確定血紅蛋白A2篩查α地中海貧血臨界值的方法探討

駱明勇　王雄虎　郭浩　王繼成　袁騰龍　張艷霞　王奕霞　梁駒卿

(1.廣東省婦幼保健院，廣東 廣州　511442；2.廣東省婦幼代謝與遺傳病重點實驗室，廣東 廣州　511442)

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·論著·

確定血紅蛋白A2篩查α地中海貧血臨界值的方法探討

駱明勇1,2王雄虎1郭浩1,2王繼成1,2袁騰龍1,2張艷霞1,2王奕霞1,2梁駒卿1,2

(1.廣東省婦幼保健院，廣東 廣州511442；2.廣東省婦幼代謝與遺傳病重點實驗室，廣東 廣州511442)

目的探討實驗室自己建立血紅蛋白A2篩查α地中海貧血臨界值的方法。方法分析本實驗室近2年進行地貧篩查和地貧基因診斷的14 502例標本數(shù)據(jù)，將其分為α地貧組、非靜止型α地貧組和正常對照組。以HbA2不同的臨界值分別計算篩查α地貧和非靜止型α地貧的敏感度、特異度、陰性似然比和陽性似然比，再分別繪制HbA2篩查α地貧和非靜止型α地貧的受試者工作曲線。結果14 502例標本中2938例基因檢測確診為α地貧，其中靜止型α地貧1129例，11 564例地貧基因檢測為陰性；正常對照組的HbA2結果為(2.62±0.28)%，α地貧組的HbA2結果為(2.40±0.30)%，非靜止型的α地貧組HbA2結果為(2.30±0.26)%。得到了不同HbA2臨界值篩查α地貧和非靜止型α地貧的性能，并獲得了本實驗室HbA2篩查α地貧的最佳篩查臨界值為<2.7%。結論HbA2對非靜止型α地貧有較好的篩查性能；各實驗室應結合臨床需求和自身實際情況建立自己的HbA2篩查α地貧的臨界值；本研究的思路和方法可供其他實驗室借鑒，可降低α地貧的漏篩率。

地中海貧血；血紅蛋白A2；受試者工作曲線；地貧篩查

地中海貧血(地貧)是一組由于珠蛋白基因缺陷導致的遺傳性溶血性貧血。根據(jù)珠蛋白肽鏈受損類別的不同，主要分為α地貧與β地貧兩大類。全球范圍中東南亞各國、印度次大陸、地中海沿岸、中東、北非和太平洋地區(qū)都是該病高發(fā)區(qū)[1]。我國南方長江以南各省區(qū)多見，尤以廣西、廣東和海南三省區(qū)最為嚴重，以α地貧為主[1,2]。中重型地貧嚴重的可致死致殘，目前尚無有效的治療方法。有效開展婚前、孕前以及產前地貧基因檢測，對防止中重型地貧患兒出生具有重要意義。

目前，地中海貧血實驗室診斷方法是先分析紅細胞參數(shù)，主要包括平均紅細胞體積(mean corpuscular volume,MCV)、平均紅細胞血紅蛋白含量(mean corpuscular hemoglobin,MCH)等；再進行血紅蛋白組分分析，主要包括HbA、HbA2和HbF等的相對定量；然后根據(jù)上述的篩查結果對可疑人群進行基因檢測，可根據(jù)HbA2升高或降低初步分型進行α地貧或(和)β地貧基因檢測[1,3]。如HbA2減低則可疑為α地貧，由于HbA2正常情況下相對含量較低，所以其減低的范圍較窄且靜止型α地貧篩查指標大部分正常等原因，造成血紅蛋白組分篩查α地貧的性能遠遠低于β地貧，而α地貧在本地區(qū)占大多數(shù)，極易造成α地貧的漏篩，HbA2減低的篩查臨界值的制定是其篩查性能的關鍵。另外，目前進行血紅蛋白組分分析的方法有多種，包括瓊脂糖電泳、毛細管電泳和高效液相色譜等，且各種儀器方法影響因素較多，尚無法制定一個統(tǒng)一的篩查正常參考值范圍，各實驗室應根據(jù)自己實際情況建立合適的篩查臨界值。本研究擬根據(jù)本實驗室的數(shù)據(jù)，對血紅蛋白A2篩查α地中海貧血臨界值確定的方法進行探討。

