浙江金華地區(qū)越冬意蜂群大量死亡原因調(diào)查與分析

鄭火青貢紅日蘇曉玲陳秀賢華啟云趙東緒胡福良

（1浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，杭州310058；2金華市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，金華321000）

浙江金華地區(qū)越冬意蜂群大量死亡原因調(diào)查與分析

鄭火青1貢紅日1蘇曉玲2陳秀賢1華啟云2趙東緒2胡福良1

（1浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，杭州310058；2金華市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，金華321000）

2014年冬，浙江多地意蜂群出現(xiàn)大量死亡。為了探究這一突發(fā)事件的原因，我們實(shí)地察看了現(xiàn)場(chǎng)、發(fā)放了調(diào)查問(wèn)卷，并取樣進(jìn)行了病毒和微孢子蟲(chóng)的檢測(cè)分析。結(jié)果表明，本次突發(fā)事件的主要原因可以排除急性農(nóng)藥中毒和急性污染物中毒的可能性。在病毒感染率上，患病蜂群DWV的感染率顯著高于健康蜂群，但健康蜂群BQCV的感染率卻顯著高于患病蜂群。在病毒多重感染水平和病毒滴度上，患病蜂群顯著高于健康蜂群；同時(shí)，患病蜂群N.ceranae的感染率和感染水平都要顯著高于健康蜂群。本研究提示多重病毒感染、DWV和IAPV的高病毒滴度及N.ceranae的感染和這次蜜蜂死亡事件密切相關(guān)。鑒于狄斯瓦螨在促進(jìn)病毒病方面的作用，蜂螨也有可能是蜂群死亡的間接原因之一。此外，本研究同時(shí)表明，幾乎所有的表面健康蜂群同時(shí)感染多種病原，健康情況堪憂。為避免類(lèi)似死亡事件的發(fā)生，一方面需力求降低病原體的感染水平，另一方面可以調(diào)整飼養(yǎng)管理方式促進(jìn)蜜蜂的健康水平，同時(shí)減少外界不良因素的刺激。

意蜂；蜂群死亡；病毒；多重感染；微孢子蟲(chóng)；狄斯瓦螨

1　前言

蜜蜂在維持生物多樣性以及提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力方面發(fā)揮著重要作用［1，2］。然而，近些年國(guó)際上報(bào)道了大量西方蜜蜂蜂群死亡的現(xiàn)象。盡管目前還沒(méi)有確切的答案來(lái)解釋這種現(xiàn)象，但是很多因素包括寄生蟲(chóng)、病原微生物［3］、農(nóng)藥中毒［4］以及氣候參數(shù)［4］被認(rèn)為是造成蜂群損失的主要原因［5］。

至今為止，已從蜂群中檢測(cè)出22種蜜蜂病毒［6-8］，其中蜜蜂急性麻痹病毒（acute bee paralysis virus，簡(jiǎn)稱ABPV）、蜜蜂黑蜂王臺(tái)病毒（black queen cell virus，簡(jiǎn)稱BQCV）、蜜蜂慢性麻痹病毒（chronic bee paralysis virus，簡(jiǎn)稱CBPV）、蜜蜂卷翅病毒（deformed wing virus，簡(jiǎn)稱DWV）、蜜蜂以色列急性麻痹病毒（israeli acute paralysis virus，簡(jiǎn)稱IAPV）、蜜蜂克什米爾病毒（kashmir bee virus，簡(jiǎn)稱KBV）以及蜜蜂囊狀幼蟲(chóng)病毒（sacbrood virus，簡(jiǎn)稱SBV）最為常見(jiàn)。一般情況下，這些病毒以隱性感染的形式存在于蜂群中［6］，可是當(dāng)外界環(huán)境以及飼養(yǎng)條件對(duì)蜂群健康產(chǎn)生壓力時(shí)，就有可能誘導(dǎo)蜂群出現(xiàn)癥狀并最終致死［9］。另外，西方蜜蜂的微孢子蟲(chóng)病特別是由N.ceranae引起的孢子蟲(chóng)病同樣被看作是蜂群損失的主要誘導(dǎo)因素之一［10］。

