孕婦血漿游離核酸高通量測(cè)序檢測(cè)胎兒遺傳異常

殷旭陽　陳芳,2　王威

(1．深圳華大基因研究院，廣東 深圳 518083；2．哥本哈根大學(xué)，丹麥 哥本哈根 2200；3：深圳華大臨床檢驗(yàn)中心，廣東 深圳518083)

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孕婦血漿游離核酸高通量測(cè)序檢測(cè)胎兒遺傳異常

殷旭陽1陳芳1,2王威3*

(1．深圳華大基因研究院，廣東 深圳 518083；2．哥本哈根大學(xué)，丹麥 哥本哈根 2200；3：深圳華大臨床檢驗(yàn)中心，廣東 深圳518083)

孕婦血漿中胎兒源性的游離DNA的發(fā)現(xiàn)，為無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)(noninvasive prenatal testing，NIPT)奠定了科學(xué)基礎(chǔ)。通過對(duì)孕婦外周血中的游離DNA進(jìn)行檢測(cè)，能夠以無創(chuàng)的方式分析胎兒的遺傳特征，為產(chǎn)前篩查(prenatal screening)和產(chǎn)前診斷(prenatal diagnosis)提供了有效的手段。新一代高通量測(cè)序技術(shù)(nextgeneration sequencing,NGS)的發(fā)展及其在臨床的廣泛應(yīng)用，使其在孕婦血漿胎兒游離DNA檢測(cè)中的應(yīng)用成為必然趨勢(shì)，并推動(dòng)無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)技術(shù)的迅猛發(fā)展。通過孕婦血漿游離DNA的高通量測(cè)序，可實(shí)現(xiàn)胎兒的染色體非整倍體、單基因遺傳疾病、微缺失微重復(fù)的檢測(cè)，也可以對(duì)胎兒基因組、DNA甲基化組以及轉(zhuǎn)錄組等信息進(jìn)行分析。

孕婦血漿； 胎兒游離DNA； 無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)； 產(chǎn)前篩查； 產(chǎn)前診斷； 高通量測(cè)序

孕婦血漿中胎兒源性游離DNA的發(fā)現(xiàn)，為無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)(noninvasive prenatal testing，NIPT)奠定了科學(xué)基礎(chǔ)。通過對(duì)孕婦外周血中的游離DNA進(jìn)行檢測(cè)，能夠以無創(chuàng)的方式分析胎兒的遺傳特征，為產(chǎn)前篩查(prenatal screening)和產(chǎn)前診斷(prenatal diagnosis)提供了有效的手段。新一代高通量測(cè)序技術(shù)(nextgeneration sequencing,NGS)的發(fā)展及其在臨床的廣泛應(yīng)用，使其在孕婦血漿胎兒游離DNA檢測(cè)中的應(yīng)用成為必然趨勢(shì)，并推動(dòng)無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)技術(shù)的迅猛發(fā)展。通過孕婦血漿游離DNA的高通量測(cè)序，可實(shí)現(xiàn)胎兒的染色體非整倍體、單基因遺傳疾病、微缺失微重復(fù)的檢測(cè)，也可以對(duì)胎兒基因組、DNA甲基化組以及轉(zhuǎn)錄組等信息進(jìn)行分析。

1　孕婦血漿游離DNA測(cè)序檢測(cè)胎兒非整倍體

1997年，研究人員在一位懷男性胎兒的孕婦外周血的血漿中發(fā)現(xiàn)了胎兒Y染色體游離DNA[1]，從而確定母體血漿中存在胎兒游離DNA這一事實(shí)，并檢測(cè)出胎兒DNA約占母體血漿總游離DNA的3%～6%，其半衰期僅為16分鐘，說明此次妊娠的游離DNA不會(huì)受到之前妊娠胎兒的影響。之后的研究發(fā)現(xiàn)懷有唐氏綜合征胎兒的孕婦，其血漿中的總體胎兒游離DNA總量要高于懷有正常胎兒的孕婦[2]。隨著孕婦外周血游離DNA的研究，特別是檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，孕婦外周血的血漿逐漸成為無創(chuàng)檢測(cè)胎兒遺傳特征的理想材料。

妊娠中較常見的胎兒非整倍體，除了唐氏綜合征，即21-三體外，還有18-三體、13-三體，以及性染色體異常如X單體(Turner綜合征)等。以21-三體為例，原理上唐氏綜合征的胎兒應(yīng)釋放相對(duì)其他染色體更多的21號(hào)染色體DNA序列進(jìn)入母體血漿。因此通過母體血漿的全基因組高通量測(cè)序，并分析比對(duì)到每條染色體的數(shù)據(jù)量，將待測(cè)孕婦的數(shù)據(jù)與一組正常妊娠的孕婦的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，即可判定待測(cè)孕婦中的胎兒染色體數(shù)目異常。這種方法已被國(guó)內(nèi)外多家機(jī)構(gòu)應(yīng)用并證實(shí)其高準(zhǔn)確性[3]，包括檢測(cè)21-三體[4-9]、18-三體[4,6-9]、13-三體[6-9]，以及性染色體異常[3,8]和其他非整倍體[10,11]。

