遺傳性耳聾家系的產(chǎn)前診斷及遺傳咨詢

任淑敏　吳慶華　劉寧　亢鴻飛　白楠　孔祥東

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 遺傳與產(chǎn)前診斷中心，河南 鄭州 450052)

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遺傳性耳聾家系的產(chǎn)前診斷及遺傳咨詢

任淑敏吳慶華劉寧亢鴻飛白楠孔祥東

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 遺傳與產(chǎn)前診斷中心，河南 鄭州 450052)

目的對(duì)有明確耳聾致病基因的常染色體隱性耳聾家庭再次生育時(shí)行產(chǎn)前診斷，并給予相應(yīng)的臨床咨詢，降低生育風(fēng)險(xiǎn)。方法在知情同意的原則下，通過(guò)超聲引導(dǎo)下行介入性穿刺，對(duì)獲取的胎兒標(biāo)本DNA應(yīng)用STR位點(diǎn)檢測(cè)以排除母體基因組的污染，并采用Taqman探針?lè)ńY(jié)合Sanger測(cè)序進(jìn)行相關(guān)耳聾基因檢測(cè)。結(jié)果對(duì)59個(gè)家系胎兒進(jìn)行相關(guān)基因(GJB2、SLC26A4)檢測(cè)，16個(gè)家系的胎兒為與先證者一致的患兒，25個(gè)家系的胎兒為攜帶父母一方致病突變的攜帶者，18個(gè)家系的胎兒為無(wú)致病突變攜帶的正常胎兒。出生后聽(tīng)力評(píng)估、基因診斷結(jié)果與產(chǎn)前診斷結(jié)果相符。結(jié)論本研究中GJB2基因最常見(jiàn)的致病突變?yōu)閏.235delC，其次為c.299-300delAT。SLC26A4基因最常見(jiàn)致病突變?yōu)镮VS7-2A>G，其次為c.2168A>G(p.H723R)。應(yīng)用一代測(cè)序技術(shù)進(jìn)行耳聾基因產(chǎn)前診斷，能準(zhǔn)確診斷胎兒耳聾基因型，有效降低遺傳性耳聾患兒的出生率。

遺傳性耳聾；產(chǎn)前診斷；遺傳咨詢

耳聾是影響人類健康和生活質(zhì)量的重大疾病之一，在新生兒中的發(fā)生率達(dá)1‰～3‰。耳聾可由環(huán)境及遺傳因素作用導(dǎo)致，其中60%以上的耳聾與遺傳因素關(guān)系密切[1]。遺傳性耳聾具有高度的遺傳異質(zhì)性，包括綜合征性耳聾和非綜合征性耳聾，60%～70%的遺傳性耳聾患者除耳聾外，不伴有其他癥狀及體征，稱為非綜合征型耳聾(non-syndromic hearing impairment,NSHI)[2]。國(guó)內(nèi)過(guò)去十多年的流行病學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)，GJB2、SLC26A4、線粒體12SRNA基因有很高的發(fā)病率[3-5]，為中國(guó)遺傳性耳聾群體主要致病基因。本研究對(duì)有明確耳聾致病基因的常染色體隱性耳聾家庭再次生育時(shí)行產(chǎn)前診斷并給予遺傳咨詢，避免再次生育耳聾患兒。

1　資料與方法

1.1臨床資料收集自2011年7月至2015年12月來(lái)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院遺傳與產(chǎn)前診斷中心遺傳咨詢門(mén)診咨詢的有耳聾生育史59例家系，所有耳聾先證者均經(jīng)本院耳科診斷為耳聾，均在本中心對(duì)耳聾患者及其父母行相關(guān)耳聾基因檢測(cè)，確定為GJB2基因或SLC26A4基因突變型遺傳性耳聾，夫妻雙方為耳聾基因攜帶者或耳聾患者的家系，在知情同意的原則下，進(jìn)行耳聾基因產(chǎn)前診斷。

1.2方法

1.2.1產(chǎn)前診斷前家系成員基因檢測(cè)采集患者及其父母外周靜脈血，DNA提取后，分兩步基因檢測(cè)，第一步采用濟(jì)南英盛耳聾基因檢測(cè)試劑盒(熒光PCR-Taqman探針?lè)?檢測(cè)常見(jiàn)耳聾10個(gè)位點(diǎn)檢測(cè)(GJB2基因 c.176del16、c.235delC、c.299-300delAT、c.512-513insAACG; SLC26A4基因c.IVS7-2A>G、c.2168A>G、c.1229C>T、c.1174A>T; 線粒體DNA12SRNA1555A>G、1494A>T)，如果檢出兩個(gè)突變位點(diǎn)，直接測(cè)序驗(yàn)證，父母驗(yàn)證，如果檢出1個(gè)雜合位點(diǎn)，進(jìn)行相應(yīng)的基因外顯子及剪切區(qū)Sanger測(cè)序。

