清喉利咽顆粒聯合養(yǎng)陰清肺糖漿止咳作用機制研究*

劉 偉郭思佳郝正華封繼宏孫增濤△（.天津中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，天津 30093；.天津中醫(yī)藥大學研究生院，天津 30093）

·研究報告·

清喉利咽顆粒聯合養(yǎng)陰清肺糖漿止咳作用機制研究*

劉 偉1郭思佳1郝正華2封繼宏1孫增濤1△
（1.天津中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學研究生院，天津 300193）

目的 探討清喉利咽顆粒聯合養(yǎng)陰清肺糖漿的止咳作用機制。方法 將實驗SD大鼠隨機等分為6組，即對照組、模型組、甘草合劑組、養(yǎng)陰清肺糖漿組、清喉利咽顆粒組、聯合組，除對照組外均造感染后咳嗽模型，造模成功后給予相應藥物灌胃，空白組給予等體積0.9%氯化鈉注射液灌胃。檢測相關指標：通過氨水誘咳測大鼠咳嗽潛伏時間和3 min內咳嗽次數；通過HE染色法觀察肺組織病理改變；收集支氣管肺泡灌洗液（BALF），采用ELISA法檢測BALF中細胞因子［白介素-4（IL-4）、白介素-8（IL-8）、腫瘤壞死因子-α （TNF-α）］、神經肽P物質（SP）及降鈣素基因相關肽（CGRP）的含量。結果 甘草合劑組、養(yǎng)陰清肺糖漿組、清喉利咽顆粒組以及聯合組大鼠咳嗽次數均明顯減少，BALF中SP，CGRP，IL-4，IL-8，TNF-α水平顯著降低（P＜0.05），其作用效果由高到低依次是：養(yǎng)陰清肺糖漿聯合清喉利咽顆粒、清喉利咽顆粒、養(yǎng)陰肺糖漿、甘草合劑。結論 養(yǎng)陰清肺糖漿聯合清喉利咽顆粒能夠明顯抑制感染后咳嗽，其機制與減輕肺組織局部炎癥反應有關。

感染后咳嗽 清喉利咽顆粒 養(yǎng)陰清肺糖漿

【Abstract】Objective：To study the mechanism of the effects of Qinghou Liyan granules with Yangyin Qingfei syrup on relieving a cough.Methods：Experimental SD rats were randomly divided into 6 groups，the control group，the model group，Gancao group，Yangyin Qingfei group，Qinghou Liyan group，and the combination group.All the other groups，except the control group，were made cough infection model.After the model was successfully made，the corresponding drugs were administered to the stomach.The control group was given equal volume of normal saline，once per day for 15 days.The following indicators were detected：Ammonia induced cough latent period and cough within 3 minutes，by HE staining to observe the lung pathological changes，collecting bronchoalveolar lavage fluid（BALF），ELISA method to detect in the BALF cell factor（IL-4，IL-8，TNF-α），neuropeptide substance P（SP）and Calcitonin gene-related peptide（CGRP）.Results：Gancao group，Yangyin Qingfei group，Qinghou Liyan group，the combination group can reduce cough times in rats.They can reduce the levels of SP，CGRP，IL-4，IL-8，TNF-αin the BALF.Its effect from high to low in turn is Qinhou Liyan granules with Yangyin Qingfei syrup，Qinghou Liyan granules，Yangyin Qingfei syrup，Gancao syrup.Conclusion：Yangyin Qingfei syrup and Qinghou Liyan granules can relieve cough caused by infection.The mechanism is related to the reduction of local inflammatory response in lung tissue.

【Key words】Post-infectious cough；Qinghou Liyan granules；Yangyin Qingfei syrup

清喉利咽顆粒來源于清代宮廷秘方 “寬膈利咽代茶飲”，原為御用清喉利咽之上品。養(yǎng)陰清肺糖漿是由治喉名方養(yǎng)陰清肺湯化裁而來，記載于清代名醫(yī)鄭梅澗的喉科專著《重樓玉鑰》中。兩中成藥均為臨床常用藥，在治療呼吸系統(tǒng)疾病上均有良好的療效，經過多年的臨床實踐發(fā)現兩藥聯合應用對于感染后咳嗽效果顯著，且優(yōu)于單獨使用其中一種，然而其作用機制不明，本研究旨在初步兩藥聯合應用的止咳作用及其機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康清潔級雄性SD大鼠60只，6周齡，購自天津中醫(yī)藥大學動物房，體質量（150±20）g。清潔級飼養(yǎng)，室內溫度保持在18～22℃，相對濕度50% ～70%，光照時間固定，每日照明時間為8∶00～20∶00。水、食物自由攝取。購入后適應性飼養(yǎng)1周進行實驗。