除全基因組測(cè)序，也可采用目標(biāo)區(qū)域測(cè)序分析孕婦血漿游離DNA以檢測(cè)胎兒非整倍體。通過雜交捕獲基因組上特定區(qū)域的DNA序列繼而進(jìn)行測(cè)序[12,13]，或者以多重PCR的方法[14-16]將多個(gè)SNP位點(diǎn)捕獲和擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增子進(jìn)行測(cè)序，通過分析雜合SNP位點(diǎn)的等位基因數(shù)據(jù)量差異，從而檢測(cè)胎兒目標(biāo)染色體的數(shù)目異常。

2004年，Chan等[17]發(fā)現(xiàn)孕婦血漿中胎兒來源的游離DNA長(zhǎng)度要短于母體來源的DNA。通過對(duì)DNA片段采用雙側(cè)末端測(cè)序的策略(paired-end)，可確定血漿中游離DNA片段的長(zhǎng)度。研究發(fā)現(xiàn)，孕婦血漿中母體來源的DNA其長(zhǎng)度峰值在166bp，而胎兒游離DNA的長(zhǎng)度峰值為143bp[18]。在懷有唐氏綜合征胎兒的孕婦血漿中，胎兒會(huì)釋放額外的21號(hào)染色體DNA序列，引起21號(hào)染色體總游離DNA的長(zhǎng)度分布偏短。這種現(xiàn)象在18-三體和13-三體胎兒的孕婦血漿中同樣存在。因此可通過孕婦血漿游離DNA長(zhǎng)度分布的分析來檢測(cè)胎兒染色體數(shù)目異常。這種片段長(zhǎng)度的分析方法也可用于孕婦血漿中胎兒濃度的檢測(cè)[19]。

DNA甲基化分析方法也可檢測(cè)孕婦血漿中的胎兒染色體數(shù)目異常，根據(jù)胎兒和母體在特定基因區(qū)的DNA甲基化差異，胎兒DNA多為高甲基化而母體DNA多為低甲基化。通過重亞硫酸鹽測(cè)序，對(duì)每條染色體特定基因區(qū)的甲基化程度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析來檢測(cè)胎兒染色體數(shù)目異常[20]。DNA甲基化的分析方法也可用于孕婦血漿中的胎兒濃度定量[21]。孕婦血漿中游離RNA的分析也可檢測(cè)胎兒染色體數(shù)目異常，通過對(duì)目標(biāo)染色體上胎盤特異表達(dá)RNA在孕婦血漿總RNA中的定量分析，可確定胎兒染色體非整倍體[22]。

2　孕婦血漿游離DNA測(cè)序檢測(cè)胎兒?jiǎn)位蜻z傳病

單基因遺傳病的無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)也有其意義，可以為存在羊膜腔穿刺禁忌證的孕婦提供一個(gè)備選方案。單基因病由單一基因突變引起，對(duì)檢測(cè)技術(shù)的精度要求高；此外，孕婦血漿中存在大量母源DNA干擾，致使檢測(cè)難度大大增加。目前，無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)單基因病的方法分為直接法和間接法。直接法是直接對(duì)突變位點(diǎn)序列進(jìn)行檢測(cè)，通過突變序列和野生型序列的比例推斷胎兒基因型；其中胎兒的父源突變很容易被區(qū)分，而母源突變則需要區(qū)分不同比例基因型的微量差異，胎兒DNA濃度越低，等位基因劑量差異越小，檢測(cè)越困難。間接法則是根據(jù)血漿DNA單體型劑量不平衡原理，通過SNP單體型連鎖分析確定胎兒的單體型，從而判定胎兒是否攜帶父源或母源致病基因；孕婦血漿游離DNA的測(cè)序結(jié)合夫婦雙方以及先證者的基因組DNA測(cè)序，計(jì)算出夫婦雙方的單體型以及致病基因的遺傳規(guī)律，繼而結(jié)合孕婦血漿的數(shù)據(jù)構(gòu)建出胎兒的單體型和基因型，最終確定胎兒是否患病或是否為攜帶者。這種基于單體型的無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)策略已在多種單基因疾病中得以實(shí)現(xiàn)，包括beta-地中海貧血[23]、α-地中海貧血[24]、先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥[25,26]、杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良[27]、楓糖尿病[28]、先天性耳聾[29]等。

圖1　孕婦血漿游離DNA測(cè)序檢測(cè)胎兒?jiǎn)位蜻z傳病的原理

F0與F1代表父親基因組的兩種單體型組成；M0與M1代表母親基因組的兩種單體型組成；胎兒的單體型分別來自父親和母親

地中海貧血是較為常見的單基因病之一，包括β-地貧和α-地貧，分別多由HBB基因點(diǎn)突變和HBA基因的片段缺失引起。Lam等人[23]于2012年采用包含HBB基因的目標(biāo)區(qū)域測(cè)序，結(jié)合夫婦雙方和先證者DNA測(cè)序進(jìn)行單倍型分析，從而實(shí)現(xiàn)了1例β-地中海貧血的無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)。Ge等人于2013年實(shí)現(xiàn)了5例α-地中海貧血的無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)[24]，其設(shè)計(jì)了包含HBA和HBB基因以及4525個(gè)常染色體SNP位點(diǎn)的捕獲探針，對(duì)5個(gè)家系的夫婦雙方、孕婦血漿以及羊水或臍血進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域測(cè)序。通過孕婦血漿的相對(duì)拷貝率(relative copy ratio,RCR)分析以及與正常對(duì)照組的R值和L值分析，成功鑒定了1例HBA基因純合缺失，2例HBA雜合缺失以及另2例正常的胎兒，并與羊水或臍血結(jié)果一致，證明了此方法對(duì)致病性片段缺失遺傳疾病進(jìn)行無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)的可行性。

杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良(Duchenne muscular dystrophy,DMD)是一種X性連鎖的隱性單基因遺傳病，DMD基因包含79個(gè)外顯子。Xu等[27]設(shè)計(jì)了涵蓋X和22號(hào)染色體的定制化芯片，進(jìn)行8個(gè)家系夫婦雙方和先證者以及孕婦血漿的目標(biāo)區(qū)域測(cè)序，通過夫婦雙方和胎兒的單倍型分析結(jié)合胎兒性別判定進(jìn)行檢測(cè)。原理上，對(duì)于男胎，其致病基因只能來自母方，因此只要其DMD基因單倍型與母方突變基因一致，即可判定此男胎患病；而對(duì)于女胎，則需結(jié)合父方的單倍型進(jìn)行綜合分析。最終在8個(gè)家系中，3例女胎中確定1例為攜帶者，2例為完全正常；另5例男胎，均確定遺傳了母方的突變基因，為患者。其8例無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)結(jié)果均與羊水結(jié)果一致。

CYP21A2，GJB2，BCKDHA基因突變分別可引起先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥(congenital adrenal hyperplasia,CAH)、先天性耳聾(congenital deafness)和楓糖尿病(maple syrup urine disease,MSUD)，且均為常染色體隱性遺傳病。Ma等人[25]和New等人[26]均于2014年建立了涵蓋CYP21A2基因的目標(biāo)區(qū)域測(cè)序，通過單倍型分析進(jìn)行孕婦血漿CAH無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)的方法。Meng等[29]也采用半定制化芯片目標(biāo)區(qū)域測(cè)序和單倍型方法，在1個(gè)家系中實(shí)現(xiàn)先天性耳聾的無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)，確定其胎兒為GJB2基因突變的攜帶者。You等[28]在一個(gè)家系中通過目標(biāo)測(cè)序發(fā)現(xiàn)了BCKDHA基因上可引起楓糖尿病的新型突變，并以此通過家系單體型方法實(shí)現(xiàn)胎兒的無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)，確定胎兒為楓糖尿病患者。

3　孕婦血漿游離DNA測(cè)序檢測(cè)胎兒微缺失微重復(fù)

孕婦血漿游離DNA測(cè)序不僅能檢測(cè)胎兒染色體的數(shù)目異常，且能檢測(cè)胎兒染色體片段缺失和重復(fù)，包括一些亞顯微水平的改變。最早由Peters等人[30]于2011年報(bào)道通過孕婦血漿全基因組測(cè)序，檢出胎兒12p11.22和12p12.1染色體區(qū)段間約4.2M的缺失。其后多個(gè)機(jī)構(gòu)亦報(bào)道孕婦血漿全基因組測(cè)序可檢測(cè)胎兒染色體微缺失與微重復(fù)[31-36]。其方法是將人類參考基因組分成許多窗口，將孕婦血漿游離DNA的測(cè)序數(shù)據(jù)與參考基因組比對(duì)，計(jì)算分布在每個(gè)窗口的測(cè)序數(shù)據(jù)量，再經(jīng)過GC偏差矯正，及與正常對(duì)照組的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，確定哪些窗口存在缺失重復(fù)，繼而判定胎兒的染色體微缺失微重復(fù)的位置和大小。每例血漿的測(cè)序數(shù)據(jù)量、胎兒濃度、缺失重復(fù)大小、窗口設(shè)置以及正常對(duì)照組的選擇等因素均會(huì)影響胎兒微缺失微重復(fù)檢測(cè)的效能。Chen等人[31]采用低深度基因組測(cè)序無創(chuàng)檢測(cè)10M以上缺失重復(fù)，1311例孕婦檢出4例陽性，有1例假陽性。Yin等人[35]對(duì)1476例B超異常孕婦進(jìn)行無創(chuàng)缺失重復(fù)檢測(cè)，測(cè)序深度10M read檢測(cè)靈敏度為94.5%(69/73)，出現(xiàn)55例假陽性，其中35例為母體缺失重復(fù)。Helgeson等[36]以全基因組測(cè)序?qū)?75393例孕婦進(jìn)行無創(chuàng)檢測(cè)5p缺失、22q11缺失、15q缺失、1p36缺失、4p缺失、11q缺失和8q缺失；對(duì)于22q11缺失，檢出32例陽性(0.02%)，其中20例母體染色體缺失，12例胎兒染色體缺失；對(duì)于1p36、15q和5p缺失，檢出20例陽性(0.01%)，其中16例真陽性。

基于SNP的目標(biāo)測(cè)序方法也可用于孕婦血漿中胎兒微缺失微重復(fù)的檢測(cè)。針對(duì)經(jīng)常發(fā)生缺失或重復(fù)而致病的染色體區(qū)域，選取足夠多的SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，多重PCR擴(kuò)增并測(cè)序，根據(jù)雜合SNP位點(diǎn)的等位基因劑量差異，可判定此位點(diǎn)是否發(fā)生缺失或重復(fù)，結(jié)合眾多SNP位點(diǎn)結(jié)果可確定此染色體區(qū)域的缺失重復(fù)及其大小。Wapner等人[37]已將這種方法應(yīng)用于22q11.2缺失，Prader-Willi/Angelman綜合征，1p36缺失綜合征和貓叫綜合征的無創(chuàng)檢測(cè)。Gross等人[38]在20776例孕婦中評(píng)價(jià)SNP方法無創(chuàng)檢測(cè)22q11.2缺失，檢出97例陽性(0.5%)，包括11例真陽性、50例假陽性、34例無臨床結(jié)局和2例母體缺失。