1.2.2介入性穿刺術(shù)18例孕11～14周胎兒，采用18G一次性GALLINI針行絨毛活檢術(shù)抽取胎盤(pán)絨毛10mg；41例孕16周后胎兒，采用22G一次性GALLINI針抽取羊水20ml。術(shù)后觀察胎心，孕婦術(shù)后在休息室休息半小時(shí)，無(wú)異常后離院。術(shù)后定期復(fù)診及隨訪。

1.2.3胎兒DNA提取、擴(kuò)增、測(cè)序采用OMEGA公司的DNA提取試劑盒提取絨毛、羊水DNA，并用紫外分光光度計(jì)測(cè)量DNA濃度和純度，DNA濃度為100～200ng/μl，純度OD260/280在1.7～2.0之間。將DNA加入反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

運(yùn)用PCR純化產(chǎn)物直接測(cè)序法對(duì)胎兒DNA進(jìn)行家系耳聾致病基因位點(diǎn)檢測(cè)，包括：GJB2 基因全編碼區(qū)DNA序列，SLC26A4基因部分外顯子序列。

1.2.4STR基因型檢測(cè)采用Promega公司的PowerPlex16試劑盒，在ABI3130測(cè)序儀上分別對(duì)相關(guān)家系的母親及胎兒的16個(gè)STR 位點(diǎn)(PentaE、D18S51、D21S11、TH01、D3S1358、FGA、TPOX、D8S1179、vWA、Amelogenin、Penta D、CSF1PO、D16S539、D7S820、D13S317、D5S818)進(jìn)行測(cè)定，然后利用GeneMapper軟件自動(dòng)分析等位基因的基因型。

1.2.5DNA測(cè)序與數(shù)據(jù)分析PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行SAP酶混合液純化后，再行CycleSequencing 反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物通過(guò)醋酸鈉-乙醇法進(jìn)行純化，并于ABI3130 DNA 全自動(dòng)測(cè)序儀上進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)(所有DNA 目的片段均需進(jìn)行正反雙向測(cè)序)。測(cè)序數(shù)據(jù)用sequenceing analysis軟件讀取，并用Genetool軟件將所測(cè)序列與NCBI中的基因標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)分析，記錄序列比對(duì)結(jié)果。

1.2.6隨訪對(duì)經(jīng)產(chǎn)前診斷后繼續(xù)妊娠的胎兒行分娩后聽(tīng)力篩查，同時(shí)采集新生兒足跟血提取DNA進(jìn)行基因診斷，以驗(yàn)證出生后新生兒聽(tīng)力篩查和基因診斷結(jié)果與產(chǎn)前診斷結(jié)果是否一致。

2　結(jié)果

2.1家系產(chǎn)前診斷前基因檢測(cè)本研究共對(duì)59家系患者做了耳聾基因檢測(cè)，33例為GJB2基因突變導(dǎo)致的耳聾，26例為SLC26A4基因突變導(dǎo)致的耳聾，同時(shí)檢測(cè)患者父母相應(yīng)基因突變追蹤基因突變均來(lái)源于父母，父母均為雜合突變攜帶者，符合常染色體隱性遺傳。

2.2STR基因型檢測(cè)將所有孕婦外周血DNA分別與對(duì)應(yīng)的胎兒DNA進(jìn)行STR位點(diǎn)檢測(cè)與分析，結(jié)果顯示所有胎兒與各自母親存在親生血緣關(guān)系，同時(shí)也排除了胎兒DNA受母體基因組DNA的污染。

2.3基因檢測(cè)結(jié)果運(yùn)用PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法對(duì)59個(gè)家系胎兒進(jìn)行相關(guān)基因(GJB2、SLC26A4)檢測(cè)，結(jié)果顯示：16個(gè)家系胎兒為與先證者一致的患兒(27.1%)，25個(gè)家系胎兒為攜帶父母一方致病突變的攜帶者(42.4%)，18個(gè)家系胎兒為無(wú)致病突變攜帶的正常胎兒(30.5%)(見(jiàn)表1)。

