吲哚胺2，3-雙加氧酶在創(chuàng)傷后應激障礙大鼠海馬中的表達變化與作用*

段發(fā)亮，　王孟陽，　吳京雷，　羅　明，　韋君武，　楊國平，　何主強

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬中西醫(yī)結合醫(yī)院，武漢市第一醫(yī)院神經外科，武漢　430022

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吲哚胺2，3-雙加氧酶在創(chuàng)傷后應激障礙大鼠海馬中的表達變化與作用*

段發(fā)亮，王孟陽，吳京雷，羅明，韋君武，楊國平，何主強△

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬中西醫(yī)結合醫(yī)院，武漢市第一醫(yī)院神經外科，武漢430022

目的通過檢測創(chuàng)傷后應激障礙(post-traumatic stress disorder，PTSD)大鼠海馬中吲哚胺2，3-雙加氧酶(indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO)含量變化與運用IDO抑制劑治療對神經元細胞的保護機制，探討PTSD發(fā)病原因及機制。方法將60只健康雄性Wistar大鼠隨機分為：對照組、PTSD組、PTSD+IDO抑制劑治療組，運用ELISA試劑盒檢測腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)含量變化，通過RT-PCR、Western blot檢測IDO的表達情況。通過TUNEL染色法檢測海馬神經元凋亡率，并對大鼠進行行為學評估。結果檢測結果顯示對照組、PTSD組與IDO抑制劑治療組TNF-α分別為[(1.26±0.12)vs. (8.58±0.67)vs. (3.69±0.41)pg/mL]、IL-6分別為[(2.28±0.19)vs. (15.72±1.42)vs. (7.45±0.58)pg/mL]、IDOmRNA分別為[(0.152 7±0.014 7)vs. (0.827 8±0.079 6)vs. (0.223 6±0.038 7)]、IDO蛋白分別為[(0.061 2±0.008 6)vs. (1.232 9±0.114 8)vs. (0.423 5±0.041 1)]、神經元的凋亡率為[(5.46±1.87)%vs. (81.47±6.86)%vs. (42.54±3.98)%](均P<0.05)，行為學表現明顯改善。結論PTSD大鼠海馬區(qū)域TNF-α、IL-6、IDO表達顯著提高，IDO抑制劑治療能降低其含量，細胞因子、IDO在PTSD發(fā)病機制中起重要作用，運用IDO抑制劑能改善PTSD大鼠海馬區(qū)域神經元損傷。

創(chuàng)傷后應激障礙；腫瘤壞死因子-α；白細胞介素-6；吲哚胺2，3-雙加氧酶

創(chuàng)傷后應激障礙(post-traumatic stress disorder，PTSD)為機體對突發(fā)自然災害、戰(zhàn)爭、嚴重交通意外、恐怖襲擊、外傷、虐待等強烈外界刺激的一種異常精神反應，是應激性精神障礙中最為典型的一種[1-2]。臨床表現具有病程長、治療效果不明顯的特點，近年來PTSD發(fā)病率逐漸升高[3-4]。實驗表明[5]PTSD是在劇烈環(huán)境刺激下，由個體生物易感基因及相關蛋白相互作用所致，PTSD發(fā)病機制目前尚不清楚，強烈的外界刺激可過度激活免疫系統(tǒng)，外周免疫系統(tǒng)通過巨噬細胞釋放前炎性細胞因子(TNF-α、IL-6)觸發(fā)與應激相關神經內分泌、神經生理生化與行為學改變。研究證實[6-8]吲哚胺2，3-雙加氧酶(indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO)為色氨酸-犬尿氨酸代謝路徑上最重要的限速酶，調節(jié)神經遞質5-羥色胺代謝，均主要表達在外周巨噬細胞與中樞小膠質細胞上。本研究主要檢測PTSD大鼠海馬區(qū)域TNF-α、IL-6、IDO含量變化，以及運用IDO抑制劑治療對神經元功能的保護作用及行為學的改善情況，探索細胞因子、IDO在PTSD發(fā)病過程中的相互作用機制，為臨床開發(fā)PTSD新的治療途徑提供依據。