1　資料與方法

1.1基本資料選擇2014年1月至2015年12月到廣東省婦幼保健院就診進行地貧篩查和地貧基因診斷的受檢者14 502例，年齡3～60歲。其中2938例經基因檢測確診為α地貧攜帶者(包括靜止型α地貧1129例、標準型α地貧1790例、血紅蛋白H病19例)，所有的α地貧攜帶者都排除了α地貧復合β地貧及異常血紅蛋白等情況；2938例α地貧攜帶者為α地貧組，將其中的1129例靜止型α地貧去掉后剩下的1809例α地貧為非靜止型α地貧組；11 564例基因檢測結果陰性為正常對照組。

2　方法

2.1標本采集及檢測采集受檢者外周靜脈血2ml，采用ACD抗凝，送到廣東省婦幼保健院醫(yī)學遺傳中心實驗室同時進行血紅蛋白組分分析和地貧基因檢測。

采用CAPILLARYS 2 FLEX PIERCING全自動毛細管電泳儀及配套CAPILLARYS HEMOGLOBIN(E)試劑盒(法國SEBIA公司)進行Hb組分分析，實驗操作嚴格按照儀器及試劑盒說明書進行。

采用地中海貧血基因檢測試劑盒(深圳亞能生物)進行地貧基因檢測，檢測范圍包括：采用跨越斷裂點的PCR技術(gap-PCR)檢測缺失型α地貧，采用PCR-反向點雜交法(PCR-RDB)檢測非缺失型α地貧和β地貧。實驗操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

2.2分析方法分析3組受檢者的HbA2值和地貧基因檢測結果，以HbA2不同的臨界值分別計算篩查α地貧和非靜止型α組地貧的敏感度、特異度、陰性似然比和陽性似然比，再分別繪制受試者工作曲線(receiver operator characteristic curve,ROC)。

2.3統(tǒng)計學處理采用Excel 2007和SPSS16.0對數(shù)據(jù)進行記錄、處理、分析。

2　結果

2.1HbA2檢測結果11 564例正常對照組的HbA2結果為(2.62±0.28)%；α地貧組的HbA2結果為(2.40±0.30)%，其中靜止型的α地貧HbA2結果為(2.56±0.28)%；非靜止型的α地貧組HbA2結果為(2.30±0.26)%。

2.2地貧基因檢測結果14 502例樣本的地貧基因檢測結果：11 564例基因檢測結果為陰性，2938例檢測結果為α地貧。2938例α地貧包括靜止型α地貧1129例、標準型α地貧1790例、血紅蛋白H病19例。1129例靜止型α地貧中：3.7雜合缺失671例，4.2雜合缺失260例，Constant Spring(CS)雜合突變21例，Quong Sze(QS)雜合突變61例，Westmead(WS)雜合突變116例。1790例標準型α地貧中：東南亞缺失1762例，其他純合或雙重雜合突變的標準型α地貧28例。

2.3HbA2與α地貧分析結果根據(jù)α地貧基因檢測結果，按不同的HbA2臨界值統(tǒng)計獲得HbA2分別篩查α地貧和非靜止型的α地貧的靈敏度、特異度、陰性似然比和陽性似然比，見表1。

表1　不同HbA2臨界值篩查α地貧和非靜止型α地貧的性能

2.4HbA2篩查α地貧的ROC曲線根據(jù)不同的HbA2臨界值篩查α地貧和非靜止型α地貧的靈敏度和特異度，分別繪制ROC曲線(圖1)。HbA2篩查α地貧ROC曲線下面積為0.707，說明有一定的篩查準確度；HbA2篩查非靜止型α地貧ROC曲線下面積為0.802，說明HbA2篩查非靜止型α地貧的性能明顯提高。結合本實驗室和臨床的需求，為了盡量避免α地貧的漏篩，盡量提高其篩查靈敏度而保證一定的特異度，我們未選擇最靠近坐標圖左上方的點，而選擇將HbA2篩查α地貧臨界值定為<2.7%，其非靜止型α地貧靈敏度為92.0%，特異度為44.8%，陽性似然比為1.667，陰性似然比為0.179。

