傳統(tǒng)中藥中抗動(dòng)脈粥樣硬化PPARα激動(dòng)劑的虛擬篩選

杜　霞，張鑫磊，李　曄*

(1.陜西省中醫(yī)藥研究院中藥研究所，西安　710003；2.第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系，西安　710032)

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·化學(xué)·

傳統(tǒng)中藥中抗動(dòng)脈粥樣硬化PPARα激動(dòng)劑的虛擬篩選

杜霞1，張鑫磊2，李曄1*

(1.陜西省中醫(yī)藥研究院中藥研究所，西安710003；2.第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系，西安710032)

目的 基于傳統(tǒng)中藥尋找抗動(dòng)脈粥樣硬化的先導(dǎo)藥物分子。方法過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)是抗動(dòng)脈粥樣硬化的研究熱點(diǎn)之一，以該受體為靶標(biāo)，采用計(jì)算機(jī)輔助藥物分子設(shè)計(jì)方法中的藥效團(tuán)篩選、分子對接和相互作用模式分析對傳統(tǒng)中藥數(shù)據(jù)庫進(jìn)行虛擬篩選。結(jié)果從含有37 170個(gè)化合物的傳統(tǒng)中藥數(shù)據(jù)庫中優(yōu)選出20個(gè)活性較好的化合物，通過進(jìn)一步的氫鍵作用分析確認(rèn)3個(gè)先導(dǎo)化合物。結(jié)論該研究為新型抗動(dòng)脈粥樣硬化PPARα激動(dòng)劑的發(fā)現(xiàn)提供了新的方法和理論依據(jù)。

動(dòng)脈粥樣硬化；PPARα激動(dòng)劑；藥效團(tuán)篩選；分子對接

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種嚴(yán)重危害人類健康的慢性炎癥疾病[1-2]。1990年，英國科學(xué)家IssemannI等[3]發(fā)現(xiàn)了一種由配體調(diào)控的核激素受體——過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisomeproliferators-activatedreceptors，PPARs)，這是一類由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，主要包含3種亞型：α、δ和γ。近年來，大量實(shí)驗(yàn)表明，PPARα經(jīng)配體激活后可以通過直接作用于動(dòng)脈管壁，從而抑制單核細(xì)胞向血管內(nèi)皮聚集并轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞，抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移以及抑制泡沫細(xì)胞的形成等炎癥細(xì)胞的趨化和浸潤，是動(dòng)脈粥樣硬化治療研究的熱點(diǎn)之一[4-9]。

目前，臨床使用的PPARα激動(dòng)劑類藥物主要為貝特類藥物，如：氯貝特、苯扎貝特和環(huán)丙貝特等。該類藥物的突出作用就是可以顯著降低三酰甘油，通過糾正血脂異常來發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用[10-11]。然而，這類藥物與受體的結(jié)合能力較弱、選擇性較低,服用一段時(shí)間后通常需要增大服用劑量來維持療效，長期服用還可引起肝腎功能損害以及藥物性橫紋肌溶解癥等不良反應(yīng)[12-13]。因此，從傳統(tǒng)中藥出發(fā)，尋找更加安全有效的天然高選擇性PPARα激動(dòng)劑類藥物成為抗動(dòng)脈粥樣硬化研究領(lǐng)域的重點(diǎn)和難點(diǎn)。本論文綜合采用計(jì)算機(jī)輔助藥物分子設(shè)計(jì)中藥效團(tuán)篩選和分子對接方法從傳統(tǒng)中藥數(shù)據(jù)庫中快速篩選出PPARα的天然配體，為新型治療動(dòng)脈粥樣硬化藥物的研發(fā)提供先導(dǎo)化合物。

1　方法與計(jì)算

1.1數(shù)據(jù)庫的選取及處理采用由臺(tái)灣中國醫(yī)藥大學(xué)ChenCY教授建立的傳統(tǒng)中藥數(shù)據(jù)庫TCMDatabase@Taiwan[14]進(jìn)行虛擬篩選。該數(shù)據(jù)庫是目前世界上最大、最全面的中藥類數(shù)據(jù)庫，包含352種中草藥，共計(jì)37 170個(gè)化合物。使用Accelrys公司的PipelinePilot8.5軟件對該數(shù)據(jù)庫進(jìn)行以下處理，去除重復(fù)分子，經(jīng)處理后，共輸出8 710個(gè)活性化合物，然后采用Lipinski的類藥性五規(guī)則，用于對化合物庫的初篩，最終得到5 324個(gè)候選化合物。