表1　59個(gè)家庭耳聾基因產(chǎn)前診斷結(jié)果(例)

2.4遺傳咨詢、妊娠結(jié)局與隨訪16個(gè)胎兒攜帶與先證者相同基因突變的孕婦夫婦經(jīng)遺傳咨詢，均選擇治療性引產(chǎn)，其他43個(gè)家庭選擇繼續(xù)妊娠，新生兒娩出后聽(tīng)力篩查及基因篩查均正常。

3　討論

在我國(guó)，遺傳性耳聾最常見(jiàn)致病基因主要為GJB2、SLC26A4、線粒體DNA12S rRNA、GJB3基因[6-8]。根據(jù)遺傳方式不同將遺傳性耳聾分為常染色體隱性遺傳常染色體顯性遺傳、線粒體遺傳和X連鎖遺傳、Y連鎖遺傳5類，目前約有130種耳聾致病基因被克隆[9]，其中以常染色體隱性遺傳性耳聾最多見(jiàn)，約占75%～80%。GJB2基因、SLC26A4基因?qū)е碌亩@為常染色體隱性遺傳，若夫婦為同一基因的突變攜帶者，那么將會(huì)有25%的幾率生育耳聾患兒，再次懷孕應(yīng)當(dāng)進(jìn)行產(chǎn)前診斷，線粒體D12SRNA基因是線粒體母系遺傳，女性攜帶者所生子代均為12SRNA基因突變攜帶者，再次生育不需進(jìn)行產(chǎn)前診斷，但孕期及胎兒出生后應(yīng)該避免使用氨基糖苷類抗生素，避免藥物性致聾。

GJB2基因突變是遺傳性耳聾最主要的致病基因，位于染色體13q11-12區(qū)域，該基因編碼的縫隙連接蛋白Connexin26(CX26)，是相鄰細(xì)胞間的特殊通道，在細(xì)胞間信息傳遞和物質(zhì)交換中起著重要作用[10-12]，東亞人群中以235delC突變最為常見(jiàn)。本研究56例耳聾家系中33例為GJB2基因突變導(dǎo)致的耳聾，且最常見(jiàn)的致病突變?yōu)?35delC，其次為299-300delAT。

SLC26A4基因又名PDS基因，定位于染色體7q21位點(diǎn)，有21個(gè)外顯子，編碼溶脂蛋白(Pendrin蛋白)，該蛋白在內(nèi)耳中表達(dá)于內(nèi)淋巴管、內(nèi)淋巴囊、橢圓囊、球囊、血管紋紡錘形細(xì)胞、耳蝸外溝和螺旋突起，異常的Pendrin蛋白失去正常的離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能，致使內(nèi)淋巴離子環(huán)境失衡，進(jìn)而導(dǎo)致耳聾，SLC26A4基因突變導(dǎo)致的耳聾可能出現(xiàn)雙側(cè)不對(duì)稱，病癥出現(xiàn)波動(dòng)或進(jìn)行性改變[13]。本研究群體中SLC26A4基因突變主要類型主要為IVS7-2A>G，其次為2168A>G(p.H723R)。

本研究對(duì)59個(gè)再生育的耳聾家庭進(jìn)行產(chǎn)前診斷，結(jié)果顯示16個(gè)家系胎兒為與先證者一致的患兒，家庭均選擇引產(chǎn)，避免了這些家庭再次生育耳聾患者，一定程度上減輕了耳聾家庭的負(fù)擔(dān)，其余43例胎兒為無(wú)突變或攜帶者，通過(guò)給予遺傳咨詢，夫婦保留胎兒，隨訪聽(tīng)力正常。從我院小樣本的產(chǎn)前診斷結(jié)果也可以看出，胎兒基因診斷結(jié)果與孟德?tīng)栠z傳規(guī)律預(yù)測(cè)概率相近。