1　材料與方法

1.1動物分組

健康雄性成年Wistar大鼠60只(體重為120～160 g，由華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物學部提供)，首先在實驗室進行適應性飼養(yǎng)7 d，然后隨機分為3組：對照組、PTSD組、IDO抑制劑治療組，采取國際上公認的單次延長應激(single-prolonged stress，SPS)建立PTSD組與IDO抑制劑治療組動物模型。模型建立后給予對照組及PTSD組大鼠鼻飼生理鹽水，IDO抑制劑治療組給予鼻飼二唑基-N-羥基苯甲脒10 mg/(kg·d)，14 d后進行指標檢測，實驗步驟均經過動物倫理學審核，并嚴格遵守美國衛(wèi)生研究所(NIH)頒布的實驗動物標準。

1.2行為學檢測

在行為學實驗室用遮光布隔斷室外光線，室內用4個60 W白熾燈安放于實驗室4角，照射于墻壁上獲得漫反射光源，照度120～280 lx，照度恒定。室溫在21～24℃之間，注意實驗室通風及保持安靜。并配備紅外攝像儀，依次進行曠場實驗(openfield test，OF test)評估大鼠的自發(fā)活動能力，高架十字迷宮實驗(elevated plus mace，EPM)評估大鼠的焦慮水平和水迷宮實驗(Morris water mace，MWW)評估大鼠的空間學習和記憶能力。

1.3RT-PCR測定海馬區(qū)域IDO mRNA含量變化

采用Trizol試劑盒一步法提取海馬組織總RNA，按RT試劑盒逆轉錄獲得cDNA，取25 μL反應體系，上機(Applied Biosystems)行PCR擴增。PCR反應條件為：95℃，2 min變性。之后95℃，15 s退火；58℃，60 s；72℃，30 s進行40個循環(huán)。然后72℃，10 min延伸。Primer Premier 6.0軟件設計IDO引物：IDO上游引物5′-GCGCTGTTGGAA-ATAGCTTC-3′，下游引物5′-CAGGACGTCA-AAGCACTGAA-3′，分子量192 bp；β-actin上游引物5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3′，下游引物5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′，分子量204 bp。對擴增產物進行定量檢測，結果為IDO /β-actin灰度比值。

1.4Western blot測定海馬區(qū)域IDO蛋白含量變化

將海馬組織置入研磨器中，加入裂解液，常規(guī)提取總蛋白，按BCA試劑盒說明書測定蛋白濃度。然后制10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)膠，電泳，轉膜，以小牛血清白蛋白室溫封閉2 h，加入一抗稀釋液(1∶500)，然后在40℃條件下孵育過夜。用二抗稀釋液(羊抗鼠二抗1∶200)，常溫孵育1 h。用ECL顯影液進行顯色，凝膠成像系統(tǒng)進行膠片的曝光、成像。IDO分子量為42 kD。檢測結果為IDO /β-actin灰度比值。

1.5檢測大鼠海馬區(qū)域神經元細胞凋亡率

消毒后開顱取腦，分離海馬組織，石蠟包埋切片。根據TUNEL試劑盒操作說明書進行染色，運用HMIAS-2000系統(tǒng)對每組大鼠海馬切片進行TUNEL染色后計數凋亡神經細胞，隨機選取非重疊的5個高倍鏡視野進行計數，取其均值，凋亡率=凋亡細胞數/神經元細胞總數× 100%。

1.6大鼠海馬區(qū)IL-6，TNF-α含量檢測

采用夾心酶聯(lián)免疫吸附檢測法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，對海馬組織標本按試劑盒上的操作步驟進行檢測。

1.7統(tǒng)計學處理

2　結果

2.1各組大鼠行為學評估結果

曠場行為(水平活動距離、中央停留時間)是評定實驗動物的警覺水平、焦慮狀態(tài)和環(huán)境適應能力的方法。高架十字迷宮(開臂進入次數的百分比、開臂停留時間百分比)是運用大鼠對未知環(huán)境的探究性，及對高懸開臂的恐懼感形成的矛盾沖突狀態(tài)來評測實驗動物焦慮素質特征。Morris水迷宮實驗(上臺潛伏期)通過檢測動物空間學習及記憶能力，評定動物空間認知功能加工過程，了解應激刺激對動物認知功能的影響。實驗結果表明：與對照組相比，PTSD組大鼠水平活動距離(8 775.84±38.67)mm、中央停留時間(22.65± 1.54)s明顯減少，開臂進入次數的百分比(21.49±2.98)%、開臂停留時間百分比(10.55±1.96)%明顯降低以及上臺潛伏期(56.38 ±4.21)s明顯延長(均P<0.05)；與PTSD組相比，IDO抑制劑治療組大鼠水平活動距離(5 668.45±28.79)mm、中央停留時間(30.78±3.20)s明顯增加，開臂進入次數的百分比(29.87±4.02)%、開臂停留時間百分比(13.89±2.75)%顯著提高以及上臺潛伏期(49.27±2.78)s縮短，均P<0.05。