1.2藥效團(tuán)構(gòu)建從蛋白質(zhì)晶體的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中獲得16個(gè)對PPARα有明確激動(dòng)活性的小分子配體，按照結(jié)合位置比較挑選出5個(gè)與受體結(jié)合位點(diǎn)一致的配體作為訓(xùn)練集，使用DiscoveryStudio3.5軟件中的DSCatalystConformation進(jìn)行多構(gòu)象化設(shè)置，對每個(gè)小分子產(chǎn)生最多255個(gè)構(gòu)象用以表征小分子的構(gòu)象空間，創(chuàng)建能量值在能量閾值20kcal·mol-1之內(nèi)的構(gòu)象。然后，由Receptor-LigandPharmacophoreGeneration(RLPG)模塊進(jìn)行PPARα激動(dòng)劑藥效團(tuán)模型的構(gòu)建。使用DSCatalystStructureBasedPharmacophore(SBP)生成具有4～8個(gè)特征元素的20種藥效團(tuán)模型。通過藥效團(tuán)特征元素聚類分析和與活性化合物的活性值匹配情況進(jìn)行比較，選擇最優(yōu)的藥效團(tuán)模型進(jìn)行后續(xù)的篩選。

1.3藥效團(tuán)篩選和分子對接利用上述得到的較優(yōu)藥效團(tuán)模型5號(hào)藥效團(tuán)對5 324個(gè)候選化合物進(jìn)行虛擬篩選，為了得到多樣性良好的先導(dǎo)化合物，對所有候選化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)聚類分析，從中挑選出打分最好的化合物作為候選分子。分子對接是2個(gè)或多個(gè)分子之間通過幾何匹配和能量匹配而相互識(shí)別的過程，是最重要的計(jì)算機(jī)輔助藥物分子設(shè)計(jì)方法之一[15]。使用DSLigandFit模塊，將上述藥效團(tuán)篩選后的20種候選化合物分別與PPARα受體進(jìn)行分子對接，通過對打分函數(shù)分析及受體與配體之間的相互作用模式確定先導(dǎo)化合物。

2　結(jié)果與討論

2.1藥效團(tuán)模型評(píng)估根據(jù)訓(xùn)練集化合物所含藥效團(tuán)特征構(gòu)建出20個(gè)藥效團(tuán)模型。通過對已知的活性化合物建立測試集驗(yàn)證模型，區(qū)分活性化合物能力和篩選能力，從而優(yōu)選出適合用于進(jìn)一步篩選的藥效團(tuán)模型。通過對20種藥效團(tuán)模型進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果表明，Pharmacophore5， 8， 10， 12， 14， 16， 18， 19和20的SE均為0.800 00，較其他藥效團(tuán)模型得分較高。根據(jù)對幾種得分較高藥效團(tuán)模型的綜合比較，我們最終選定5號(hào)藥效團(tuán)作為后續(xù)篩選的藥效團(tuán)模型。5號(hào)藥效團(tuán)具有2個(gè)氫鍵受體(hydrogen-bondacceptor，HBA)，4個(gè)疏水基團(tuán)(hydrophobicpoint，HY)和27個(gè)排除體積(excludedvolumes，EV)，其與陽性對照物BMS-687453的匹配圖見圖1。由圖1可知，BMS-687453結(jié)構(gòu)中的羧酸端羰基和羥基與氫鍵受體特征匹配，而結(jié)構(gòu)中的2個(gè)芳香環(huán)、1個(gè)五元環(huán)及與酯基連接的甲基與疏水中心特征匹配。

Fig.1MappingofPPARαagonistpharmacophoremodel5#andcompoundBMS-687453inthetrainingset

2.2藥效團(tuán)篩選傳統(tǒng)中藥數(shù)據(jù)庫TCMDatabase@Taiwan是由臺(tái)灣中國醫(yī)藥大學(xué)建立的免費(fèi)虛擬篩選數(shù)據(jù)庫，包含352種中草藥，共計(jì)約4萬種中藥成分化合物。利用所得較優(yōu)的5號(hào)藥效團(tuán)模型，對該數(shù)據(jù)庫進(jìn)行虛擬篩選，通過除重、Lipinski的類藥性五規(guī)則和藥效團(tuán)篩選等一系列操作，初步得到20個(gè)命中結(jié)構(gòu)，見圖2。