目前常用的耳聾基因診斷的方法有DNA芯片法、Taqman探針?lè)?、基因測(cè)序方法和高通量測(cè)序方法。DNA芯片法敏感性好，但設(shè)備較昂貴，檢測(cè)位點(diǎn)較少，操作也較為復(fù)雜，成本相對(duì)較高；Taqman探針?lè)ê?jiǎn)單、敏感、位點(diǎn)多于DNA芯片法，但仍不能覆蓋所有基因突變位點(diǎn)；Sanger測(cè)序法位點(diǎn)覆蓋全面，是基因診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但操作及分析較復(fù)雜；高通量測(cè)序成本高，僅適合于罕見(jiàn)耳聾遺傳病的診斷。本研究我們采用Taqman探針結(jié)合Sanger測(cè)序結(jié)合的方法進(jìn)行患者基因診斷，先對(duì)常見(jiàn)位點(diǎn)采用Taqman探針?lè)ㄟM(jìn)行初篩，對(duì)于發(fā)現(xiàn)單個(gè)雜合突變的家系進(jìn)行基因全外顯子測(cè)序，對(duì)于臨床癥狀符合PDS，但未發(fā)現(xiàn)SLC26A4基因突變的家系也進(jìn)行了全測(cè)序，一定程度上減少了耳聾基因診斷的復(fù)雜程度，同時(shí)也保證了基因診斷的全面和準(zhǔn)確性。

目前遺傳性耳聾的產(chǎn)前診斷只能通過(guò)基因診斷，其他手段，如胎兒聽(tīng)力篩查、超聲篩查、酶學(xué)或蛋白質(zhì)篩查均不能進(jìn)行耳聾產(chǎn)前診斷。為保證耳聾產(chǎn)前診斷的可靠性，耳聾基因診斷及產(chǎn)前咨詢應(yīng)當(dāng)注意以下事項(xiàng)：①耳聾家系必須明確是已知基因突變的遺傳性耳聾家系，才能進(jìn)行產(chǎn)前診斷，因?yàn)槎@具有較強(qiáng)的遺傳異質(zhì)性，有些耳聾并非遺傳性的，有些耳聾是線粒體DNA突變，這些是不能或不需要做產(chǎn)前診斷的，因此必須進(jìn)行耳聾患者基因診斷，明確有致病基因突變后才能做產(chǎn)前診斷；②若是常染色體隱性遺傳性耳聾，必須為同一個(gè)基因純合或2個(gè)復(fù)合突變位點(diǎn)，而且必須對(duì)患者的父母進(jìn)行突變追蹤，證實(shí)位點(diǎn)來(lái)自雙親，而非來(lái)自同一個(gè)親代，且所檢出的突變位點(diǎn)為已有致病報(bào)道，非多態(tài)性位點(diǎn)；③如產(chǎn)前診斷為胎兒正常，告知胎兒父母僅能排除家族中所攜帶特定耳聾致病基因突變所致的耳聾，應(yīng)囑胎兒父母出生后進(jìn)行新生兒聽(tīng)力篩查，因?yàn)榧s有40%的耳聾為非遺傳因素所致；④對(duì)于雜合攜帶者胎兒，囑其父母可以繼續(xù)妊娠，但長(zhǎng)大成人結(jié)婚后，應(yīng)告知需進(jìn)行配偶的相關(guān)耳聾致病基因篩查，避免配偶也為同一基因雜合突變攜帶者所帶來(lái)的生育風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，耳聾是一種嚴(yán)重影響人類生活質(zhì)量的常見(jiàn)先天性缺陷疾病，通過(guò)對(duì)孕期婦女進(jìn)行相關(guān)遺傳性耳聾基因檢測(cè)，對(duì)其進(jìn)行遺傳咨詢和生育指導(dǎo)，避免耳聾家系再次生育耳聾患兒，降低耳聾殘疾兒的出生率，有著重要的臨床意義。

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編輯：宋文穎

ObjectivePrenatal diagnosis were performed in 59 families with autosomal recessive inheritance hearing loss,give them clinical consultation,reduce the risk of deafness birth.MethodObtain the fetus specimens through interventional biopsy guided by ultrasound,test fetus’ realtive deafness gene with Sanger sequencing in combination with short tandem repeat(STR) test to eliminate maternal blood pollution.ResultsIn 59 family cases,16 cases were consistent with the results of proband,25 cases were found heterozygous mutations,18 cases were found no muation.The hearing evaluation results were consistent with the results of prenatal diagnosis.ConclusionsThe most common pathogenic mutation of GJB2 is c.235delC,the second is c.299-300delAT,the most common pathogenic mutation of SLC26A4 is c.IVS7-2A>G ,the second is c.2168A>G(p.H723R).Application of deafness genes test with Sanger sequencing in prenatal diagnosis can accurately diagnose fetus’ genotype,effectively reduce the birth rate of deafness child .

hereditary deafness；prenatal diagnosis；genetic counseling

10.13470/j.cnki.cjpd.2016.02.008

孔祥東，E-mail：kongxd@263.net

R714.55

A

2016-04-27)