我國(guó)蜜蜂飼養(yǎng)管理精細(xì)，一直以來(lái)未見(jiàn)有如美國(guó)大范圍蜜蜂死亡現(xiàn)象的報(bào)道。但是近年來(lái)，在浙江及周邊地區(qū)不時(shí)有蜂農(nóng)反映蜜蜂死亡嚴(yán)重。2014/2015年越冬期間在浙江省金華、慈溪和平湖等地出現(xiàn)大量蜂群死亡現(xiàn)象，有不少蜂場(chǎng)全場(chǎng)覆沒(méi)。針對(duì)這一問(wèn)題，我們?cè)诮鹑A地區(qū)對(duì)蜂群死亡原因開(kāi)展了調(diào)查，同時(shí)取樣分析了病毒和微孢子蟲(chóng)的感染情況。

2　材料與方法

2.1問(wèn)卷調(diào)查

向金華地區(qū)34家轉(zhuǎn)地蜂場(chǎng)發(fā)放調(diào)查問(wèn)卷。調(diào)查內(nèi)容包括蜂群損失程度、周邊環(huán)境、蜜蜂死亡癥狀、治螨情況等。其中，蜂群損失程度分嚴(yán)重（蜂群損失達(dá)50%以上）、中等（蜂群損失30～50%左右）、輕微（蜂群損30%以下）和正常四個(gè)等級(jí)。

2.2樣本收集

2014年12月至2015年1月間，從15個(gè)有明顯損失的蜂場(chǎng)收集42群患病群的樣本，同時(shí)從10個(gè)蜂場(chǎng)收集40群健康群的樣本。每群取約100只蜜蜂。

2.37種常見(jiàn)蜜蜂病毒檢測(cè)

取30只蜜蜂加入2 ml水研磨，取170 μl研磨液用于檢測(cè)病毒，另取30 μl研磨液用于微孢子蟲(chóng)種鑒定。分別參照北京艾德萊生物科技有限公司的試劑盒（RN03）以及東洋紡（上海）生物科技有限公司的試劑盒（FSQ-201）步驟說(shuō)明進(jìn)行總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄，其中10 μl的反轉(zhuǎn)錄體系中含有1 μg的RNA。參照GenStar康潤(rùn)生物科技有限公司的PCR mix試劑盒（A112-10）進(jìn)行病毒檢測(cè)。病毒檢測(cè)的引物參照文獻(xiàn)［11，12］。PCR的反應(yīng)體系為12.5 μl水，1.25 μl 10μM的正向和反向引物，2 μl的模板，12.5 μl的2×Taq PCR StarMix，總體積為25 μl。PCR反應(yīng)過(guò)程：94℃2 min。35個(gè)循環(huán)：94℃30 s；54℃30 s；72℃30 s。最后72℃，延伸5 min。

2.4DWV和IAPV的qRT-PCR分析

已有大量報(bào)道表明DWV和IAPV與蜂群損失有關(guān)，而且我們的樣本中這兩種病毒流行率非常高，因此我們對(duì)這兩種病毒進(jìn)行了絕對(duì)定量分析［3，10］。以蜂場(chǎng)為單位，將每個(gè)蜂場(chǎng)取到的所有健康樣本或者患病樣本分別視為一個(gè)大的混合樣本，每個(gè)大混合樣本含有70只蜜蜂。RNA提取以及反轉(zhuǎn)錄過(guò)程同上。DWV和IAPV病毒的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制如下：引用已發(fā)表文獻(xiàn)的引物［12，13］制備重組質(zhì)粒，用于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。絕對(duì)定量qPCR反應(yīng)中采用SYBR Green法對(duì)DWV和IAPV進(jìn)行定量，反應(yīng)體系為10 μl THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix（QPS-201，Toyobo，Shanghai），1 μl 10 μM的正R向和反向引物，6 μl的水，2 μl的模板，總體積為20 μl。反應(yīng)程序：95℃ 1min；40個(gè)循環(huán)反應(yīng)：95℃ 15s；60℃1min；溶解曲線分析：95℃15 s；60℃15 s；95℃15 s。60℃至95℃的反應(yīng)總時(shí)間為20 min。取6 μl PCR產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳觀察，根據(jù)陽(yáng)性對(duì)照（陽(yáng)性質(zhì)粒）看其條帶大小。

2.5微孢子蟲(chóng)孢子計(jì)數(shù)和種的鑒定

從每群蜂樣本中取30只蜜蜂，取腹部加30 ml水研磨，通過(guò)鏡檢法檢測(cè)孢子數(shù)［14］。將30只蜜蜂加2 ml水研磨得到的30 μl研磨液進(jìn)行DNA提取。DNA提取參照Favorgen公司試劑盒（FATGK001，Taiwan，China）步驟說(shuō)明。采用Nosema apis和Nosema ceranae特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，取6 μl PCR產(chǎn)物進(jìn)行2.5%瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)引物擴(kuò)增結(jié)果確定微孢子蟲(chóng)種類(lèi)。