表1　孕婦血漿游離DNA測(cè)序可以檢測(cè)的胎兒疾病

4　孕婦血漿游離DNA測(cè)序分析胎兒基因組，DNA甲基化組與轉(zhuǎn)錄組

通過孕婦血漿游離DNA和夫婦雙方DNA的全基因組深度測(cè)序，可獲得胎兒的基因組序列，此結(jié)論已在多個(gè)機(jī)構(gòu)的研究中得以實(shí)現(xiàn)[18,39-41]，其胎兒的基因型和單倍型分析方法也各異。Lo等[18]最早嘗試無創(chuàng)產(chǎn)前分析胎兒基因組，但對(duì)夫婦雙方均為雜合的SNP位點(diǎn)無法分析，影響了方法的準(zhǔn)確性。Fan等[39]和Kitzman等[40]開發(fā)了準(zhǔn)確的胎兒?jiǎn)伪缎秃突蛐头治龇椒?，分別通過單細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和fosmid實(shí)驗(yàn)方法直接獲得母方單倍型，但限于胎兒濃度>6%才可準(zhǔn)確分析。Chen等[41]開發(fā)了結(jié)合家系中其他成員來構(gòu)建夫婦雙方單倍型，繼而同時(shí)分析胎兒的基因型和單倍型的策略，此方法不依賴于血漿胎兒濃度，相對(duì)來說更具實(shí)用性[42]。

從孕婦血漿游離DNA中也可分析胎兒的DNA甲基化組。Lun等[43]對(duì)孕婦血漿游離DNA進(jìn)行重亞硫酸鹽處理，之后進(jìn)行高通量測(cè)序，可以獲得包括胎兒DNA和大量母體背景的基因組甲基化譜。根據(jù)夫婦雙方SNP信息，可以計(jì)算出孕婦血漿中胎兒特異的SNP基因型，并據(jù)此將胎兒特異的DNA甲基化譜數(shù)據(jù)從母體背景中分離出來，構(gòu)建出胎兒的DNA甲基化組。孕婦血漿中胎兒的DNA甲基化組與胎盤很相似，甲基化程度都比較低，從中Lun等人還發(fā)現(xiàn)了印記基因以及胎兒與母體的差異甲基化區(qū)域。

2000年在孕婦血漿中發(fā)現(xiàn)了胎兒游離RNA[44]。將孕婦血漿游離RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，再根據(jù)胎兒特異SNP基因型，可從血漿數(shù)據(jù)中選出胎兒來源的轉(zhuǎn)錄本，從而分析胎兒的轉(zhuǎn)錄組[45,46]。通過產(chǎn)前和產(chǎn)后母體血漿轉(zhuǎn)錄組的變化分析，可確定PAPPA等一百余個(gè)妊娠相關(guān)基因的表達(dá)情況[45]。通過與已有組織特異表達(dá)基因數(shù)據(jù)庫(kù)比較，還可以根據(jù)孕婦血漿轉(zhuǎn)錄組來分析胎兒的組織特異表達(dá)基因在不同孕周的變化情況[46]。

5　孕婦血漿游離DNA測(cè)序的臨床實(shí)踐

孕婦血漿游離DNA測(cè)序的臨床應(yīng)用主要以胎兒常見非整倍體的無創(chuàng)檢測(cè)為主，包括21-三體，18-三體和13-三體，以及性染色體異常。無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)的臨床應(yīng)用需與傳統(tǒng)B超檢查、血清學(xué)篩查等結(jié)合起來，其陽性結(jié)果需經(jīng)介入性產(chǎn)前檢測(cè)驗(yàn)證。孕婦血漿DNA無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)已在高危孕婦人群中進(jìn)行臨床驗(yàn)證研究[6]并證實(shí)其可靠性，而隨著這項(xiàng)新技術(shù)臨床實(shí)踐不斷深入，其在低危人群中的表現(xiàn)也受到關(guān)注，并不斷擴(kuò)展至更廣泛的人群[7,9]。孕婦血漿無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)的靈敏度為99.17%(21-三體)、98.24%(18-三體)、100%(13-三體)，特異性為99.95%(21-三體)、99.95%(18-三體)、99.96%(13-三體)[9]，檢測(cè)性染色體異常的靈敏度約為88.6%(Turner綜合征)、93.8%(其他性染色體異常)[47]。其假陽性率遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)血清學(xué)聯(lián)合篩查，因此可大大降低不必要的介入性產(chǎn)前檢測(cè)，也避免由于介入性手術(shù)引發(fā)的流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)。孕婦血漿無創(chuàng)產(chǎn)檢也可應(yīng)用于雙胎妊娠，目前已經(jīng)有一些前瞻性研究報(bào)道[48-50]，雙胎妊娠中的21-三體檢出率可達(dá)94.4%[47]。