圖1　HbA2篩查α地貧和非靜止型α地貧ROC曲線

A.HbA2篩查α地貧的ROC曲線；B.HbA2篩查非靜止型α地貧的ROC曲線

3　討論

本研究分析了本實驗室近兩年的地貧篩查和基因檢測數(shù)據(jù)，并將靜止型α地貧與其他類型α地貧區(qū)分開，分別采用繪制HbA2篩查α地貧和非靜止型α地貧的ROC曲線的方法，得到了不同HbA2臨界值篩查α地貧和非靜止型α地貧的性能。如果將靜止型α地貧分開進行分析，HbA2對非靜止型α地貧有較好的篩查性能；并獲得了本實驗室HbA2篩查α地貧的最佳篩查臨界值。為各實驗室結合自身實際情況建立自己的α地貧篩查臨界值提供了借鑒作用，可大大降低α地貧的漏篩率。

地貧的重要特征是小細胞低色素貧血，另外還有HbA2相對含量的改變。采用紅細胞相關指數(shù)和血紅蛋白組分分析是對人群進行地貧篩查的主要技術手段。地貧實驗室檢測的通用流程即是先進行紅細胞指數(shù)的初篩，再進行血紅蛋白組分分析，最后對可疑者進行基因檢測進行確診。HbA2相對含量檢測在地貧篩查中具有重要作用，是受檢者表型特征之一，也是指導下一步基因診斷的依據(jù)。由于靜止型α地貧大部分無血液學表型的變化，所以采用上述的篩查流程可能無法發(fā)現(xiàn)靜止型α地貧，這也是造成HbA2篩查α地貧的性能遠遠比篩查β地貧低的主要原因之一，近年也有相關文獻報道[4]。靜止型α地貧無法避免被漏篩，可直接通過基因檢測確診[1]，它的漏診最嚴重的可導致血紅蛋白H病而不會導致巴氏水腫胎患兒的出生，可通過夫婦雙方聯(lián)合篩查避免血紅蛋白H病患兒的出生。之前關于HbA2篩查α地貧的性能評價和臨界值的報道都未將靜止型α地貧區(qū)別處理[4]。而本研究將靜止型α地貧與其他類型α地貧區(qū)分開，更加客觀地評價了HbA2篩查α地貧的性能，更加準確地獲得了篩查臨界值。通過繪制ROC曲線獲得最佳篩查臨界值已廣泛應用于臨床檢測，一般都選取ROC曲線越靠近左上角的值作為最佳臨檢值，其假陽性和假陰性的總數(shù)最少。但通過本實驗室數(shù)據(jù)分析，我們認為靠近左上角的點的篩查靈敏度還達不到臨床和地貧人群篩查的實際需求，可能會造成大量α地貧漏篩而造成嚴重后果，我們認為地貧篩查應盡量提高篩查靈敏度而保證一定的特異度，再結合實際情況和臨床需求選擇一個合適的HbA2篩查臨界值。所以本實驗室選擇將HbA2篩查α地貧臨界值定為<2.7%。