2.2各組大鼠海馬區(qū)中IDO mRNA含量的變化

對照組大鼠海馬區(qū)域IDO mRNA轉錄水平較低，PTSD組IDO mRNA轉錄水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。PTSD組大鼠給予IDO抑制劑治療后，IDO轉錄水平降低，與PTSD組間相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1，表1。

M：Marker；1：對照組；2：PTSD組；3：PTSD+IDO抑制劑治療組；4：對照組內參；5：PTSD組內參；6：PTSD+IDO抑制劑治療組內參圖1　RT-PCR檢測IDO mRNA表達Fig.1 RT-PCR for the detection of the expression of IDO mRNA

2.3各組大鼠海馬區(qū)中IDO蛋白含量的變化

對照組海馬組織中IDO在蛋白水平表達較低，PTSD組大鼠海馬組織中IDO蛋白含量顯著升高(均P<0.05)。而IDO抑制劑治療組，IDO蛋白含量減少，與PTSD組之間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2，表1。

1：對照組；2：PTSD組；3：PTSD+IDO抑制劑治療組圖2　Western blot檢測大鼠海馬組織中IDO蛋白表達Fig.2 Western blot analysis of the expression of IDO protein in the hippocampus of rats

2.4各組大鼠海馬區(qū)神經元細胞凋亡情況

對照組海馬區(qū)僅可見少量TUNEL染色陽性細胞，PTSD組海馬區(qū)可見較多TUNEL染色陽性細胞。IDO抑制劑治療組海馬區(qū)TUNEL染色陽性細胞較PTSD組顯著降低，統(tǒng)計數據表明，IDO抑制劑治療組、PTSD組與對照組3組間比較，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)(圖3，表1)。

A：對照組;B：PTSD組;C：IDO抑制劑治療組圖3　大鼠海馬區(qū)神經元細胞凋亡情況比較(TUNEL染色，×400)Fig.3 Comparison of the neuron apoptosis in rat hippocampus(TUNEL staining，×400)

2.5各組大鼠海馬區(qū)炎性因子TNF-α和IL-6表達情況

大鼠海馬區(qū)域炎性因子水平檢測數據表明，PTSD組大鼠海馬組織TNF-α、IL-6較對照組顯著提高，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)；IDO抑制劑治療組比對照組升高(均P<0.05)，但與PTSD組比較明顯降低(均P<0.05)，各組間差異均有統(tǒng)計學意義(表1)。

表1　各組間細胞因子、IDO含量及凋亡率比較

與對照組比較，*P<0.05；與PTSD組比較，△P<0.05

3　討論

雖然PTSD病因尚未明確，但IDO被認為是PTSD多種病理機制假說中的共同調節(jié)因子，在PTSD的發(fā)病中具有重要作用。下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸、神經遞質(如5-羥色胺，5-HT)主要參與機體對應激反應、情緒及覺醒的維持。過度的機體應激使HPA軸興奮，促使細胞因子異常分泌。而跨膜蛋白可將前炎性因子(如：TNF-α、IL-6)通過主動轉運到腦組織，觸發(fā)中樞神經系統(tǒng)后續(xù)的免疫應答。PTSD病變基礎主要為炎性因子及壓力相關蛋白的異常表達，神經遞質下降及行為學改變[9]。本研究中PTSD鼠中樞TNF-α、IL-6含量升高，而應用IDO抑制劑后TNF-α、IL-6表達下降，表明IDO與細胞因子可相互調節(jié)，應激可激活機體免疫系統(tǒng)失衡，分泌過量的炎性細胞因子及上調壓力相關性蛋白表達，引起PTSD行為學改變。