一些生物學(xué)原因會(huì)導(dǎo)致孕婦血漿無創(chuàng)產(chǎn)檢結(jié)果與胎兒核型出現(xiàn)不一致的情況。由于孕婦血漿中包含胎兒DNA和大量的母體DNA背景，因此當(dāng)母體DNA存在染色體異常時(shí)，會(huì)干擾對(duì)胎兒染色體片段的分析，使無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)假陽性，其假陽性率、或不一致率在臨床研究中約為1%～2%水平。除了母體染色體異常[51]外，目前報(bào)道可以導(dǎo)致無創(chuàng)產(chǎn)檢結(jié)果與胎兒核型結(jié)果不一致的情況還包括胎盤特異性嵌合[52,53]，母體嵌合[54]等。亦有報(bào)道母體癌癥[11,55,56]也可在無創(chuàng)產(chǎn)檢中檢出，Bianchi等[55]在3757例NIPT陽性案例中發(fā)現(xiàn)10例母體癌癥。這些孕婦自身發(fā)生腫瘤的病例，孕婦本人在進(jìn)行無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)時(shí)普遍存在非特異性的多條染色體數(shù)目異常的結(jié)果，從而造成NIPT的假陽性結(jié)果。Amant等[56]也發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象。由于上述生物學(xué)因素在臨床實(shí)踐中難以避免，因此業(yè)內(nèi)多將孕婦血漿無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)作為一種產(chǎn)前篩查，而非診斷性檢測(cè)，其陽性結(jié)果必須經(jīng)介入性產(chǎn)前檢測(cè)的驗(yàn)證。針對(duì)這項(xiàng)新型檢測(cè)技術(shù)，包括我國(guó)、美國(guó)與歐洲等多個(gè)專業(yè)協(xié)會(huì)專家均發(fā)表了臨床指導(dǎo)與共識(shí)意見[57-59]，指導(dǎo)其臨床應(yīng)用。

對(duì)于無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)胎兒其他染色體非整倍體、微缺失與微重復(fù)以及單基因遺傳疾病的臨床應(yīng)用，業(yè)內(nèi)多持謹(jǐn)慎態(tài)度。染色體微缺失微重復(fù)的片段較小，其對(duì)應(yīng)的表型往往難以預(yù)測(cè)，當(dāng)產(chǎn)前檢出胎兒陽性時(shí)，其表型可能是完全正常的[60]，因此給臨床決策帶來困難。且因微缺失微重復(fù)發(fā)病率低，臨床檢測(cè)中的陽性預(yù)測(cè)值很低，因此很多專業(yè)團(tuán)體并不建議將無創(chuàng)檢測(cè)微缺失微重復(fù)作為常規(guī)的產(chǎn)前檢測(cè)[59]，而是針對(duì)特定人群開展[61]。目前對(duì)于無創(chuàng)微缺失微重復(fù)檢測(cè)的臨床實(shí)踐仍存爭(zhēng)議[62]。而關(guān)于其他非整倍體，Snyder等[11]統(tǒng)計(jì)了113 415例孕婦，檢測(cè)其他非整倍體陽性138例(0.12%)，在67例進(jìn)行了核型分析的孕婦中，47例(70%)胎兒染色體正常而為假陽性。國(guó)際產(chǎn)前診斷協(xié)會(huì)(International Society for Prenatal Diagnosis，ISPD)2015年聲明[57]指出，無創(chuàng)微缺失微重復(fù)檢測(cè)及其他非整倍體檢測(cè)應(yīng)限于臨床意義明確或已知嚴(yán)重表型的疾病，每種疾病應(yīng)有明確的檢出率、假陽性率等指標(biāo)，并配套相應(yīng)的專業(yè)咨詢。應(yīng)由孕婦自己決定是否檢測(cè)和獲知結(jié)果，并在臨床咨詢中詳細(xì)告知疾病信息和檢測(cè)的局限性。單基因遺傳病患病人群小，市場(chǎng)需求少，因其無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)同時(shí)需要家系的遺傳信息，分析周期相對(duì)較長(zhǎng)，同時(shí)費(fèi)用也更加昂貴，所以目前總體上仍處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，以個(gè)案的形式開展，并未進(jìn)入常規(guī)臨床實(shí)踐中。無論是無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)微缺失微重復(fù)、其他非整倍體還是單基因病，均以孕中晚期的介入性產(chǎn)前檢測(cè)結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)。關(guān)于無創(chuàng)單基因病檢測(cè)的臨床推廣仍需繼續(xù)探討。而胎兒的無創(chuàng)基因組、無創(chuàng)DNA甲基化和轉(zhuǎn)錄組分析亦處于技術(shù)研發(fā)階段，有待繼續(xù)發(fā)展。

6　不同基因組分析平臺(tái)的應(yīng)用

在無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)中應(yīng)用的NGS平臺(tái)有多種，目前主流使用的是Illumina公司的Hiseq2000平臺(tái)[4,7,12,15,18]，此外還有小型化的測(cè)序平臺(tái)MiSeq[63]，Life Technologies公司的SOLiD[64]以及半導(dǎo)體測(cè)序系統(tǒng)Ion torrent/Ion Proton[8,35,65]。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，單分子測(cè)序平臺(tái)Helicos[66]以及新型納米孔測(cè)序平臺(tái)nanopore[67]也開始應(yīng)用于無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)的技術(shù)研究。2014年，我國(guó)自主開發(fā)的BGISEQ1000測(cè)序平臺(tái)[68]首次獲得國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局(CFDA)認(rèn)證，對(duì)應(yīng)的胎兒染色體非整倍體(T21、T18、T13)檢測(cè)試劑盒(聯(lián)合探針錨定連接測(cè)序法)亦獲得CFDA審批，繼而小型化的BGISEQ500測(cè)序平臺(tái)亦于2015年推出，目前已進(jìn)入無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)的臨床測(cè)試階段。除NGS，亦有將目標(biāo)染色體片段制作成微陣列芯片進(jìn)行檢測(cè)[69]。NGS等基因組分析多種平臺(tái)的應(yīng)用及其技術(shù)不斷創(chuàng)新，為無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)的發(fā)展提供強(qiáng)大動(dòng)力。