另外，HbA2篩查地貧的臨界值受儀器、方法等諸多因素影響，尚難制定統(tǒng)一的正常參考值。目前，很多實驗室并未建立本實驗室的正常參考值，而采用設備廠家或其他實驗室的正常參考值。如本實驗室使用的是CAPILLARYS 2 FLEX PIERCING全自動毛細管電泳儀，目前使用該儀器的大部分實驗室采用的臨界值都是2.5%～3.5%。從我們回顧分析的數(shù)據(jù)中可以看出，如本實驗室采用2.5%為α地貧的篩查臨界值，其對非靜止型α地貧的篩查靈敏度為72.2%，特異度為76.1%，將漏篩大量的α地貧特別是東南亞型α地貧，可能在臨床造成嚴重的后果。所以，各實驗室應該重視此問題，根據(jù)自身實際情況建立自己的HbA2篩查臨界值。2014年國家衛(wèi)生計生委婦幼司在我國地貧高發(fā)省份實施地中海貧血防控試點項目，同時頒布了地貧防控試點項目技術服務規(guī)范，該規(guī)范明確指出各實驗室在實施該技術服務規(guī)范時應建立本實驗室的HbA2正常參考值[5]。

近年來，地中海貧血的防控工作得到了各級政府的高度重視，在廣東、廣西和海南等省區(qū)都正在實施政府為主導的地貧防控項目[6]。項目實施中的實驗室檢測能力建設及質量控制環(huán)節(jié)十分重要，地貧復篩血紅蛋白組分分析的問題應被重視，這樣才能降低α地貧特別是α0地貧的漏篩率。本研究建立的HbA2篩查α地貧的臨界值不一定適用于其他實驗室，但本研究的思路和方法可供其他實驗室借鑒。

[1]徐湘民.地中海貧血預防控制操作指南[M].北京：人民軍醫(yī)出版社，2011，2-6，13-33.

[2]Yin A,Li B,Luo M,et al.The prevalence and molecular spectrum of α-and β-globin gene mutations in 14,332 families of Guangdong Province,China[J].PLoS One.2014,9(2):e89855.

[3]李亞紅,梁玉全,岑妙珍,等.地中海貧血基因攜帶者產前篩查及實驗室指標的評價[J].國際檢驗醫(yī)學雜志,2007,28(8): 673-680.

[4]湯麗霞，楊光，曾勁偉,等.用ROC曲線確定Hb-A2在地貧診斷中的界值[J].現(xiàn)代預防醫(yī)學,2004,31(3): 353-355.

[5]國家衛(wèi)生計生委婦幼司.地中海貧血防控試點項目技術服務規(guī)范(試行)[Z].2014-10-5.

[6]張小莊，馮占春，葉寧.地中海貧血的預防控制 [M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2014，11-24.

編輯：宋文穎

ObjectiveTo study the method of determining the HbA2critical value of screening alpha thalassemia.MethodTo analyze our laboratory 14 502 samples data of thalassemia screening and genetic diagnosis in recent 2 years,which can be divided into alpha thalassemia group,non silent alpha thalassemia group and normal group.The sensitivity,specificity,negative likelihood ratio and positive likelihood ratio of screening alpha thalassemia and non silent alpha thalassemia based on different HbA2critical value were calculated.Then the ROC of screening alpha thalassemia and non silent alpha thalassemia by HbA2were drawn.Results2938 samples were diagnosed as alpha thalassemia including 1129 silent alpha thalassemia,and 11564 samples were negative in 14 502 samples.The HbA2results of normal group were (2.62±0.28)%,the HbA2results of alpha thalassemia group were (2.40±0.30)%,and the HbA2results of non silent alpha thalassemia group were (2.30±0.26)%.The performance for screening alpha thalassemia and non silent alpha thalassemia based on different HbA2critical value were evaluated.The optimal critical value of screening alpha thalassemia by HbA2in our laboratory was determined <2.7%.ConclusionsThe performance for screening non silent alpha thalassemia by HbA2is better.Each laboratory should establish its own HbA2critical value of screening alpha thalassemia according to the clinical needs and the actual situation of their own.The ideas and methods of this research can be used for reference in other laboratories.And the missed rate of screening alpha thalassemia can be reduced.

thalassemia；HbA2；ROC；thalassemia screening

10.13470/j.cnki.cjpd.2016.02.001

廣東省省級科技計劃項目(2013B022000019和2014A020212246)；廣東省醫(yī)學科學技術研究基金(A2014094)

R714.55

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2016-05-12)