2.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理

采用Shapiro-wilk法測(cè)試各組數(shù)據(jù)是否服從正態(tài)分布。正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用參數(shù)檢驗(yàn)Student's-test比較，非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗(yàn)Mann-Whitney U test?？ǚ綑z驗(yàn)用于比較蜂群中微孢子和病毒感染水平的差異。P值小于0.05為差異顯著。

3　結(jié)果

3.1調(diào)查結(jié)果

3.1.1損失程度：調(diào)查的34家轉(zhuǎn)地蜂場(chǎng)中，損失嚴(yán)重的蜂場(chǎng)達(dá)16家（47%），損失中等8家，損失輕微2家，未見(jiàn)異常的有8家。

3.1.2死亡原因：本次調(diào)查的蜂場(chǎng)分布于金華地區(qū)不同區(qū)域，場(chǎng)地都是往年返場(chǎng)后同期的放蜂場(chǎng)地，周邊未見(jiàn)有毒蜜粉源植物開(kāi)花。損失嚴(yán)重的蜂場(chǎng)中有1家明確是農(nóng)藥中毒。所有蜂場(chǎng)都進(jìn)行規(guī)律地治螨，損失嚴(yán)重和損失中等的蜂場(chǎng)中各有1家蜜蜂螨害嚴(yán)重，其余所有蜂場(chǎng)蜜蜂在死亡前表現(xiàn)健康，能排除螨害和農(nóng)藥中毒的原因，且在春繁開(kāi)始后就自然好轉(zhuǎn)。后續(xù)分析中剔除螨害嚴(yán)重和農(nóng)藥中毒的3家蜂場(chǎng)。

損失嚴(yán)重的14家蜂場(chǎng)（已除去農(nóng)藥中毒和螨害嚴(yán)重的各1家蜂場(chǎng)），10家蜂場(chǎng)明確附近無(wú)工業(yè)污染源，4家蜂場(chǎng)附近有不同程度的污染源，另有2家蜂場(chǎng)附近有藥廠，不能排除污染的影響。損失中等的7家蜂場(chǎng)，5家明確附近無(wú)工業(yè)污染源，1家受螨害、大肚病和污染源的共同影響；另有2家蜂場(chǎng)附近有藥廠，不能排除污染的影響。損失輕微的蜂場(chǎng)，有1家反映附近有污染源和甘露蜜。

3.1.3死亡癥狀：死亡原因未知的損失嚴(yán)重和損失中等的21家蜂場(chǎng)中，有19家蜂場(chǎng)強(qiáng)群死亡更嚴(yán)重，有2家蜂場(chǎng)強(qiáng)群和弱群死亡相當(dāng)。

15家蜂場(chǎng)幼蜂、壯年蜂和老蜂均有死亡，4家主要是幼蜂死亡，1家主要是壯年蜂死亡，1家主要是壯年蜂和老年蜂死亡；所有損失中等以上的蜂場(chǎng)都在箱門(mén)口看見(jiàn)大量死蜂，有5家蜂場(chǎng)在箱內(nèi)也能見(jiàn)大量死蜂。

17家蜂場(chǎng)蜜蜂有爬蜂癥狀，16家蜂場(chǎng)死亡蜜蜂有伸吻現(xiàn)象，15家有展翅現(xiàn)象，16家腹部?jī)?nèi)彎，13家蜂場(chǎng)反映蜜蜂死亡前較往常暴躁，僅有4家蜂場(chǎng)有反映死亡蜜蜂有大肚子現(xiàn)象。蜂場(chǎng)損失情況、污染源情況及蜜蜂死亡癥狀統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表1。