7　結(jié)論

孕婦血漿游離DNA高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，使無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)胎兒的非整倍體、單基因遺傳病、微缺失微重復(fù)以及胎兒基因組、DNA甲基化組和轉(zhuǎn)錄組成為現(xiàn)實(shí)。胎兒非整倍體無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)的臨床實(shí)踐不斷開展，也推動(dòng)著孕婦血漿游離DNA測(cè)序的臨床應(yīng)用不斷擴(kuò)展。同時(shí)，我們也應(yīng)看到，在技術(shù)發(fā)展同時(shí)，其應(yīng)用規(guī)范化也至關(guān)重要，要求我們?cè)趯?shí)踐中不斷進(jìn)行評(píng)估和總結(jié)，使孕婦血漿無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)這項(xiàng)新型技術(shù)能夠?yàn)獒t(yī)學(xué)實(shí)踐帶來更多益處。

[1]Lo YM,Corbetta N,Chamberlain PF,et al.Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum[J].Lancet,1997,350:485-487.

[2]Lo YM,Lau TK,Zhang J,et al.Increased fetal DNA concentrations in the plasma of pregnant women carrying fetuses with trisomy 21[J].Clin Chem,1999,45:1747-1751.

[3]Jiang F,Ren J,Chen F,et al.Noninvasive Fetal Trisomy (NIFTY) test: an advanced noninvasive prenatal diagnosis methodology for fetal autosomal and sex chromosomal aneuploidies[J].BMC Med Genomics,2012,5:57.

[4]Dan S,Wang W,Ren J,et al.Clinical application of massively parallel sequencing-based prenatal noninvasive fetal trisomy test for trisomies 21 and 18 in 11,105 pregnancies with mixed risk factors[J].Prenat Diagn,2012,32:1225-1232.

[5]Chiu RW,Akolekar R,Zheng YW,et al.Non-invasive prenatal assessment of trisomy 21 by multiplexed maternal plasma DNA sequencing: large scale validity study[J].BMJ,2011,342:c7401.

[6]Bianchi DW,Platt LD,Goldberg JD,et al.Genome-wide fetal aneuploidy detection by maternal plasma DNA sequencing[J].Obstet Gynecol,2012,119:890-901.

[7]Bianchi DW,Parker RL,Wentworth J,et al.DNA sequencing versus standard prenatal aneuploidy screening[J].N Engl J Med,2014,370:799-808.

[8]Liao C,Yin AH,Peng CF,et al.Noninvasive prenatal diagnosis of common aneuploidies by semiconductor sequencing[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2014,111:7415-7420.

[9]Zhang H,Gao Y,Jiang F,et al.Non-invasive prenatal testing for trisomies 21,18 and 13: clinical experience from 146,958 pregnancies[J].Ultrasound Obstet Gynecol,2015,45:530-538.

[10]Bayindir B,Dehaspe L,Brison N,et al.Noninvasive prenatal testing using a novel analysis pipeline to screen for all autosomal fetal aneuploidies improves pregnancy management[J].Eur J Hum Genet,2015,23:1286-1293.

[11]Snyder HL,Curnow KJ,Bhatt S,et al.Follow-up of multiple aneuploidies and single monosomies detected by noninvasive prenatal testing: implications for management and counseling[J].Prenat Diagn,2016,36:203-239.

[12]Sparks AB,Struble CA,Wang ET,et al.Noninvasive prenatal detection and selective analysis of cell-free DNA obtained from maternal blood: evaluation for trisomy 21 and trisomy 18[J].Am J Obstet Gynecol,2012,206:319 e1-9.

[13]Norton ME,Brar H,Weiss J,et al.Non-Invasive Chromosomal Evaluation (NICE) Study: results of a multicenter prospective cohort study for detection of fetal trisomy 21 and trisomy 18[J].Am J Obstet Gynecol,2012,207:137 e1-8.

[14]Zimmermann B,Hill M,Gemelos G,et al.Noninvasive prenatal aneuploidy testing of chromosomes 13,18,21,X,and Y,using targeted sequencing of polymorphic loci[J].Prenat Diagn,2012,32:1233-1241.

[15]Hall MP,Hill M,Zimmermann B,et al.Non-invasive prenatal detection of trisomy 13 using a single nucleotide polymorphism-and informatics-based approach[J].PLoS One,2014,9:e96677.

[16]Nicolaides KH,Syngelaki A,Gil M,et al.Validation of targeted sequencing of single-nucleotide polymorphisms for non-invasive prenatal detection of aneuploidy of chromosomes 13,18,21,X,and Y[J].Prenat Diagn,2013,33:575-579.

[17]Chan KC,Zhang J,Hui AB,et al.Size distributions of maternal and fetal DNA in maternal plasma[J].Clin Chem,2004,50:88-92.

[18]Lo YM,Chan KC,Sun H,et al.Maternal plasma DNA sequencing reveals the genome-wide genetic and mutational profile of the fetus[J].Sci Transl Med,2010,2:841-849.

[19]Kim SK,Hannum G,Geis J,et al.Determination of fetal DNA fraction from the plasma of pregnant women using sequence read counts[J].Prenat Diagn,2015,35:810-815.