1.2 試藥與儀器 養(yǎng)陰清肺糖漿，由天津中新藥業(yè)集團股份有限公司樂仁堂制藥廠提供。清喉利咽顆粒，由天津中新藥業(yè)集團股份有限公司樂仁堂制藥廠提供；甘草合劑糖漿（100 mL/瓶，馬應龍藥業(yè)集團股份有限公司，批號140202）；大前門牌香煙（上海煙草集團公司出品）；辣椒素（北京邦頓特有限公司）；內毒素（25 mg/瓶，Sigma公司）；白介素-4（IL-4）、白介素-8 （IL-8）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、SP、CGRP酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（Abcam公司）；電子天平（佛山順德拓普域電子有限公司）；YLS-8A型多功能誘咳引喘儀（濟南益延科技發(fā)展有限公司）。

1.3 分組及造模 將60只SD大鼠隨機分為6組，即：對照組、模型組、甘草合劑組、清喉利咽組、養(yǎng)陰清肺組、清喉利咽聯合養(yǎng)陰清肺組（聯合組），每組10只。造模方法操作如下［1］：除對照組以外，其余各組大鼠均于特制的面積為0.5 m3的染毒箱內進行香煙煙霧暴露，每次10支香煙，每日1次，持續(xù)30 min，連續(xù)10 d，食水自由［2］。第11、14、17日用乙醚淺麻醉各熏煙組大鼠后，鼻腔滴入質量濃度為0.4 mg/mL的LPS溶液，滴入量以體質量1 μL/g計算，第12、13、15、16、18日，將該5組大鼠置于透明密閉容器中以1×10-4mol/L的辣椒素溶液霧化吸入激發(fā)，每次3 min，每日1次，每日觀察各組大鼠狀態(tài)，并于第19日開始對各組大鼠灌胃相應藥物。對照組及模型組給予等體積0.9%氯化鈉注射液；甘草合劑組予相應藥物3.16 mL/kg；養(yǎng)陰清肺糖漿組予相應藥物4.1 g生藥/kg；清喉利咽顆粒組與相應藥物4.1 g生藥/kg；聯合組予4.1 g生藥/kg（按養(yǎng)陰清肺糖漿：清喉利咽顆粒質量比1∶1混合）。各組均給藥每日1次，連續(xù)給藥15 d于最后1次灌胃后24 h誘導各組大鼠咳嗽后處死各組大鼠測定相關指標。

1.4 標本采集與檢測 1）大鼠咳嗽潛伏期和咳嗽次數測定：分別將大鼠放入YLS-8A型多功能誘咳引喘儀中，噴入27%氨水3 s，刺激大鼠咳嗽，自動記錄各組大鼠咳嗽潛伏時間及3 min內咳嗽次數。2）支氣管肺泡灌洗液中指標檢測：將大鼠平放于手術臺上將氣管連同心肺游離出置于臺上，用血管夾夾閉右主支氣管，將頂端鈍圓有孔的特制硅膠管插入氣管，手術線結扎固定、左側肺給予預溫37℃的0.9%氯化鈉注射液行支氣管肺泡灌洗，反復抽推3次，留置1 min后回抽BALF并收集，重復3次，每次2 mL，每次回收液體置于冰塊上，經過2層無菌紗布過濾于無菌離心管，回收計量 （回收率約75%）。1500 r/min低溫離心l0 min，BALF上清保存在-80℃冰箱中，ELISA法檢測IL-4、IL-8、TNF-α、SP及CGRP的含量。3）肺組織病理學觀察：支氣管肺泡灌洗完成后，迅速取下各組大鼠右肺，并取出右上葉修剪成0.5 cm厚的塊狀，置于4%多聚甲醛固定6 h，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，觀察大體組織病變和炎癥細胞浸潤情況。

1.5 統(tǒng)計學處理 應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析。計量資料以（±s）表示。多個樣本均數比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠咳嗽次數比較 見表1。與對照組比較，其余各組咳嗽次數均增多（P＜0.05）；與模型組比較其余各組咳嗽次數均減少 （P＜0.05）；與甘草合劑組比較，養(yǎng)陰清肺糖漿組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），清喉利咽顆粒組、聯合組咳嗽次數均減少（P＜0.05）；與養(yǎng)陰清肺糖漿組比較，清喉利咽顆粒組、聯合組咳嗽次數均減少；與清喉利咽顆粒組比較，聯合組咳嗽次數較減少（P＜0.05）。