圖2測試集化合物的結(jié)構(gòu)示意圖

Fig.2Thechemicalstructuresofthetestsetcompounds

2.3分子對接由于得到的活性化合物較多，為了進(jìn)一步分析這些化合物與PPARα活性位點(diǎn)的相互作用，選取PDB數(shù)據(jù)庫中的PPARα與BMS-687453復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)中的蛋白作為受體(PDBID:3KDT)[16]，利用DS中Libdock模塊將這20個(gè)命中結(jié)構(gòu)分別對接到受體的活性位點(diǎn)，提取對接構(gòu)象后，采用ScoreLigandPose通過不同的打分函數(shù)對構(gòu)象進(jìn)行打分，主要包括：LigScore，PLP，PMF，Jain和Ludi等。為了合理地選擇打分函數(shù)，繪制5種訓(xùn)練集化合物的所有打分函數(shù)與活性IC50值的散點(diǎn)圖，計(jì)算各個(gè)模型的線性回歸系數(shù)。結(jié)果表明，Jain和Ludi具有最高的線性系數(shù)，因此，我們選擇這2種打分函數(shù)作為評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，列出了20種命中化合物的打分函數(shù)Jain和Ludi值，見表1。根據(jù)訓(xùn)練集化合物打分與富集率的關(guān)系，我們認(rèn)為：化合物的Jain值在0.568 5～2.647 5之間，或其Ludi值的范圍在820～1 030之間，可作為選擇候選藥物分子的依據(jù)。據(jù)此，化合物3，8，10，11，14，16和20可作為潛在的藥物分子。

表120個(gè)測試集化合物的Jain和Ludi打分函數(shù)值

Tab.1ResultsofJainandLudiscoringfunctionsfor20testsetcompounds

序號(hào)JainLudi序號(hào)JainLudi1-0.06307111.7359224.00598125.7464931.54303133.9469344.14669142.2664253.22745155.2576263.40602161.2745170.39522173.6256882.35363184.0966592.66594193.98600105.378242010.10884

2.4相互作用模式分析對PPARα的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析可以看出，PPARα受體的13個(gè)α螺旋和1個(gè)小四鏈體的β片層共同組成1個(gè)“Y”型的疏水口袋，該疏水口袋即受體與配體的結(jié)合區(qū)域。PPARα激動(dòng)劑大多含有1個(gè)酸性的頭部基團(tuán)、1個(gè)疏水的尾部基團(tuán)和1個(gè)中間的連接部分，以訓(xùn)練集化合物BMS-687453為例，PPARα受體與BMS-687453結(jié)合區(qū)域及氫鍵相互作用的結(jié)構(gòu)見圖3。由圖3可知，BMS-687453的酸性頭部基團(tuán)與尾部的疏水基團(tuán)以1個(gè)“U”型結(jié)構(gòu)與受體結(jié)合,見圖3(a)。酸性端的O原子作為氫鍵受體，與PPAR受體上的殘基Cys276、Ser280、Tyr314、His440和Tyr464形成5個(gè)氫鍵，見圖3(b)和(c)。這種氫鍵在受體與配體的結(jié)合過程中起著至關(guān)重要的作用。另外幾種訓(xùn)練集化合物與受體形成氫鍵的情況分別為：AZ242與受體上殘基Tyr314(2個(gè)氫鍵)和Tyr464形成3個(gè)氫鍵；CTM與受體上殘基Tyr314和Ser280形成2個(gè)氫鍵；GW6471與受體上殘基Tyr314和Phe273形成2個(gè)氫鍵；NKS與受體上殘基Cys276、Ser280、Tyr314和Tyr464形成4個(gè)氫鍵。根據(jù)訓(xùn)練集化合物與受體形成氫鍵的情況可以看出，PPARα受體的殘基Cys276、Ser280、Tyr314和Tyr464是形成氫鍵的主要?dú)埢?，這些氨基酸殘基與配體形成的氫鍵網(wǎng)絡(luò)可以使AF-2(Activationfunction-2)螺旋穩(wěn)定于一種構(gòu)象，從而使PPAR處于激活構(gòu)象，實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的調(diào)控。另外，配體尾部疏水部分與受體的疏水臂形成較強(qiáng)的疏水作用，可增強(qiáng)化合物與受體的結(jié)合力。

圖3PPARα受體和陽性對照物BMS-687453的結(jié)構(gòu)示意圖

a.結(jié)合圖;b.三維結(jié)構(gòu)示意圖;c.相互作用平面示意圖

Fig.3ThestructuregraphsofthePPARαreceptorandBMS-687453a.bindingregion;b.three-dimensionalstructuregraph;c.planeschematicofinteractionbetweenthereceptorandligand