[20]Tong YK,Jin S,Chiu RW,et al.Noninvasive prenatal detection of trisomy 21 by an epigenetic-genetic chromosome-dosage approach[J].Clin Chem,2010,56:90-98.

[21]Nygren AO,Dean J,Jensen TJ,et al.Quantification of fetal DNA by use of methylation-based DNA discrimination[J].Clin Chem,2010,56:1627-1635.

[22]Lo YM,Tsui NB,Chiu RW,et al.Plasma placental RNA allelic ratio permits noninvasive prenatal chromosomal aneuploidy detection[J].Nat Med,2007,13:218-223.

[23]Lam KW,Jiang P,Liao GJ,et al.Noninvasive prenatal diagnosis of monogenic diseases by targeted massively parallel sequencing of maternal plasma: application to beta-thalassemia[J].Clin Chem,2012,58:1467-1475.

[24]Ge H,Huang X,Li X,et al.Noninvasive prenatal detection for pathogenic CNVs: the application in alpha-thalassemia[J].PLoS One,2013,8:e67464.

[25]Ma D,Ge H,Li X,et al.Haplotype-based approach for noninvasive prenatal diagnosis of congenital adrenal hyperplasia by maternal plasma DNA sequencing[J].Gene,2014,544:252-258.

[26]New MI,Tong YK,Yuen T,et al.Noninvasive prenatal diagnosis of congenital adrenal hyperplasia using cell-free fetal DNA in maternal plasma[J].J Clin Endocrinol Metab,2014,99:E1022-1030.

[27]Xu Y,Li X,Ge HJ,et al.Haplotype-based approach for noninvasive prenatal tests of Duchenne muscular dystrophy using cell-free fetal DNA in maternal plasma[J].Genet Med,2015,17:889-896.

[28]You Y,Sun Y,Li X,et al.Integration of targeted sequencing and NIPT into clinical practice in a Chinese family with maple syrup urine disease[J].Genet Med,2014,16:594-600.

[29]Meng M,Li X,Ge H,et al.Noninvasive prenatal testing for autosomal recessive conditions by maternal plasma sequencing in a case of congenital deafness[J].Genet Med,2014,16:972-976.

[30]Peters D,Chu T,Yatsenko SA,et al.Noninvasive prenatal diagnosis of a fetal microdeletion syndrome[J].N Engl J Med,2011,365:1847-1848.

[31]Chen S,Lau TK,Zhang C,et al.A method for noninvasive detection of fetal large deletions/duplications by low coverage massively parallel sequencing[J].Prenat Diagn,2013,33:584-590.

[32]Yu SC,Jiang P,Choy KW,et al.Noninvasive prenatal molecular karyotyping from maternal plasma[J].PLoS One,2013,8:e60968.

[33]Srinivasan A,Bianchi DW,Huang H,et al.Noninvasive detection of fetal subchromosome abnormalities via deep sequencing of maternal plasma[J].Am J Hum Genet,2013,92:167-176.

[34]Zhao C,Tynan J,Ehrich M,et al.Detection of fetal subchromosomal abnormalities by sequencing circulating cell-free DNA from maternal plasma[J].Clin Chem,2015,61:608-616.

[35]Yin AH,Peng CF,Zhao X,et al.Noninvasive detection of fetal subchromosomal abnormalities by semiconductor sequencing of maternal plasma DNA[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2015,112:14670-14675.

[36]Helgeson J,Wardrop J,Boomer T,et al.Clinical outcome of subchromosomal events detected by whole-genome noninvasive prenatal testing[J].Prenat Diagn,2015,35:999-1004.

[37]Wapner RJ,Babiarz JE,Levy B,et al.Expanding the scope of noninvasive prenatal testing: detection of fetal microdeletion syndromes[J].Am J Obstet Gynecol,2015,212:332 e1-9.

[38]Gross SJ,Stosic M,McDonald-McGinn DM,et al.Clinical experience with single-nucleotide polymorphism-based non-invasive prenatal screening for 22q11.2 deletion syndrome[J].Ultrasound Obstet Gynecol,2016,47:177-183.

[39]Fan HC,Gu W,Wang J,et al.Non-invasive prenatal measurement of the fetal genome[J].Nature,2012,487:320-324.

[40]Kitzman JO,Snyder MW,Ventura M,et al.Noninvasive whole-genome sequencing of a human fetus[J].Sci Transl Med,2012,4:137ra76.

[41]Chen S,Ge H,Wang X,et al.Haplotype-assisted accurate non-invasive fetal whole genome recovery through maternal plasma sequencing[J].Genome Med,2013,5:18.

[42]Papageorgiou EA,Patsalis PC.Maternal plasma sequencing: a powerful tool towards fetal whole genome recovery[J].BMC Med,2013,11:56.

[43]Lun FM,Chiu RW,Sun K,et al.Noninvasive prenatal methylomic analysis by genomewide bisulfite sequencing of maternal plasma DNA[J].Clin Chem,2013,59:1583-1594.

[44]Poon LL,Leung TN,Lau TK,et al.Presence of fetal RNA in maternal plasma[J].Clin Chem,2000,46:1832-1834.

[45]Tsui NB,Jiang P,Wong YF,et al.Maternal plasma RNA sequencing for genome-wide transcriptomic profiling and identification of pregnancy-associated transcripts[J].Clin Chem,2014,60:954-962.