實驗證明[10-11]在抑郁癥患者中有COX-2的表達異常，強烈的應激刺激可激活免疫系統(tǒng)釋放前炎性細胞因子，過量的炎性細胞因子引發(fā)顱內繼發(fā)性損傷，PTSD主要病理學改變?yōu)?-HT神經遞質含量下降，在多種急慢性神經退行性疾病中均有IDO的異常表達，它是調節(jié)腦內神經遞質的最終限速酶。目前PTSD患者的藥物治療手段仍十分有限，通過美國食品藥品管理局(FDA)批準的只有5-羥色胺重攝取抑制劑帕羅西汀及舍曲林，但治療效果并不理想。本研究通過SPS法建立PTSD模型測得大鼠海馬區(qū)IDO含量明顯升高，運用IDO抑制劑治療后大鼠焦慮癥狀得到明顯改善，與正常對照組相比差異有統(tǒng)計學意義，提示PTSD大鼠的焦慮情緒反應可以通過二唑基-N-羥基苯甲脒的治療而得到緩解。同時也證明IDO的表達升高主要參與了創(chuàng)傷后應激障礙的發(fā)病過程，且可以作為藥物治療創(chuàng)傷后應激障礙的潛在靶點。IDO蛋白的表達與機體內發(fā)生的炎癥反應密切相關，研究也證實促炎性因子的升高伴有IDO含量的增加，進而引起PGE2、NO及氧化應激產物的表達上調[12-13]。氧化應激在細胞凋亡中的機制已被證實，IDO通過正反饋機制使細胞因子進一步升高，以上均加重了神經元細胞的不可逆損傷。

綜上所述，細胞因子、IDO可能在PTSD發(fā)病機制中扮演重要的角色。本實驗表明應激狀態(tài)下TNF-α、IL-6、IDO在PTSD大鼠海馬區(qū)域表達明顯升高，這與PTSD的病理改變及影像學檢測顯示的腦結構和功能異常的腦區(qū)非常一致[14-15]。PTSD大鼠海馬區(qū)的炎性因子增加和IDO表達上調共同參與了中樞神經損傷。早期給予選擇性IDO抑制劑(新型二唑基-N-羥基苯甲脒)可降低海馬區(qū)細胞因子、IDO水平，提高中樞神經系統(tǒng)神經遞質5-HT含量，改善行為學變化。這對PTSD臨床早期干預和開發(fā)新的治療手段具有重要意義。我們認為可以把二唑基-N-羥基苯甲脒作為PTSD新的治療手段進一步研究與開發(fā)。

[1]殷莉，黃姍姍，何主強.吲哚胺2，3-雙加氧酶及細胞因子在創(chuàng)傷后應激障礙患者中的表達變化及意義[J].華中科技大學學報：醫(yī)學版，2016，45(1)：108-110.

[2]Josh M C，Keith B G，Andrew J，et al.Decoding the traumatic memory among women with PTSD：Implications for neurocircuitry models of PTSD and real-time fMRI neurofeedback[J].PLoS One，2015，10(4)：1-17.

[3]Pietrzak R H，Goldstein R B，Southwick S M，et al.Psychiatric comorbidity of full and partial post-traumatic stress disorder among older adults in the United States：results from wave 2 of the National Epidemiologic Survey on Alcohol and Related Conditions[J].Am J Geriatr Psychiatry，2012，20(5)：380-390.

[4]Cohen H，Kaplan Z，Koresh O，et al.Early post-stressor intervention with propranolol is ineffective in preventing post-traumatic stress responses in an animal model for PTSD[J].Eur Neuropsychopharmacol，2011，21(3)：230-240.

[5]Thomas C，Eric E，Rachel Y.Biomarkers for combat-related PTSD：focus on molecular networks from high-dimensional data[J].Eur J Psychotraumatol，2014，5(7)：1-3.

[6]Moeller D R，Duffy J M，Goolsby A M，et al.Use of a removable mandibular neuroprosthesis for the reduction of post-traumatic stress disorder(PTSD)and mild traumatic brain injury/PTSD/associated nightmares，headaches，and sleep disturbances[J].Spec Oper Med，2014，14(3)：64-73.

[7]Koek R J，Langevin J P，Krahl S E，et al.Deep brain stimulation of the basolateral amygdala for treatment-refractory combat post-traumatic stress disorder(PTSD)：study protocol for a pilot randomized controlled trial with blinded，staggered onset of stimulation[J].Trials，2014，15(5)：356-358.

[8]Kousha M，Mehdizadeh T S.Normative life events and PTSD in children：how easy stress can affect children’s brain[J].Acta Med Iran，2013，51(1)：47-51.