表1 各組BALF中SP、CGRP、IL-4、IL-8、TNF-α含量比較（±s）

表1 各組BALF中SP、CGRP、IL-4、IL-8、TNF-α含量比較（±s）

與模型組組比較，#P＜0.05；與對照組比較，*P＜0.05；與甘草合劑組比較，△P＜0.05；與養(yǎng)陰清肺糖漿組比較，▲P＜0.05；與清喉利咽顆粒組比較，●P＜0.05。

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2.2 各組大鼠肺組織病理HE染色切片結果 見圖1。對照組支氣管和肺泡結構清晰，支氣管上皮無脫落壞死，結構完整，氣道黏膜上皮纖毛排列整齊，肺泡大小均勻，支氣管、小血管周圍無明顯的炎細胞浸潤。模型組可見支氣管黏膜脫落，肺泡壁塌陷，肺泡腔不規(guī)則擴大，部分形成肺大泡，氣道管壁周圍及肺間質有炎細胞浸潤，支氣管黏膜皺璧增多，黏液增多。與模型組比較，甘草合劑組支氣管管腔增厚，管腔伴黏液栓形成和平滑肌增厚、纖維組織增生不明顯；周圍肺組織伴較多炎勝細胞浸潤較少。與甘草合劑組比較，聯合組炎癥細胞浸潤及黏液分泌最輕，其次為清喉利咽顆粒組與養(yǎng)陰清肺組。

2.3 各組大鼠支氣管肺泡灌洗液指標水平比較 見表1。與對照組比較，模型組、甘草合劑組、養(yǎng)陰糖漿組和清喉利咽組SP、CGRP、IL-4、IL-8、TNF-α均增高（P＜0.05）；與模型組比較，甘草合劑組、養(yǎng)陰糖漿組、清喉利咽組及聯合組均降低（P＜0.05）；與甘草合劑組比較，養(yǎng)陰糖漿組、清喉利咽組及聯合組水平均降低（P＜0.05）；與養(yǎng)陰清肺糖漿組比較，清喉利咽組及聯合組水平均降低（P＜0.05）；與清喉利咽組比較，聯合組具有顯著差異（P＜0.05）?？傊?，甘草合劑、養(yǎng)陰清肺糖漿、清喉利咽顆粒及養(yǎng)陰清肺糖漿聯合清喉利咽顆粒均能降低肺泡灌洗液中SP，CGRP，IL-4，IL-8，TNF-α的含量，其作用效果由高到低依次是：養(yǎng)陰清肺糖漿聯合清喉利咽顆粒、清喉利咽顆粒、養(yǎng)陰清肺糖漿、甘草合劑。

圖1 各組大鼠肺組織切片（HE染色，40倍）

3 討 論

3.1 造模方法的選擇 目前可用于建立咳嗽模型的動物眾多，主要有兔、貓、犬、豬、豚鼠、大鼠、小鼠等［2］。本研究選用大鼠為實驗動物，生命周期短而繁殖數量大，飼養(yǎng)、繁殖及藥物使用的成本較低，在動物實驗中使用較為普遍，宜用于大批量篩選實驗?？人缘脑炷ＴO計中，目前有機械刺激、化學刺激、電刺激及各類炎癥介質介導等方法［3］。本實驗選用煙霧吸入加化學刺激的方法，避免了機械刺激法只能在麻醉狀態(tài)下進行且強度不能控制，無法定量的缺點［4］，是比較常用的方法，簡便易行，耗藥量少，易于掌握。有文獻表明，革蘭氏陰性菌是呼吸道感染中主要的致病菌之一，LPS是決定革蘭氏陰性菌致病力的關鍵毒素［5］。李飛俠等研究表明，不同濃度的LPS滴鼻均能引起大鼠氣道反應性增高，咳嗽反應性增強，但濃度為0.2 mg/mL、0.4 mg/mL的LPS引起的該反應可更顯著地體現氣道炎癥改變，而肺實質則無明顯炎癥表現［6］。此外，本研究制作的感染性大鼠咳嗽模型，對辣椒素刺激敏感，咳嗽反應性均較空白組明顯增高，為進一步研究細菌感染引起咳嗽的發(fā)病機制和治療提供了研究基礎和有效手段。

