機，冷阱溫度開始降低。按下真空計開關，預凍結(jié)束后將樣品置于干燥盤中，罩上有機玻璃筒，按下快速充氣閥并拔出接嘴，以自動密封。按下真空泵開關，至真空度降到1 000 Pa以下，顯示實際真空度，冷凍干燥開始，24 h后，取出樣品即可。使用前加入去離子水，振搖充分即可重新形成脂質(zhì)體混懸液。

2.6.2凍干制劑的含量與包封率測定將輔酶Q10長循環(huán)脂質(zhì)體與其凍干制劑冷藏（4℃）或冷凍（-20℃）儲存，分別于0、30、90 d時測定輔酶Q10含量與包封率。結(jié)果脂質(zhì)體冷藏放置90 d，輔酶Q10含量從97.4%下降至73.1%，包封率從92.8%下降至74.7%，兩者分別下降了24.3%、18.1%；而其凍干制劑在冷凍條件下放置90 d后，輔酶Q10含量與包封率無明顯變化，僅分別下降了3.3%、5.2%。這提示所用凍干工藝合理有效，凍干制劑在冷凍條件下放置性質(zhì)穩(wěn)定，可實現(xiàn)脂質(zhì)體的長期儲存。

圖3　魚精蛋白用量對脂質(zhì)體分離效果的影響Fig 3　Effects of protamine dosage on the separation of liposomes

3　討論

對于輔酶Q10的含量測定，文獻報道有使用紫外分光光度法，但該法無法將脂質(zhì)體中的輔料與藥物有效分離，測定的結(jié)果將會有較大誤差；而在HPLC法文獻中多使用甲醇-無水乙醇混合溶劑作為流動相（二者比例為5∶95、1∶9或1∶1）［7，9］，本文也曾嘗試使用，發(fā)現(xiàn)這一組成的流動相優(yōu)點在于兩種溶劑混溶性好、輔酶Q10出峰時間早，但是峰形較差，不能將制劑處方中的輔料成分與藥物完全分離。通過試驗篩選以甲醇-正己烷（4∶1）為流動相，雖然藥物保留時間較長，但峰形好，而且能夠?qū)⒅|(zhì)輔料與藥物完全分離，測定效果更好。

包封率是脂質(zhì)體重要的質(zhì)量指標，計算包封率通常需要將游離藥物與脂質(zhì)體分離后，分別測定游離藥物量與總藥物量［10］。對于輔酶Q10脂質(zhì)體的包封率測定，文獻中多采用有機溶劑提取法，該法需要用聚山梨酯80或其與有機溶劑的混合溶液，充分混勻并使脂質(zhì)體增溶，再將脂質(zhì)體洗脫、分步分離等［7］。這類法操作較煩瑣，而且由于步驟多，對測定結(jié)果引入誤差的環(huán)節(jié)也相應增加。魚精蛋白是一種由堿性氨基酸組成的高分子物質(zhì)，表面富含多聚陽離子，可通過靜電吸附與脂質(zhì)體結(jié)合，增加其密度而使其更易與游離藥物分離［11-12］。常規(guī)脂質(zhì)體表面多帶負電荷，因此該法適用于大多數(shù)脂質(zhì)體的包封率測定。

在對脂質(zhì)體破乳劑的選擇中，筆者曾嘗試分別使用甲醇、乙醇、氯仿、甲醇-氯仿（1∶1）、乙醇-氯仿（1∶1）。結(jié)果顯示，在等體積條件下，氯仿不能完全破乳，其余4種溶劑均能有效破乳，甲醇的效果優(yōu)于乙醇。從簡化操作角度考慮，選擇甲醇作為破乳劑。

穩(wěn)定性差是液狀脂質(zhì)體的突出問題，表現(xiàn)為粒子聚集導致粒徑變大、藥物從脂質(zhì)分子層中滲漏使包封率下降等。通過冷凍干燥可使脂質(zhì)體的結(jié)構變得疏松多孔，其固狀形態(tài)易于復水后快速恢復活性［13］，且在此過程中藥物的理化性質(zhì)與生理活性基本保持不變。本試驗將輔酶Q10長循環(huán)脂質(zhì)體制成凍干制劑后使其穩(wěn)定性顯著提高，利于長期儲存。

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（編輯：鄒麗娟）

Preparation and Quality Control of Coenzyme Q10 Long-circulating Liposomes and Lyophilized Preparation

YANG Shuoye，WANG Le，LIU Na，WANG Guanyu，PAN Mengyu，HU Yuansen
（College of Bioengineering，Henan University of Technology，Zhengzhou 450001，China）

OBJECTIVE：To prepare Coenzyme Q10 long-circulating liposomes，establish the determination method of content and entrapment efficiency，and prepare it into lyophilized preparation to improve its stability.METHODS：Coenzyme Q10 long-circulating liposomes were prepared by film dispersion method.Particle size and Zeta potential of liposomes were determined，and HPLC assay was used to determine the content of coenzyme Q10.Free drugs and liposomes were separated using protamine aggregation method，and the encapsulation efficiency was calculated.Lyophilized preparation was prepared by coenzyme Q10 long-circulating liposomes，and the changes of content and encapsulation efficiency of drugs were determined 0，30 and 90 days after lyophilization.RESULTS：The liposomes were homogeneous in size with mean diameter of（166.0±5.3）nm and Zeta potential of（-22.2± 1.4）mV.Average content（the percentage of content accounted for labeled amount）and entrapment efficiency of 3 batches of sample were 98.2%（RSD=2.8%）and 93.2%（RSD=4.6%），respectively.Compared with 0 d after lyophilization，coenzyme Q10 long-circulating liposomes had no obvious change in the content and encapsulation efficiency 90 d after lyophilization.CONCLUSIONS：Coenzyme Q10 long-circulating liposomes with high quality and entrapment efficiency and lyophilized preparation being stored stably for 90 d have been prepared successfully.

Coenzyme Q10；Long-circulating liposomes；Lyophilized preparation；Protamine aggregation method；Quality evaluation；Freeze-drying

R943

A

1001-0408（2016）22-3115-03

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.22.27

河南省高等學校重點科研項目（No.15A350006）

＊講師，博士。研究方向：藥劑學、藥動學。電話：0371-67756253。E-mail：yangshuoyecpu@163.com

2015-09-27

2015-11-23）