[46]Koh W,Pan W,Gawad C,et al.Noninvasive in vivo monitoring of tissue-specific global gene expression in humans[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2014,111:7361-7366.

[47]Gil MM,Akolekar R,Quezada MS,et al.Analysis of cell-free DNA in maternal blood in screening for aneuploidies: meta-analysis[J].Fetal Diagn Ther,2014,35:156-173.

[48]Lau TK,Jiang F,Chan MK,et al.Non-invasive prenatal screening of fetal Down syndrome by maternal plasma DNA sequencing in twin pregnancies[J].J Matern Fetal Neonatal Med,2013,26:434-437.

[49]Huang X,Zheng J,Chen M,et al.Noninvasive prenatal testing of trisomies 21 and 18 by massively parallel sequencing of maternal plasma DNA in twin pregnancies[J].Prenat Diagn,2014,34:335-340.

[50]Canick JA,Kloza EM,Lambert-Messerlian GM,et al.DNA sequencing of maternal plasma to identify Down syndrome and other trisomies in multiple gestations[J].Prenat Diagn,2012,32:730-734.

[51]Sehnert AJ,Rhees B,Comstock D,et al.Optimal detection of fetal chromosomal abnormalities by massively parallel DNA sequencing of cell-free fetal DNA from maternal blood[J].Clin Chem,2011,57:1042-1049.

[52]Pan M,Li FT,Li Y,et al.Discordant results between fetal karyotyping and non-invasive prenatal testing by maternal plasma sequencing in a case of uniparental disomy 21 due to trisomic rescue[J].Prenat Diagn,2013,33:598-601.

[53]Gao Y,Stejskal D,Jiang F,et al.False-negative trisomy 18 non-invasive prenatal test result due to 48,XXX,+18 placental mosaicism[J].Ultrasound Obstet Gynecol,2014,43:477-478.

[54]Lau TK,Jiang FM,Stevenson RJ,et al.Secondary findings from non-invasive prenatal testing for common fetal aneuploidies by whole genome sequencing as a clinical service[J].Prenat Diagn,2013,33:602-608.

[55]Bianchi DW,Chudova D,Sehnert AJ,et al.Noninvasive Prenatal Testing and Incidental Detection of Occult Maternal Malignancies[J].JAMA,2015,314:162-169.

[56]Amant F,Verheecke M,Wlodarska I,et al.Presymptomatic identification of cancers in pregnant women during noninvasive prenatal testing[J].JAMA Oncol,2015,1:814-819.

[57]Benn P,Borrell A,Chiu RW,et al.Position statement from the chromosome abnormality screening committee on behalf of the board of the international society for prenatal diagnosis[J].Prenat Diagn,2015,35:725-734.

[58]Dondorp W,de Wert G,Bombard Y,et al.Non-invasive prenatal testing for aneuploidy and beyond: challenges of responsible innovation in prenatal screening.Summary and recommendations[J].Eur J Hum Genet,doi: 10.1038/ejhg.2015.56.[Epub ahead of print].

[59]Committee opinion No.640: Cell-free DNA screening for fetal aneuploidy[J].Obstet Gynecol,2015,126:e31-37.

[60]Jia Y,Zhao H,Shi D,et al.Genetic effects of a 13q31.1 microdeletion detected by noninvasive prenatal testing (NIPT)[J].Int J Clin Exp Pathol,2014,7:7003-7011.

[61]Vora NL,O'Brien BM.Noninvasive prenatal testing for microdeletion syndromes and expanded trisomies: proceed with caution[J].Obstet Gynecol,2014,123:1097-109.

[62]Rose NC,Benn P,Milunsky A.Current controversies in prenatal diagnosis 1: should NIPT routinely include microdeletions/microduplications?[J].Prenat Diagn,2016,36:10-14.

[63]Xie W,Tan Y,Li X,et al.Rapid detection of aneuploidies on a benchtop sequencing platform[J].Prenat Diagn,2013,33:232-237.

[64]Faas BH,de Ligt J,Janssen I,et al.Non-invasive prenatal diagnosis of fetal aneuploidies using massively parallel sequencing-by-ligation and evidence that cell-free fetal DNA in the maternal plasma originates from cytotrophoblastic cells[J].Expert Opin Biol Ther,2012,12 Suppl 1:S19-26.

[65]Yuan Y,Jiang F,Hua S,et al.Feasibility study of semiconductor sequencing for noninvasive prenatal detection of fetal aneuploidy[J].Clin Chem,2013,59:846-849.

[66]van den Oever JM,Balkassmi S,Verweij EJ,et al.Single molecule sequencing of free DNA from maternal plasma for noninvasive trisomy 21 detection[J].Clin Chem,2012,58:699-706.

[67]Cheng SH,Jiang P,Sun K,et al.Noninvasive prenatal testing by nanopore sequencing of maternal plasma DNA: feasibility assessment[J].Clin Chem,2015,61:1305-1306.

[68]Drmanac R,Peters BA,Church GM,et al.Accurate whole genome sequencing as the ultimate genetic test[J].Clin Chem,2015,61:305-306.

[69]Juneau K,Bogard PE,Huang S,et al.Microarray-based cell-free DNA analysis improves noninvasive prenatal testing[J].Fetal Diagn Ther,2014,36:282-286.

編輯：熊詩詣

10.13470/j.cnki.cjpd.2016.02.012

出生缺陷篩查工程實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目[JZF No.(2011) 861]

王威，E-mail：wangw@genomics.cn

R714.53

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2016-04-30)