3.2 方藥聯合應用 養(yǎng)陰清肺糖漿由生地黃、麥冬、玄參、川貝母等藥物組成，針對肺陰虧耗引起的內傷咳嗽，尤其是治療伴有咽喉干燥疼痛、少痰或無痰的咳嗽效果較好［7］。方中重用生地黃甘寒入腎，滋陰壯水為君藥，玄參滋陰降火，解毒利咽；麥冬養(yǎng)陰清肺共為臣藥，佐以川貝母、甘草滋陰潤肺止咳，白芍、牡丹皮清熱涼血，薄荷疏風清熱利咽，諸藥共奏滋陰清熱、潤肺止咳、清熱利咽之功，此方補虛為主，邪正兼顧，養(yǎng)肺胃之陰以扶其正；涼血解毒，散邪利咽以祛其邪。

清喉利咽顆粒由黃菩、西青果、梧梗、竹茹、胖大海等藥物組成，主要用于急慢性咽炎扁桃體炎，咽喉發(fā)干，聲音嘶啞及咽部異物感等癥狀，有保護聲帶的作用［7］。其中黃芩、西青果等7種清熱藥物可清熱解毒，祛邪利咽；枳殼、香附等6種理氣藥物可理氣化痰散結，改善病變部位的微循環(huán)，使腺體功能恢復，分泌物增加，可明顯改善咽干癥狀；桑葉疏風清熱，利咽止咳，有抗菌消炎的作用，桔梗宣發(fā)肺氣、載藥上行，紫蘇子、紫蘇梗、沉香肅降肺氣，五藥升降同調，共奏清熱利咽，理氣止咳，寬胸潤喉之功［8］。梁永智等應用清喉利咽顆粒治療99例慢性咽炎患者，表明其可直接作用于咽喉病變部位，緩解水腫，減少充血，修復黏膜損傷，進而達到治愈慢性咽炎的目的［9］。

臨床上兩藥常聯合應用，取得了良好的療效，養(yǎng)陰清肺糖漿以滋養(yǎng)肺腎之陰為主，清喉利咽顆粒以清熱解毒、驅邪利咽為要，二者治療角度一內一外，一里一表，二者同用，在調理臟腑的同時，加用理氣祛風之藥，表里互動，標本兼施，具有協同作用，療效自然顯著。

3.3 治療機制 目前普遍認為感染后咳嗽是臨床上常見的疾病，通常引起患者不同程度的刺激性咳嗽，嚴重影響患者生活質量，咳嗽遷延不愈會引起支氣管炎，哮喘等其他疾病。氣道高反應性是咳嗽的主要原因之一，而氣道高反應性是氣道炎癥是基礎，IL-4能調控單核細胞釋放細胞因子，最終增加炎性細胞的浸潤和活化［10］。IL-8是趨化性細胞因子超家族的一員，可趨化和激活中性粒細胞、T淋巴細胞，促使其脫顆粒，產生多種炎性介質，TNF-α是巨噬細胞分泌的肽類炎性介質，可以誘導各種細胞因子的產生，使氣道產生炎性改變，增高氣道反應性［11］。感染后咳嗽的發(fā)病機制尚不明確，有研究認為支氣管肺C纖維興奮，釋放其含有的神經肽，最終導致神經源性炎癥是感染后咳嗽的重要發(fā)病機制［12-15］。本研究中發(fā)現養(yǎng)陰清肺糖漿、清喉利咽顆粒、養(yǎng)陰清肺糖漿聯合清喉利咽顆粒、甘草合劑都能降低肺泡灌洗液中的SP、CGRP、IL-4、IL-8、TNF-α的含量，這說明養(yǎng)陰清肺糖漿、清喉利咽顆粒、養(yǎng)陰清肺糖漿聯合清喉利咽顆粒、甘草合劑不僅能降低氣道炎癥反應從而降低氣道高反應性最終減輕咳嗽，同時能降低神經源性炎癥，減輕咳嗽。降低氣道炎癥反應與降低神經源性炎癥可能是養(yǎng)陰清肺糖漿、清喉利咽顆粒、養(yǎng)陰清肺糖漿聯合清喉利咽顆粒、甘草合劑治療感染后咳嗽的兩大機制。

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The Mechanism Research of the Effect of Qinghou Liyan Granules with Yangyin Qingfei Syrup on Relieving a Cough

LIU Wei，GUO Sijia，HAO Zhenghua，et al.The Second Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjian，China.

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r285.5 文獻標志碼：A

1004-745X（2016）08-1465-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.08.003

國家自然科學基金項目（30672681）；天津市高等學校“中醫(yī)藥防治呼吸病研究創(chuàng)新團隊”資助項目（TD12-5036）

（電子郵箱：szt20042@eyou.com）

2016-04-17）