表1　蜂場(chǎng)損失程度、污染源情況和蜜蜂死亡癥狀

3.2蜂群的病毒感染情況

3.2.1感染率比較：檢測(cè)結(jié)果顯示（圖1），蜜蜂病毒感染很普遍，BQCV、DWV和IAPV三種病毒不管在健康群還是患病群中的感染率都超過(guò)了75%，其中BQCV在健康群中的感染率達(dá)95%，IAPV在健康群和患病群中的感染率分別達(dá)90%和87.4%。CBPV、KBV和SBV檢出率較低，本研究未檢測(cè)到ABPV。患病蜂群的DWV感染率顯著高于健康蜂群的感染率（P=0.046），而B(niǎo)QCV在健康蜂群的感染率卻顯著高于在患病蜂群中的感染率（P=0.029）。此外，健康蜂群的CBPV、IAPV、KBV以及SBV的感染率與患病蜂群的感染率之間均不存在顯著性差異（P＞0.05）。

3.2.2多重感染比較：所有蜂群都能檢測(cè)到病毒，除1群外，所有蜂群都被2種或2種以上蜜蜂病毒感染（表2）?；疾》淙褐幸愿腥?種和4種蜜蜂病毒為主，感染率分別是35.1%和47.4%。健康蜂群以感染3種蜜蜂病毒（47.5%）為主，其次是2重感染（25%）和4重感染（22.5%）?；疾》淙汉徒】捣淙涸诟腥?種蜜蜂病毒的比例上不存在顯著差異（P=0.279），但患病蜂群4重感染率顯著高于健康蜂群（P=0.017），2重感染率顯著低于健康蜂群（P=0.01）。

圖1　患病蜂群和健康蜂群6種常見(jiàn)蜜蜂病毒的感染率（“*”表示P＜0.05）

表2　蜂群中蜜蜂病毒多重感染情況

3.2DWV和IAPV病毒滴度

DWV病毒在患病蜂群和健康蜂群中的病毒滴度分別為（1.95±1.58）×108和（8.31±1.39）×106，且二者存在顯著性差異（t=2.202，P=0.038）?；疾》淙旱腎APV病毒滴度（（3.72±1.68）×107）也顯著高于健康蜂群的病毒滴度［（1.35±1.57）×106］（U=34，P=0.035）（圖2）。

3.3微孢子蟲(chóng)的計(jì)數(shù)和鑒定

患病蜂群微孢子蟲(chóng)的檢出率（66.7%）極顯著的高于健康蜂群（17.5%）（P＜0.001）。同時(shí)患病蜂群感染微孢子蟲(chóng)孢子數(shù)平均達(dá)到了（2.12±0.72）×106，極顯著地高于健康蜂群的微孢子蟲(chóng)孢子數(shù)（4.3±0.19）×105（U=435，P＜0.001，圖3）。

微孢子蟲(chóng)種鑒別結(jié)果表明所有蜂群微孢子蟲(chóng)均為N.ceranae，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)N.apis。

4　討論

圖2　患病蜂群和健康蜂群DWV和IAPV病毒滴度比較（“*”表示P＜0.05）

圖3　患病蜂群和健康蜂群的微孢子蟲(chóng)孢子數(shù)比較（“***”表示P＜0.001）

針對(duì)國(guó)外大量的蜂群死亡現(xiàn)象，研究逐漸指向是病原、農(nóng)藥及環(huán)境等因素共同作用的結(jié)果［3，4，10］。近幾年來(lái)，已在浙江省連續(xù)出現(xiàn)越冬蜂大量死亡的現(xiàn)象，而且逐年越發(fā)嚴(yán)重。通過(guò)調(diào)查，我們基本能排除急性農(nóng)藥中毒或環(huán)境污染作為主要因素的可能性。狄斯瓦螨是西方蜜蜂的首要病害，但在這次事件中，蜂農(nóng)都明確蜂螨都得到了有效控制，我們的實(shí)地勘察也確認(rèn)了這一點(diǎn)，可以排除蜂螨作為直接致病因素的可能性；但鑒于蜂螨在促進(jìn)蜜蜂病毒病爆發(fā)方面的關(guān)鍵作用，我們并不能排除蜂螨作為間接致病因素的可能性。

已有多項(xiàng)研究表明，DWV和IAPV與國(guó)際上的蜂群損失有密切關(guān)系［3，10］。本研究病毒檢測(cè)結(jié)果表明，患病蜂群DWV和IAPV滴度都要顯著高于健康蜂群，說(shuō)明DWV和IAPV滴度與蜂群死亡有著密切關(guān)系。

本研究中幾乎所有的蜂群都有1種以上的蜜蜂病毒感染?；疾》淙阂酝瑫r(shí)感染3種或4種病毒為主，健康蜂群以同時(shí)感染3種病毒為主，患病蜂群和健康蜂群相比，多重感染情況更為嚴(yán)重。這一結(jié)果表明，病毒的多重感染與蜂群死亡有關(guān)。