[9]Richard R.A molecular clue to PTSD[J].PloS Biology，2015，13(2)：1-2.

[10]Gao H M，Liu B，Zhang W et al.Novel anti-inflamatory therapy for Parkinson's disease[J].Trends Pharmacol Sci，2003，24(6)：395-401.

[11]Hinz B，Brune K.Paracetamol and cyclooxygenase inhibition：is there a cause for concern?[J].Ann Rheum Dis，2012，71(1)：20-25.

[12]Said R S，Badr A M，Nada A S，et al.Sodium selenite treatment restores long-lasting ovarian damage induced by irradiation in rats：impact on oxidative stress and apoptosis[J].Reprod Toxicol，2014，43(5)：85-93.

[13]Nury T，Zarrouk A，Vejux A，et al.Induction of oxiapoptophagy，a mixed mode of cell death associated with oxidative stress，apoptosis and autophagy，on 7-ketocholesterol-treated 158N murine oligodendrocytes：impairment by α-tocopherol[J].Biochem Biophys Res Commun，2014，446(3)：714-719.

[14]張建芳，陳欣，王偉，等.異氟烷通過激活Calpain影響大鼠海馬神經干細胞的增殖與分化[J].華中科技大學學報：醫(yī)學版，2015，44(3)：263-267.

[15]Puetz T W，Youngstedt S D，Herring M P.Effects of pharmacotherapy on combat-related PTSD，anxiety，and depression：a systematic review and meta-regression analysis[J].PloS One，2015，10(5)：529-532.

(2016-02-25收稿)

Changes of the Expression of Indoleamine 2，3-dioxygenase in the Hippocampus of Rats with Post-traumatic Stress Disorder

Duan Faliang，Wang Mengyang，Wu Jingleietal

DepartmentofNeurosurgery，WuhanFirstHospital，AffiliatedTCM-integratedHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430022，China

ObjectiveTo examine the changes of the expression of indoleamine 2，3-dioxygenase(IDO)in the hippocampus of rats with post-traumatic stress disorder(PTSD)and the protective effect of the IDO inhibitor on neurons，in an attempt to explore the pathogenesis of PTSD.MethodsAdult male Wistar rats were randomly divided into three groups：control group，PTSD group，and PTSD+IDO inhibitor group(n=20 each).The levels of tumor necrosis factor-α(TNF-α)and interleukin-6(IL-6)were detected by ELISA and the expression of IDO by RT-PCR and Western blotting.TUNEL staining was used to observe the apoptosis of rat hippocampal neurons.Rat behaviors were also evaluated.ResultsThe levels of TNF-α were(1.26±0.12)，(8.58±0.67)，and (3.69±0.41)pg/mL in control，PTSD and PTSD+IDO groups，respectively(P<0.05).The levels of IL-6 were(2.28±0.19)，(15.72±1.42) and (7.45±0.58)pg/mL in control，PTSD and PTSD+IDO groups，respectively(P<0.05).The expression of IDO was(0.1527±0.0147)，(0.8278±0.0796) and (0.2236±0.0387)at mRNA level and(0.0612±0.0086)，(1.2329±0.1148)，(0.4235±0.0411)at protein level in control，PTSD and PTSD+IDO groups，respectively(P<0.05).The apoptosis rates were(5.46±1.87)%，(81.47±6.86)% and (42.54±3.98)% in control，PTSD and PTSD+IDO groups，respectively(P<0.05).Rat behavioral function was significantly improved in PTSD+IDO group.ConclusionThe expression levels of TNF-α，IL-6 and IDO were significantly increased in the hippocampus of PTSD rats，which could be reversed by the IDO inhibitor.The IDO inhibitor could improve the neuron injuries in the hippocampus of PTSD rats.

post-traumatic stress disorder；tumor necrosis factor-α；interleukin-6；indoleamine 2，3-dioxygenase

，Corresponding author，E-mail：colei@sina.com

R329.2

10.3870/j.issn.1672-0741.2016.04.006

*湖北省自然科學基金資助項目(No.2015CFB694)，武漢市衛(wèi)生計生委科研項目(No.WZ16C10)

段發(fā)亮，男，1973年生，副主任醫(yī)師，醫(yī)學博士，E-mail：Duanfaliang@126.com