PPARα受體和陽性對照物BMS-687453的結(jié)構(gòu)示意圖見圖4。由圖4可知，經(jīng)打分函數(shù)后確定的7種潛在藥物先導(dǎo)化合物與PPARα受體的氫鍵作用圖可以看出化合物3與殘基Tyr314、SER280和TYR464形成3個(gè)氫鍵；化合物8與殘基SER280、TYR314(2個(gè))和TYR464形成4個(gè)氫鍵；化合物10與殘基SER280形成1個(gè)氫鍵；化合物11與受體無氫鍵形成；化合物14和16均與殘基TYR464形成1個(gè)氫鍵；化合物20與CYS276、SER280、TYR314和TYR464形成4個(gè)氫鍵。綜合考慮打分函數(shù)及氫鍵的相互作用，化合物3，8和20與PPARα受體的結(jié)合能力較好。為了進(jìn)一步證明這種結(jié)合體現(xiàn)的是配體對受體的激動(dòng)作用，我們將化合物3，8和20分別與處于激活狀態(tài)和非激活狀態(tài)的受體進(jìn)行分子對接，對接后與激活態(tài)的打分值分別為：66.22,95.32和152.66，與非激活態(tài)的打分值分別為：53.21,88.24和125.72。結(jié)果表明，這3種化合物與激活狀態(tài)下的受體打分明顯高于非激活狀態(tài)下的受體。綜上所述，經(jīng)過計(jì)算機(jī)虛擬篩選獲得的3種化合物可作為PPARα激動(dòng)劑的候選藥物分子，為今后的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證及臨床研究奠定基礎(chǔ)。

圖4PPARα受體和7種先導(dǎo)化合物間氫鍵相互作用示意圖

Fig.4TheschematicofthehydrogenbondinteractionsbetweenthePPARαreceptorand7leadcompounds

3　結(jié)論

本文通過對傳統(tǒng)中藥數(shù)據(jù)庫進(jìn)行虛擬篩選，從傳統(tǒng)中藥中獲得具有潛在抗動(dòng)脈粥樣硬化作用的PPARα激動(dòng)劑。通過虛擬篩選得到了20個(gè)結(jié)合模式合理的化合物，對這些小分子配體與PPARα受體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分子對接，通過比較打分函數(shù)及氫鍵的相互作用分析共得到了3個(gè)理論上與受體結(jié)合能力較好的、可作為PPARα受體激動(dòng)劑的化合物。本文的結(jié)果可為研究從傳統(tǒng)中藥中尋找新型抗動(dòng)脈粥樣硬化藥物提供可靠的理論依據(jù)。

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The virtual screening of anti-atherosclerosis PPARα agonists in traditional Chinese medicines

DU Xia1，ZHANG Xinlei2，LI Ye1*

(1.Institute of Traditional Chinese Medicine，Shaanxi Academy of Traditional Chinese Medicine，Xi′an 710003，China；2.School of Pharmacy，the Fourth Military Medical University，Xi′an 710032，China)

ObjectiveTodiscoverthepotentialanti-atherosclerosisdrugsbasedonthetraditionalChinesemedicines.MethodsTheperoxisomeproliferators-activatedreceptorαagonist(PPARαagonist)isoneofthehotspotsfortreatingatherosclerosis.Inthispaper，acomputer-aideddrugdesign(CADD)methodwasusedtoperformthevirtualscreeningoftraditionalChinesemedicinedatabasebasedonthetargetPPARα ，suchaspharmacophorescreening，moleculardockingandanalysisoftheinteraction.ResultsWefound20compoundsfromthetraditionalChinesemedicinedatabase，whichcontains37 170compoundsinall，andweeventuallyconfirmed3leadcompoundsbyfurtherusingtheanalysisofthehydrogenbondinginteractions.ConclusionTheresultsprovideareferenceforthediscoveryofnewanti-atherosclerosisPPARαagonists.

atherosclerosis；PPARαagonist；pharmacophorescreening；moleculardocking

陜西省中醫(yī)管理局中醫(yī)藥課題(編號(hào)：15-ZY017)

杜霞，女，博士

10.3969/j.issn.1004-2407.2016.05.019

R914

A

1004-2407(2016)05-0505-04

李曄，女，研究員

2015-11-02)