同時(shí)，需要指出的是，本研究檢測(cè)到了除ABPV之外的6種病毒，且所有蜂群都有病毒感染，尤其是BQCV、DWV和IAPV在健康蜂群或患病蜂群的感染率都在75%以上，此外BQCV在健康蜂群的感染率顯著高于患病蜂群的感染率，說(shuō)明蜜蜂健康狀態(tài)堪憂。在氣候適宜、生產(chǎn)強(qiáng)度不大和營(yíng)養(yǎng)充足等條件下，蜂群能夠不表現(xiàn)任何癥狀，一旦環(huán)境條件惡劣、生產(chǎn)強(qiáng)度大或營(yíng)養(yǎng)缺失等不良因素出現(xiàn)，蜂群可能就會(huì)出現(xiàn)衰敗或崩潰。而越冬期間，外界條件惡劣，蜂群營(yíng)養(yǎng)缺失，是蜂群健康最敏感的時(shí)期。

N.ceranae在很多國(guó)家被認(rèn)為是引起蜂群損失的重要原因。本研究中，患病蜂群的檢出率和孢子數(shù)都要顯著高于健康蜂群，說(shuō)明N.ceranae也與本次蜜蜂死亡事件密切相關(guān)。本研究中N.ceranae在健康蜂群中的檢出率偏低，可能與取樣的季節(jié)有關(guān)。

總之，本研究表明，多重病毒感染、DWV和IAPV的高病毒滴度及N.ceranae的感染和這次蜜蜂死亡事件密切相關(guān)。同時(shí)表明，即使是表面健康的蜂群也同時(shí)受到多種病原的感染，甚至在病毒感染率上與患病蜂群沒(méi)有太大差異。這些病原的感染降低了蜜蜂的健康水平，但還未到出現(xiàn)明顯癥狀的水平，一旦加以外界不良因素的刺激，原本脆弱的健康可能崩潰。

本研究提示，越冬期間蜜蜂突然死亡可能是外界不良因素的刺激和原本潛伏于蜜蜂體內(nèi)的病原共同作用的結(jié)果。為避免類(lèi)似死亡事件的發(fā)生，一方面需降低病原物的感染水平，另一方面可以調(diào)整飼養(yǎng)管理促進(jìn)蜜蜂的健康水平，同時(shí)減少外界不良因素的刺激。

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Investigation and analysis of large scale colony losses of Apis mellifera in winter in Jinhua，Zhejiang

Zheng Huoqing1，Gong Hongri1，Su Xiaoling2，Chen Xiuxian1，Hua Qiyun2，Zhao Dongxu2，Hu Fuliang1
（1 College of Animal Sciences，Zhejiang University，Hangzhou310058；2 Academy of Agricultural Sciences of Jinhua，Jinhua，321000）

Large scale colony losses of Apis mellifera happened in several regions in Zhejiang Province in the winter of 2014.In order to explore the causes of the colony losses，we inspected the occurrence sites，issued the questionnaires and analysed the infection of viruses and Nosema.Result indicated that acute pesticide and pollutant poisoning could be excluded as the major causes of the death.DWV infection rate of diseased colonies was significantly higher than that of healthy colonies，however，the BQCV infection rate was opposite.In addition，Nosema ceranae infection rates and spore loads of diseased colonies were significantly higher compared with that of healthy colonies.Our investigation and analysis suggested that multiple virus infections，high DWV and IAPV titers and N.ceranae infection were closely related to the colony losses.Considering the role of Varroa mites in promoting virus proliferation，Varroa destructor might be one of the important indirect causes of the death.Moreover，it is worth noting that almost all apparently healthy colonies were infected with a variety of pathogens，which suggested that the health of these colonies were actually in a serious condition.To prevent similar incidents，efforts should be carried outto decrease infection levels of pathogens.Meanwhile，management manners should be improved to increase the disease resistance of honeybees and the stimulations of environmental adverse factors should be avoided.

Apis mellifera，colony losses，virus，multiple infections，N.ceranae，Varroa destructor

國(guó)家蜂產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專(zhuān)項(xiàng)（CARS-45），金華市農(nóng)業(yè)研究計(jì)劃項(xiàng)目（2014-2-009）

胡福良，E-mail：flhu@zju.edu.cn